專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產物在防治小麥病害上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及用途,更具體地說涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii)Wm\9菌株代謝產物及其在防治小麥病害上的應用，屬于生物農藥技術領域。
背景技術：
由植物病原真菌立枯絲核菌(/PAizocioflia cereal)侵染引發的小麥紋枯病和玉雙靡赤霉iGibberella zeae)侵染引發的小麥赤霉病,是小麥上的主要病害。當前,小麥紋枯病和赤霉病主要以化學防治為主，常用以下化學藥劑防治三唑酮，三唑醇，烯唑醇和多菌靈等。由于長期用該類藥劑進行單一防治，使得小麥紋枯病菌和赤霉病菌對上述化學藥劑產生不同程度的抗藥性，有時會出現防治失敗的事例，給農業生產造成重大損失。 目前成功用于防治麥類病害的生物農藥專用制劑還沒有。文獻已報道生物防治控制病害的生防菌屬(種)主要有(I)芽孢桿菌屬細菌spp.)中的枯草芽孢桿菌{Bacillus)、多粘芽抱桿菌{Bacillus poIymyxa)和巨大芽抱桿菌{Bacillusmega terium)； (2 )假單胞菌屬細菌iPseudomorms spp.)中的突光假單胞細菌iPseudomonasfluorescens )等。本發明提供的可同時兼治小麥各類病害的頡頏細菌黃麻鏈霉菌NF0919菌株，在現有技術中沒有提及和公開。

發明內容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces cor chorus ii ) NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，及提取物在防治小麥紋枯病和小麥赤霉病上的應用。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 3968。本發明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物分離方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發明的有益效果是
本發明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，并證明其提取物可同時兼治小麥多種病害。大田防治結果表明，該菌株代謝產物對小麥紋枯病和小麥赤霉病均有很好的防治效果。
具體實施方式
實施例本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL201010236886. I。本發明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D) NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實施例的實施效果
NF0919菌株發酵液的提取物對小麥紋枯病和小麥赤霉病的田間防效試驗試驗在江蘇省句容市鎮江農業科學研究所行香園區進行，小麥品種為鎮麥5號。試驗 處理方案如下
(A)小麥紋枯病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省綠盾植保農藥實驗有限公司生產)1000倍液，空白對照為不防治，小區面積60 m2,隨機區組排列，4次重復。處理時間為2011年4月8日，細噴霧防治I次，用水量為
50kg/667m2，防治后14天調查病害嚴重度并計算出病情指數；
(B)小麥赤霉病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省綠盾植保農藥實驗有限公司生產)1000倍液，空白對照為不防治，小區面積60 m2,隨機區組排列，4次重復。處理時間為2011年5月16日，細噴霧防治I次，用水量為50 kg/667m2，防治后14天調查病害嚴重度并計算出病情指數。結果與分析NF0919菌株發酵液提取物3000倍液小麥紋枯病和小麥赤霉病的防治效果分別為91. 32%和95. 21% (表1)，而對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液對小麥紋枯病和小麥赤霉病的防治效果分別為72. 30%和81. 99% (表I)。以上結果表明，NF0919菌株發酵液中代謝產物提取物的田間防治效果顯著高于對照藥劑，NF0919菌株發酵液提取物對小麥兩大病害的兼治作用顯著。試驗中所有處理均未發生藥害現象，表明NF0919菌株發酵液中代謝產物使用安全。表I NF0919菌株發酵液的提取物對小麥紋枯病和小麥赤霉病的田間防治試驗結果
權利要求
1.黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii ) NF0919菌株(該菌種特性見專利ZL201010236886. I)發酵液中代謝產物的提取方法。
2.根據權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取物，在防治小麥紋枯病和小麥赤霉病上的應用。
3.權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級種子培養液的培養 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級種子培養液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h,其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級種子培養液的培養 將步驟(A)所得一級種子培養液按5%的接種量接入50 mL 二級種子培養液中，170rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發酵培養液的培養 將步驟(B)所得二級種子培養液按5%的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 V，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白.2.6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發酵液中代謝產物提取方法 把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號為CGMCC No.3968，菌種專利號為ZL201010236886.1)發酵液中活性代謝產物的提取方法。代謝產物能有效防治小麥紋枯病和小麥赤霉病。
文檔編號A01P3/00GK102870820SQ20121035462
公開日2013年1月16日 申請日期2012年9月23日 優先權日2012年9月23日
發明者楊敬輝, 陳宏州, 莊義慶, 張文文 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所