專利名稱：黃麻鏈霉菌nf0919菌株代謝產物在防治梨樹病害上的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物及用途,更具體地說涉及一種黃麻鏈霉菌iStreptomycescorchorusii)菌株代謝產物及其在防治梨樹病害上的應用，屬于生物農藥技術領域。
背景技術：
由植物病原真菌梨黑星菌(Kefliuria)侵染引發的梨黑星病(又稱梨瘡痂病)和輪紋大莖點菌LPhysalospora piricola)侵染引發的梨輪紋病(又稱梨瘤皮病、粗皮
病)，是梨樹上主要的真菌病害。梨病害的防治當前主要通過化學防治來防控，常用以下化學藥劑防治石硫合劑、烯唑醇、百菌清、甲基托布津、腈菌唑、代森錳鋅、退菌特、代森銨、嘧菌酯、醚菌酯、苯醚甲環唑、烯肟菌酯、啶酰菌胺、多菌靈、吡唑醚菌酯和咪鮮胺等。長期以來，由于多頻次、多劑量施用化學藥劑，造成梨樹病原真菌對常用化學藥劑都產生了不同程度的抗(耐)藥性，梨樹用藥量和用藥頻率逐年升高，對果品安全產生嚴重影響。目前成功用于防治梨樹病害的生物農藥專用制劑還沒有。文獻已報道生物防治梨樹病害的生防菌屬(種)主要有(I)木霉菌屬真菌spp.)中的綠色木霉(Tri choderma viri de)和哈茨木霉(Tri choderma harzianum ) ； (2)芽抱桿菌屬細舊{Bacillus spp.)中的枯草芽抱桿菌Cfeci77w5·)、多粘芽抱桿菌
poIymyxa )和巨大芽抱桿菌 iBacillus megaterium') ； (3)假單胞菌屬細菌{Pseudomonasspp.)中的突光假單胞細菌fluorescens)等。本發明提供的可同時兼治梨輪紋病和梨黑星病的頡頏細菌黃麻鏈霉菌NF0919菌株，在現有技術中沒有提及和公開。

發明內容
提供黃麻鏈霉菌iStreptomyces corchorusii) NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，及提取物在防治梨黑星病和梨輪紋病上的應用。本發明是通過以下技術方案實現的
本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL 201010236886. I。黃麻鏈霉菌(拉丁文學名為Streptomyces corchorusii) NF0919菌株，已于2010年7月8日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為=CGMCC No. 3968。本發明的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl 0. 5%, K2HPO4 0. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白
2.2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的 容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaClO. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物分離方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本發明的有益效果是
本發明提供黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，并證明其提取物可同時兼治梨樹多種病害。大田防治結果表明，該菌株代謝產物對梨黑星病和梨輪紋病均有很好的防治效果。
具體實施方式
實施例本發明中提供用的黃麻鏈霉菌NF0919菌株的菌株特征，見專利ZL201010236886. I。本發明黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中產物的提取方法，包括以下步驟
(A)菌株的活化與一級種子培養液的培養
將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL—級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL)，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h，其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨l%，NaCl O. 5%, K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V;
(B)二級種子培養液的培養
將步驟(A)所得一級種子培養液按5% (V/V)的接種量接入50 mL 二級種子培養液中(250 mL三角瓶裝培養液50 mL),170 rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分(W/V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%，K2HPO4 O. 05%, MgSO4 O. 05%,淀粉酶 O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4^MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為W/V ；
(C)發酵培養液的培養
將步驟(B)所得二級種子培養液按5% (V/V)的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡劑I. 6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 °C，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為(W /V):馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 6%，K2HPO4 O. 05%, NaCl
O.2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4、NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V ;所述的消泡劑為XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑；
(D)NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法
把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。本實施例的實施效果
NF0919菌株發酵液的提取物對梨黑星病和梨輪紋病的田間防效試驗試驗在江蘇省句容市鎮江農業科學研究所白兔果園進行，梨樹品種為日本愛甘水(6年樹齡)，試驗處理方案如下
(A)梨黑星病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑(江蘇省綠盾植保農藥實驗有限公司生產)1000倍液，空白對照為不防治，每小區6棵樹，隨機區組排列，4次重復。第一期防治時間為幼果期(2011年4月28日);第二期防治時間為采果前45天左右(2011年6月30日)，每期各連續防治4次，防治間隔期都為7天，用水量為每棵樹6 Kgo采果時調查病害嚴重度并計算出病情指數；
(B)梨輪紋病的防治
藥劑處理方法NF0919菌株發酵液提取物3000倍液，對照藥劑為50%多菌靈可濕性粉齊IJ (江蘇省綠盾植保農藥實驗有限公司生產)1000倍液，空白對照為不防治，每小區6棵樹，隨機區組排列，4次重復。第一期防治時間為落花初果期(2011年4月10日);第二期防治時間為采果前70天左右(2011年6月10日)，每期各連續防治4次，防治間隔期都為10天，用水量為每棵樹6 Kgo采果時調查病害嚴重度并計算出病情指數。結果與分析NF0919菌株發酵液提取物3000倍液對梨黑星病和梨輪紋病的防治效果分別為92. 21%和69. 53% (表1)，而對照藥劑50%多菌靈可濕性粉劑1000倍液對梨黑星病和梨輪紋病的防治效果分別為57. 22%和40. 23% (表I)。以上結果表明，NF0919菌株發酵液中代謝產物提取物的田間防治效果顯著高于對照藥劑，NF0919菌株發酵液提取物對梨樹兩大病害的兼治作用顯著。試驗中所有處理均未發生藥害現象，表明NF0919菌株發酵液中代謝產物使用安全。表I NF0919菌株發酵液的提取物對梨黑星病和梨輪紋病的田間防治試驗結果
權利要求
1.黃麻鏈霉菌(Streptomycescor chorus ii') NF0919菌株(該菌種特性見專利ZL201010236886. I)發酵液中代謝產物的提取方法。
2.根據權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取物，在防治梨黑星病和輪紋病上的應用。
3.權利要求I所述的黃麻鏈霉菌NF0919菌株發酵液中代謝產物的提取方法，其特征在于包括以下步驟 (A)菌株的活化與一級種子培養液的培養 將保存的NF0919菌株的斜面在高氏一號培養基上活化，30°C培養10 d，挑取I cm2大小的菌塊接種于50 mL 一級種子培養液中，置于170 rpm搖床上30°C振蕩培養44 48 h,其中所述的50 mL—級種子培養液的成分為可溶性淀粉3%，葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，K2HPO4 O. 2%，可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、NaCl和K2HPO4含量的單位比例為W/V ； (B)二級種子培養液的培養 將步驟(A)所得一級種子培養液按5%的接種量接入50 mL 二級種子培養液中，170rpm,30 °C搖床上培養48 - 52 h，其中所述的5%的單位比例為V/V ;所述的50 mL 二級種子培養液的成分:馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2. 2%, CaCO3 O. 1%, K2HPO4 O. 05%，MgSO4 O. 05%,淀粉酶O. 01%,馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、CaCO3、K2HPO4, MgSO4和淀粉酶含量的單位比例為VV； (C)發酵培養液的培養 將步驟(B)所得二級種子培養液按5%的接種量接種于裝有160 L發酵培養液的容積為200 L的發酵罐中，其中所述的5%的單位比例為V/V，設置發酵參數為溶氧100%，消泡齊IJ(XP-100F系列發酵用有機硅消泡劑)1.6 L，攪拌速度為360 rpm,發酵溫度為36 V，發酵時間為72 h，pH 6. 8 7. 2，所述的發酵培養液的成分為馬鈴薯淀粉8. 5%，棉籽蛋白2.6%, K2HPO4 O. 05%, NaCl O. 2%, MgSO4 O. 05%, CaCO3 O. 1%，ρΗ7· 2-7. 4，馬鈴薯淀粉、棉籽蛋白、K2HPO4 ,NaCl、MgSO4和CaCO3含量的單位比例為W/V; (D)NF0919菌株發酵液中代謝產物提取方法 把步驟(C)所得發酵液在10000 rpm離心5 min得上清液，用濃鹽酸調節pH至2. 0，出現沉淀，再次離心，收集沉淀物，用乙酸乙酯萃取3次，35°C真空干燥得提取物。
全文摘要
本發明為黃麻鏈霉菌NF0919菌株(其在CGMCC的保藏編號為CGMCC No.3968，菌種專利號為ZL201010236886.1)發酵液中活性代謝產物的提取方法。代謝產物能有效防治由植物病原真菌梨黑星菌(Venturia piritna)侵染引發的梨黑星病(又稱梨瘡痂病)和輪紋大莖點菌(Physalospora piricola)侵染引發的梨輪紋病(又稱梨瘤皮病、粗皮病)。
文檔編號A01P3/00GK102894011SQ20121035462
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月23日 優先權日2012年9月23日
發明者楊敬輝, 陳宏州, 莊義慶, 狄華濤 申請人:江蘇丘陵地區鎮江農業科學研究所