Snp檢測篩選雞的絲羽性狀的方法
【專利摘要】本發明公開了SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，包括如下步驟：1）提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；2）對PCR擴增產物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態性檢測。本發明提供了一個高效準確、簡便快速的雞育種輔助選擇分子遺傳標記，為雞的絲羽性狀的選種和保種提供了一種有效的分子標記育種手段。本發明的檢測方法操作簡單，費用低廉，準確度高，可實現自動化檢測。
【專利說明】SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及SNP檢測篩選雞的方法，具體涉及SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法。【背景技術】
[0002]單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP),是指在基因組上單個核苷酸的變異，在遺傳物質傳遞過程中可以穩定遺傳給后代，因此可以作為分子標記進行育種和保種。
[0003]外貌是雞(Gallus gallus domesticus)重要的品種特征之一，在育種和保種中占據了重要地位，目前，對于控制雞外貌特征的分子標記研究仍然較少，僅有少量的外貌特征能夠通過分子標記進行輔助選擇育種。
[0004]羽毛是動物最復雜的外皮附屬物之一，具有不同的形狀、大小、花紋、色素沉積等各種方面的表型變異，而且變異可以發生在羽毛發育和分化的每個階段，因此可以作為研究進化和發育的一種理想的模型。羽毛發育的過程中可以形成部分或全部的羽枝結構，構成了不同的羽毛類型。家禽遺傳學家、動物學家和胚胎學家等多個領域的研究者都對決定羽毛形態的影響因素進行了很多研究，但是迄今為止，對于羽毛形態發生相關性狀的突變仍然知之甚少(Lucas, A.M.and P.R.Stettenheim.Avian anatomy:1ntegument.1972:U.S.Government Printing Office; 1st edition)。絲羽，就是絲狀的羽毛結構，是絲羽烏骨雞等的特征性狀之一。達爾文最早發現絲羽表型相對于正常羽毛來講是隱性遺傳的性狀，后來被證實是單基因遺傳的孟德爾性狀(Dunn, L.C.and M.A.Jul1.0n the Inheritance ofsome characters of the Silky fowl.J Genet, 1927, 19:27-63)。絲羽在身體部分的廓羽羽枝中缺少了羽小鉤的結構，因而羽小枝之間不能連接在一起，所以羽毛比較蓬松，不能緊密覆蓋在皮膚上。絲羽的羽小枝結構相對于片羽來講，變得更加細長。
[0005]目前，Shh (Sonic hedgehog)和 Bmp2 (Bone morphogenetic protein2)信號通路之間的互作已被證實和羽枝的形成等有關(Harris, Μ.P., S.Williamson, J.F.Fallon, etal.Molecular evidence for an activator—inhibitor mechanism in development ofembryonic feather branching.Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(33):11734-11739),其中，但是關于羽小鉤的發育和分化，在分子水平的研究還很少，更缺少檢測雞的絲羽性狀分子標記方法。

【發明內容】

[0006]針對目前缺少檢測雞的絲羽性狀分子標記方法的現狀，本發明的目的是提供SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法。
[0007]CAU資源家系是由中國農業大學李寧教授課題組1998年建立的用于定位影響雞重要經濟性狀作用基因的實驗群體， 親本為法國明星肉雞和泰和絲羽烏骨雞(Deng，X.Μ., Li, J.Y., Li, N., and ffu, C.X.(2001).Genetic analysis of important growth traitbased on F_2 resource population in chicken.Yi Chuan Xue Bao 28,801-807)。在CAU資源家系中記錄了 Fc^F1和F2代個體的絲羽性狀，通過連鎖分析定位了影響雞絲羽性狀的基因位點在雞3號染色體上，通過分析該區域的基因序列，分離得到了影響雞絲羽性狀的基因和序列變異。本發明的檢測雞絲羽性狀的分子標記方法，是利用雞3號染色體的十聚異戍二烯焦憐酸合成酶 2 亞基(Decaprenyl-diphosphate synthase subunit 2, PDSS2)基因和正弦復眼結合蛋白(Sine oculis-binding protein homolog, S0BP)基因之間,位于第3號染色體70486623bp位點的一個核苷酸進行單核苷酸多態性檢測，根據檢測結果判定雞的絲羽基因為純合或雜合。
[0008]本發明提供SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，包括如下步驟:
[0009]I)提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
[0010]2)對PCR擴增產物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態性(SNP)檢測。
[0011]如果SNP檢測結果為GG，待測雞的基因型為CC ;如果SNP檢測結果為CC，待測雞的基因型為GG ;如果SNP檢測結果為CG，待測雞的基因型為CG ;所述CC基因型雞為片羽純合個體，GG基因型雞為絲羽純合個體，CG基因型雞為雜合個體(G為鳥嘌呤核苷酸，C為腺嘌呤核苷酸)。
[0012]其中，步驟I)所述的DNA特異性引物對的脫氧核糖核苷酸序列為:
[0013]上游引物:5’-Biotin-CGACTCTCAACGCGGGAAC-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)
[0014]下游引物:5’-CTGGGGGCAGCCATCTTG-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)
[0015]其中，步驟I)所述的擴增產物長度為123bp，且含雞第3條染色體的70486623bp位。
[0016]其中，步驟I)所述的PCR擴增，其反應體系終濃度(25 μ I)為:
[0017]
【權利要求】
1.SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)提取待測雞DNA樣品，用DNA特異性引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物； 2)對PCR擴增產物中的雞第3號染色體70486623bp位點進行單核苷酸多態性檢測。
2.如權利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟I)所述的DNA特異性引物對的脫氧核糖核苷酸序列為: 上游引物:5’ -Biotin-CGACTCTCAACGCGGGAAC-3’ 下游引物:5’ -CTGGGGGCAGCCATCTTG-3’
3.如權利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟1)所述的PCR擴增，其25 μl反應體系終濃度為:
4.如權利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟I)所述的PCR擴增的反應條件為:94°C變性5min ;94°C變性30sec，63°C退火30sec，65°C延伸lmin，其中每擴增I個循環退火溫度降低1°C，共10循環；94°C變性30sec，53°C退火30sec，65°C延伸lmin，共30循環；65°C延伸7min ;20°C保存;取2μl用于瓊脂糖檢測，擴增得到單一的目的條帶后用于進一步檢測。
5.如權利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，步驟2)所述的單核苷酸多態性檢測采用焦磷酸鹽測序方法，為在PCR擴增產物中加入測序引物，放入PyroMarkID焦磷酸測序儀進行SNP檢測。
6.如權利要求5所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，所述的測序引物的脫氧核糖核苷酸序列為:
5， -GCGTCGCACACGGGC-3，
7.如權利要求5所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法，其特征在于，所述的焦磷酸鹽測序方法具體為: 在步驟2) PCR擴增產物中加入Binding Buffer 38 μl > Sepharoe Beads 2μ1和滅菌水20μ 1，充分混勻10分鐘，轉移到反應板中，加入Annealing Buff er 12 μ 1，10 μ M測序引物1 μ 1，放入PyroMarkID焦磷酸測序儀進行SNP檢測,讀取結果。
8.用于權利要求1所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法的試劑盒，包含脫氧核糖核苷酸序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物。
9.權利要求1-7任一項所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法在雞的育種中的應用。
10.權利要求9所述的SNP檢測篩選雞的絲羽性狀的方法在雞的育種中的應用，為在雞分子標記輔助選擇中的應用。`
【文檔編號】A01K67/02GK103667429SQ201210348358
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月18日 優先權日:2012年9月18日
【發明者】胡曉湘, 馮春剛, 宋遲, 顧曉榮, 王彥強, 李寧 申請人:中國農業大學