專利名稱：約氏乳桿菌在提高肉仔雞生產性能中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種約氏乳桿菌菌株CGMCC No. 4926在提高肉仔雞生產性能中的應用。
背景技術：
約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)屬于厚壁菌門(Firmicutes)芽抱桿菌綱(Bacilli)乳桿菌目(Lactobacillales)乳桿菌科(Lactobacillaceae)乳桿菌屬(Lactobacillus), 1980年首次被分離，然而在分類學上一直將其劃分為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。1992年Fujisawa等通過生化實驗和DNA雜交實驗將其定名為約氏乳桿菌。約氏乳桿菌主要存在于動物和人的消化道中，且為優勢菌群。歐盟食品安全局(EFSA)會分別于2009年和2011年三次發布了針對約氏乳桿菌的 健康申明，申明指出約氏乳桿菌具有減少腸道內病原菌的微生物，增強天然防御和免疫系統和保持皮膚健康。并且歐盟對約氏乳桿菌進行了安全資格認定(qualified presumptionof safety，QPS)批準其在飼料和食品中使用。綜合目前關于約氏乳桿菌的文獻報道，其對動物的益生功能主要體現在以下幾方面1.約氏乳桿菌對動物天然防御系統及免疫機能具有調節作用，其具體調控位點，如TGFi3，TLR9，NF-K B, IgA，往往是動物機體免疫應答反應的起始受體，因此其預防動物疾病的作用機理可能是在特定時期刺激動物免疫系統，早期激活下游免疫應答進而防止疾病發生；2.約氏乳桿菌表現出對動物皮炎的特異性預防作用。3.約氏乳桿菌對病原菌的排他性競爭作用。約氏乳桿菌對一些病原菌如沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在腸道上皮細胞上的定殖產生空間位阻，可防止病原菌對腸道上皮細胞的侵染，減少疾病發生。2010年我國衛生部辦公廳將約氏乳桿菌收錄到《可用于食品的菌種名單》中，批準其作為具有益生功能的食品添加劑使用。目前在國內尚未見有將約氏乳桿菌作為添加劑添加食品和飼料添加劑的產品面世，其在動物畜禽養殖上的應用也鮮見報道，將約氏乳桿菌開發成動物微生態飼料添加劑，為填補國內空白，篩選益生性能優良的約氏乳桿菌，對促進我國畜禽養殖水平，保證我國的糧食安全意義重大，可在畜禽養殖中發揮更大作用。

發明內容
為了解決上述問題，本發明提供約氏乳桿菌CGMCC No. 4926在提高肉仔雞生產性能中的應用。本發明的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii),是通過體外耐酸和耐膽鹽篩選得到的一株均有潛在益生功能的約氏乳桿菌，命名為約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii) YS-12，并于2011年6月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物保藏中心進行了保藏，保藏號為CGMCC No. 4926。其中，所述的約氏乳桿菌YS-12的篩選過程如下( I)收集菌種
截取健康豬結腸后半段，用生理鹽水沖洗三次，用牙簽多次掛取腸道上皮上的附著物，放入IOmL的生理鹽水中，作為樣品原液，對原液進行10倍梯度稀釋。(2)菌種培養將每個稀釋度，取100微升涂布于MRS平板上，37°C倒置培養24小時。(3)菌種鑒定挑取平板上的單菌落進行對其16S rRNA進行菌落PCR鑒定，通過在數據庫中進行序列比對，發現其16S序列(GenBank登錄號HQ641209),進一步通過理化實驗證實其為約氏乳桿菌。
—實驗項目結果實驗項目結果
量M I洗在Fta碳水化合物產酸
革蘭氏染色陽性
(續)
細胞形狀桿狀半乳糖+
形成芽孢-葡萄糖+
接觸酶-葡萄糖酸鈉-
氧化酶-乳糖-
空氣中生長+麥芽糖+
45°C生長+甘露醇-15°C生長—甘露糖—
6.5NaCl%生長-松三糖-
pH9.6生長-蜜二糖+
pH4.5生長+棉籽糖+
葡萄糖酸鈉產氣-鼠李糖-
碳水化合物產酸核糖-
苦杏仁苷+水楊苷+
阿拉伯糖-山梨醇-
纖維二塘+蔗糖+
七葉靈+海藻糖+
_M_+__^_;_(4)菌種篩選I)將菌體重懸于PBS液后，梯度稀釋至10_2，用移液器吸取10_2稀釋液100微升分別加入900微升O. 3%的膽鹽溶液和PBS (對照)中，37°C保溫3小時。2)將菌體重懸于PBS液后，梯度稀釋至10_2，用移液器吸取10_2稀釋液100微升分別加入900微升pH3. O的緩沖液和PBS (對照)中，37°C保溫3小時。3)將酸處理過的菌液繼續稀釋至10_5，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—5三個稀釋度(對照組稀釋至10_6，取ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ—6)各O. Iml涂布MRS平板，37°C倒置培養48小時。挑取耐受性菌株進行反復篩選，得到耐酸和耐膽鹽性能優良的約氏乳桿菌。(5)菌種保藏將篩選得到的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)YS-12保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，獲得保藏號為CGMCC No. 4926。將約氏乳桿菌CGMCC No. 4926單獨或制備成制劑添加到肉仔雞的基礎日糧中，飼喂后可顯著降低肉仔雞料肉比。在本發明的一個實施方案中，在肉仔雞的基礎日糧中添加所述的約氏乳桿菌制齊U，使所述的約氏乳桿菌在每克基礎日糧中的含量達到I. OX IO7^lO8Cfu,優選每克基礎日糧中的含量達到I. OX IO8Cfu，顯著提高生產性能，提高飼料轉化率，從而降低料肉比。在一個優選的實施方案中，所述的約氏乳桿菌制劑可為本領域常規制劑，優選為約氏乳桿菌凍干劑。其中，所述約氏乳桿菌凍干劑還可含有凍干保護劑，優選的凍干保護劑為質量比為2:2:4:1:2的脫脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸鈉和甘油。 其中，所述約氏乳桿菌凍干劑的制備方法如下I)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCC No. 4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于IOmL深層MRS液體試管，37°C培養10小時后，以1%接種量轉接于250mL MRS液體培養基，培養8 10小時后作為種子液；2)以5% 10%的接種量將步驟I)所得的種子液接種于5L的發酵罐中培養；3)發酵過程中維持發酵液pH值為6. O 6. 5，當pH超過設定值時，補加料液；當PH低于設定值時，自動流加堿性中和劑氨水、KOH、NaOH中的任一種；在溫度37 39°C、轉速IOOrpm條件下發酵10 14小時,發酵過程不通氣或通入N2,維持溶氧小于1% ；4)當補加料液pH不再降低或發酵液在600nm波長下的吸光值(即0D600)不再增加時，終止發酵，即得約氏乳桿菌活菌數達10ncfU/ml以上的發酵液；5) 4000-8000轉/分鐘離心5_10分鐘，得到約氏乳桿菌菌泥；6)得到的產物按照菌泥(g):保護劑(mL)質量體積比1:5加入凍干保護劑，進行真空冷凍干燥，得到約氏乳桿菌凍干劑。本發明的約氏乳桿菌CGMCC No. 4926以適當的劑量適當的劑量添加飼料中對提高肉仔雞生產性能，降低料蛋比方面有顯著的作用。其中，尤以在基礎日糧中添加I. OX IO7和I. 0X108cfu/g的約氏乳桿菌CGMCC No. 4926效果最為顯著。本發明中的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii) YS-12保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)保藏，保藏日期為2011年6月8日，保藏號為CGMCC No. 4926。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例I約氏乳桿菌CGMCC No. 4926凍干劑的制備I)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCC No. 4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于IOmL深層MRS液體試管，37°C培養10小時后，以1%接種量轉接于250mL MRS液體培養基，培養10小時后作為種子液；2)以5%的接種量將步驟I)所得的種子液接種于5L的發酵罐中培養；3)發酵過程中維持發酵液pH值為6. O,當pH超過設定值時，補加料液；當pH低于設定值時，自動流加堿性中和劑氨水；在溫度37°C、轉速IOOrpm條件下發酵14小時，發酵過程通入N2,維持溶氧小于1% ；4)當補加料液pH不再降低或發酵液在600nm波長下的吸光值(即0D600)不再增加時，終止發酵，即得約氏乳桿菌活菌數達10ncfU/ml以上的發酵液；5) 8000轉/分鐘離心10分鐘，得到約氏乳桿菌菌泥；6)得到的產物按照菌泥(g):保護劑(mL)質量體積比1:5加入質量比為2:2:4:1:2的脫脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸鈉和甘油，進行真空冷凍干燥，得到約氏乳桿菌凍干劑，其中，約氏乳桿菌的活菌數可達3.7X10ncfU/g。實施例2( I)實驗動物及實驗設計將540只I日齡雄性健康AA肉仔雞隨機分成6個處理組，每個處理組6個重復，每個重復15只雞。第I組為空白對照組，飼喂基礎日糧 ’第2-6組為約氏乳桿菌菌粉試驗組，飼料中約氏乳桿菌菌粉添加量分別為I. OX IO4U. OX IO5U. OX IO6U. OX IO7,1.0X108cfu/g，試驗周期為7周。基礎日糧配方見表I。參照NRC (1994)配制。表I基礎日糧配方和營養成分

權利要求
1.約氏乳桿菌CGMCCNo. 4926在提高肉仔雞生產性能中的應用。
2.根據權利要求I所述的應用，其特征在于，在肉仔雞的基礎日糧中添加所述的約氏乳桿菌制劑，使所述的約氏乳桿菌在每克基礎日糧中的含量達到I. 0Xl(Tl08cfu。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，在肉仔雞的基礎日糧中添加所述的約氏乳桿菌制劑，使所述的約氏乳桿菌在每克基礎日糧中的含量達到1.0X108cfu。
4.如權利要求廣3任一項所述的應用，其特征在于，所述的約氏乳桿菌制劑為約氏乳桿菌凍干劑。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述約氏乳桿菌凍干劑的凍干保護劑為質量比為2:2:4:1:2的脫脂乳、海藻糖、可溶性淀粉、谷氨酸鈉和甘油。
全文摘要
本發明公開了約氏乳桿菌CGMCC No.4926在提高肉仔雞生產性能中的應用。將所述的約氏乳桿菌以1.0×107~108cfu/g的劑量添加到飼料中，對提高飼料轉化率，降低肉仔雞料肉比方面有顯著的作用。
文檔編號A23K1/18GK102805269SQ20121030503
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月24日 優先權日2012年8月24日
發明者張軍, 汪攀, 孫曉雯, 閆軼潔, 王安如 申請人:鄭州市大北農飼料科技有限公司, 北京大北農科技集團股份有限公司