一種希氏乳桿菌及其在黃酒釀造中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種希氏乳桿菌，該菌株為希氏乳桿菌Lactobacillus?hilgardii，系從廢米漿水中篩選得到，該菌株于2013年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.8098。該菌株經活化和高密度培養后，可制備成直投式發酵劑。本發明得到的希氏乳桿菌及其直投式發酵劑可用于黃酒的釀造，使生產過程可控，受季節性影響小，操作簡單、方便，對于黃酒釀造工藝的革新具有重要意義。
【專利說明】一種希氏乳桿菌及其在黃酒釀造中的應用
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種乳桿菌及其在黃酒釀造中的應用，特別是一種希氏乳桿菌及其在黃酒釀造中的應用。
【背景技術】[0002]黃酒主要是以谷物(南方主要是以糯米，北方是黍米和玉米)為原料，以麥曲為糖化劑，以黃酒酵母或活性干酵母為發酵劑，經浸米、蒸煮、糖化、發酵、壓榨、過濾、煎酒、貯存、勾兌而成的一種低酒度的發酵原酒。按照生產工藝可以分為傳統黃酒和機械化黃酒生產工藝，而傳統黃酒工藝的特色在于“冬漿冬水”和“長時間浸米”。
[0003]將浸米漿水加入到黃酒發酵醪中釀制黃酒是傳統黃酒工藝的特色，但是長時間的浸米工藝卻給黃酒生產帶來了不少了難題。一方面，傳統黃酒的浸米需要占用大量的浸米場地和浸米容器，并且浸米主要是在露天環境下進行的，這樣在浸米過程會網羅空氣中的所有微生物，在經過長時間的浸米后，浸米水的表面會呈現白膜，主要有霉菌、野生酵母菌和醋酸菌等多種細菌；此種方式導致浸米漿水中既存在有利的微生物，也存在有害的微生物，所以浸米漿水的好壞直接決定了黃酒發酵的成敗，這也是導致傳統黃酒發酵不易控制，黃酒品質不穩定的主要原因。另一方面，經過長時間浸米后，原料米表面的糊粉層會進入到米漿水中，并隨米漿水進入發酵醪中，糊粉層中的蛋白質會在麥曲混合酶及其他酶系的作用下產生大量的氨基酸，而大量的氨基酸會使黃酒的口感粗糙，甚至影響風味，在追求黃酒“淡、干、爽”的趨勢下，這一弊端會更加突出，所以胡普信提出應該降低浸米漿水的使用量，尤其是應該摒棄對陳米浸米漿水的使用。第三，長時間的浸米會產生大量的含有高濃度B0D5、CODCr的浸米漿水，據統計，生產I噸黃酒，將產生2噸浸米漿水，一個年產5萬噸的黃酒企業，至少產生10萬噸的米漿廢水。而這些浸米漿水只有部分能被利用，其余的將作為污水排出，排出的廢水會嚴重的污染水資源，導致魚類大量死亡，還可能導致水的富營養化。據測定，紹興某年產5萬噸的黃酒廠生產過程中浸米漿水的B0D5達到25000mg/L，CODCr達到60000mg/L，屬于高濃度的有機廢水，不符合排放標準。若將這些浸米漿水進行處理，又會產生巨大的費用:每年對浸米漿水的處理費用高達22.5萬元；處理設施投入需要200多萬元；設備折舊加上運行費用，每年要支出40多萬元。
[0004]所以，針對傳統黃酒浸米漿水存在的上述問題，有必要通過一定的方式摒棄對傳統黃酒浸米漿水的使用，但是目前無法解決在摒棄使用浸米漿水后能保證黃酒發酵順利進行的問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的就是針對現有技術的不足，提供一種能夠用于黃酒釀造的乳酸桿菌菌株。為實驗上述內容，本發明提供該菌株的菌株保藏信息如下:分類學命名為希氏乳桿菌Lactobacillus higardii,于2013年9月3日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8098，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0006]本菌株采集自浙江紹興某黃酒釀造企業排放的米漿水。將采集的進行梯度稀ffdo'io'io'io'io'io'io—7)對樣品進行稀釋，用無菌移液槍各取0.2mL不同濃度的稀釋液，均勻涂布在固態番茄汁碳酸鈣培養基、改進M17培養基和MRS培養基上，在30°C的恒溫培養箱中倒置培養2-3d。固態番茄汁碳酸鈣培養基:牛肉膏10g，酵母膏10g，蛋白胨IOg,葡萄糖5g,吐溫800.5g,番爺汁200g,碳酸?丐20g,瓊脂20g,蒸懼水IOOOmL,PH6.5-6.8，115°C滅菌20min ;改進M17培養基:植物蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，牛肉提取物5g，乳糖3g，抗壞血酸0.5g，K2HP045g,甘油1%，MgSO4.7H200.25g，磷酸甘油二鈉 1.9g，瓊脂 20g，蒸餾水 IOOOmL,溴甲酚紫 0.04g, ρΗ6.8-7.0，12--滅菌 15min ；MRS固態培養基:蛋白胨10g，瓊脂1.5%-2.0%，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二銨2g，K2HP042g，MgSO4.7H200.lg, MnSO4.H2O0.05g,葡萄糖 20g,無水乙酸鈉 5g,吐溫 801.0mL,蒸懼水IOOOmL, ρΗ6.2-6.4，115°C滅菌 20min。
[0007]本發明提供的菌株接觸酶實驗呈陰性、革蘭氏染色呈陽性，不產生吲哚，不還原硝酸鹽，能利用葡萄糖、半乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖。該菌株在顯微鏡下觀察，從圖1和圖2可以看出，菌株的菌落為圓形、乳白色、邊緣光滑、透明。經革蘭氏染色后鏡檢觀察:菌株HJ122為長桿狀，成對出現，有時呈鏈狀。
[0008]本發明菌株希氏乳桿菌Lactobacillus higardii采用MRS固態培養基進行活化。
[0009]本發明還提供了一種應用上述希氏乳桿菌Lactobacillus higardii釀造黃酒的方法。在實驗室條件下將希氏乳桿菌Lactobacillus higardii活化培養與擴大培養,然后，在不改變其它傳統黃酒工藝的前提下(前發酵溫度30°C，時間5-7d ;后發酵溫度20°C，時間23-25d)，將擴大培養的菌液接種到黃酒發酵醪液中。本發明不僅能夠減少黃酒傳統釀造工藝中的浸米工藝以及減少釀造過程中米漿水的排放量，并且較好地保持了黃酒的風味品質，與傳統工藝黃酒品質差別不大。希氏乳桿菌Lactobacillus higardii應用于黃酒釀造可以采用直接接種的方法，這種方法實現了乳酸菌釀造黃酒工藝的可控性，操作簡單、投入小。
[0010]本發明提供的希氏乳桿菌Lactobacillus higardii可進一步制備成直投式發酵劑。具體如下:利用自動發酵罐對希氏乳桿菌Lactobacillus higardii進行高密度培養，發酵罐各部分經過滅菌后，設置培養溫度30°C、pH6.1-6.2及轉速100r/mim，加入培養基并接入菌種，進行發酵13-14小時，然后經濃縮，冷凍干燥制成直投式發酵劑。
[0011]與現有技術相比，本發明的有益效果是:(1)提供了新的乳酸桿菌屬菌株:希氏乳桿菌Lactobacillus higardii ； (2)從廢米衆水中篩選到希氏乳桿菌Lactobacillushigardii,不會對人體、生態環境造成損害,符合安全規定；(3)希氏乳桿菌Lactobacillushigardii可用于黃酒釀造；(4)希氏乳桿菌Lactobacillus higardii釀造黃酒,生產過程可控，受季節性影響小，操作簡單、方便；(5)通過本技術的實施，節省了傳統釀造工藝的浸米工藝，減少了浸米水的使用，降低了污水處理成本和設備配套。[0012]應用本發明提供的希氏乳桿菌發酵24小時后發酵液pH可降低至4.7，收集發酵液，經HPLC檢測發酵液中的乳酸含量達到14g/L。
【專利附圖】

【附圖說明】[0013]圖1為希氏乳桿菌Lactobacillus hilgardii在M17培養基培養基上的菌落特征
[0014]圖2為希氏乳桿菌Lactobacillus hilgardii的菌體形態
【具體實施方式】
[0015]實施例1培養基及菌液的制備
[0016](一)培養基的制備
[0017]MRS固態培養基:蛋白胨10g，瓊脂1.5%-2.0%，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二銨2g, K2HP042g, MgSO4 *7H200.lg，MnSO4.H2O0.05g，葡萄糖 20g，無水乙酸鈉 5g，吐溫 801.0mL,蒸餾水 IOOOmL, pH6.2-6.4，115°C滅菌 20min。
[0018]液體擴大培養基:蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸二銨2g，K2HP042g,MgSO4 ? 7H200.lg, MnSO4 ? H2O0.05g,葡萄糖 25g,無水乙酸鈉 5g,吐溫 801.0mL,蒸懼水IOOOmL, pH6.2-6.4，115°C滅菌 20min。
[0019](二)菌液的制備
[0020]將希氏乳桿菌Lactobacillus higardii接種至活化培養基中活化48h,待用；利用自動發酵罐對希氏乳桿菌Lactobacillus higardii進行高密度培養,發酵罐各部分經過滅菌后，設置培養溫度30°C、pH6.1-6.2及轉速100r/mim，加入培養基并接入菌種，進行發酵13-14小時，然后經25000g離心30min冷凍離心制備高密度菌液。
[0021]實施例2直投式發酵劑的制備
[0022]在每一凍干瓶中吸ImL滅菌的10%脫脂乳作為懸浮基質，凍干保護劑為:脫脂奶粉10%，甘油 30mL ? L—1，麥芽糊精 IOOg ? L—1，海藻糖 250g ? L-1，L-谷氨酸鈉 30g ? L-1 ;115°C高壓蒸汽滅菌15min ;取ImL菌體細胞移入凍干瓶中，充分混勻制成菌懸液；然后將制備好的菌懸液置于_76°C超低溫冰箱預凍120-150min ;預凍后，迅速轉移至真空凍干機樣品架，凍干12h,得到凍干希氏乳桿菌(Lactobacillus higardii)粉。
[0023]實施例3
[0024]將凍干直投式發酵劑接種黃酒發酵醪中發酵。干粉投入的量根據存活菌數計數結果，使起始濃度與液體發酵劑按0.1%-2%的接種量接入發酵醪中起始濃度相同，然后按黃酒發酵工藝進行發酵(前發酵溫度30°C，時間5-7d ;后發酵溫度20°C，時間23-25d)，最后對黃酒的各項理化指標進行檢測。
[0025]成品黃酒檢測理化指標:
[0026]氨基酸態氮≥0.6g/L 糖(以葡萄糖計)18-45g/L
[0027]總氨基酸≥14mg/mL總酸(以乳酸計)≤(5.0g/L
[0028]酒精度(2(TC)≥ 12%vol pH 值 3.5-4.5
[0029]非糖固形物≥13g/L
[0030]可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬于本發明所附的權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種希氏乳桿菌(Lactobacillus higardii),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.8098，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
2.權利要求1所述希氏乳桿菌在制備直投式發酵劑中的應用。
3.權利要求1所述希氏乳桿菌在黃酒釀造中的應用。
4.權利要求3所述的方法，其特征在于:是將活化和擴大培養后的希氏乳桿菌Lactobacillus higardii 應用于黃酒釀造。
5.權利要求4所述方法，其特征在于所述希氏乳桿菌液體活化用培養基為:蛋白胨IOg ;牛肉膏 IOg ;酵母膏 5g ;檸檬酸二銨 2g ；K2HP042g ；MgS04 ? 7H200.1g ；MnS04 ? H2O0.05g ；葡萄糖20g ;無水乙酸鈉5g ;吐溫801.0mL ;蒸懼水IOOOmL ；pH6.2-6.4,115°C滅菌20min。
6.權利要求4所述方法，其特征在于所述希氏乳桿菌擴大發酵用液體培養基為:蛋白胨 5g ;牛肉膏 IOg ;酵母膏 5g ;檸檬酸二銨 2g ；K2HP042g ；MgS04 WH2O0.1g ；MnS04 -H2O0.05g ；葡萄糖25g ;無水乙酸鈉5g ;吐溫801.0mL ;蒸懼水IOOOmL ；pH6.2-6.4,115°C滅菌20min。
7.根據權利要求4-6 任一所述的方法，其特征在于所述希氏乳桿菌接種量為1%-2%。
【文檔編號】C12N1/20GK103451134SQ201310407725
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月6日 優先權日:2013年9月6日
【發明者】毛健, 孟祥勇, 姬中偉, 劉云雅 申請人:江南大學