專利名稱：草莓的根尖脫毒與快繁技術的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物育種領域，具體而言，本發明涉及草莓根尖的脫毒和組培方法以及可用于檢測該方法產生的草莓是否侵染病毒的多重RT-PCR同步快速檢測方法。
背景技術：
我國是世界上草莓野生資源最豐富的國家，很早就開始利用野生草莓，并一直沿襲至今。我國的大果草莓栽培始于1915年，但過去未受到重視，發展緩慢。20世紀80年代 以來草莓生產有了迅速的發展，目前草莓生產面積約7萬hm2，面積居世界第一位，其中主要產地分布在安徽、遼寧、河北、山東、江蘇、上海、浙江、四川、新疆、北京等地區。由于草莓是草本植物，長期靠匍匐莖繁殖，易形成病毒病、炭疽病、疫病等的嚴重危害。經初步調查草莓病毒和類病毒的種類繁多，主要有黃邊病毒(Strawberry mildyellow edge virus, SMYEV),草莓壤脈病毒(strawberry vein banding virus, SVBV),草莓皺縮病毒(Strawberry crinkle virus, SCV 或 SCrV)和草莓斑駁病毒(Strawberrymottle virus, SMoV)的危害。更為嚴重的是，許多病毒侵染草莓后的癥狀(尤其是早期癥狀)不明顯，使得在種植期防治難以得以實施。例如，草莓輕型黃邊病毒單獨侵染栽培種草莓無明顯癥狀，僅使病株輕微矮化，使草莓長勢變弱，產量和果實質量嚴重下降，減產可高達75% ;草莓斑駁病毒單獨侵染栽培種草莓時往往不表現明顯癥狀，但病株長勢衰退，果實品質下降，可減產20% 30%,與其它病毒復合侵染時才會產生斑駁癥狀；草莓鑲脈病毒單獨侵染栽培種草莓時，無明顯癥狀，但引起植株生長衰弱，匍匐莖抽生量減少，產量和品質下降，與斑駁病毒、輕型黃邊病毒復合侵染后引起病株葉片皺縮、扭曲，植株極度矮化。只有草莓皺縮病毒的侵染癥狀較為明顯，感病植株表現為葉片畸形，葉上產生褪綠斑，沿葉脈出現小的、不規則的褪綠斑及壞死斑，葉脈褪綠、透明；幼葉生長不對稱，扭曲皺縮，小葉黃化，葉柄縮短，葉小，植株矮化；病毒株草莓匍匐莖抽生量減少，繁殖力下降，果實變小，強毒株單獨侵染即可造成減產35% 40%，與其他病毒復合侵染，危害更為嚴重，草莓產量會大幅度下降，甚至絕產。為此，人們已經進行了研究，通過草莓的莖尖/匍匐莖/花藥脫毒組織培養與快繁技術生產原原種無病毒草莓苗。例如，中國專利申請200510030445公開了一種草莓莖尖培養生產脫毒苗的方法，其中基本采用了常規的培養基，并且需要顯微鏡進行手工剝取莖尖；中國專利200510062199公開了一種草莓脫病毒法，其中采用了常規的培養基，并且需要剝取莖尖，另外需要在高溫下進行培養，大大降低了草莓苗的成活率；中國專利200710022803公開了一種利用草莓花藥培養進行脫毒快繁的方法；中國專利200510062199公開了脫除草莓SMYEV的方法，其中基本采用了常規的培養基，并且需要剝取莖尖，僅僅針對SMYEV進行脫毒，其他病毒的脫毒效果不詳。其他的公開文獻還包括中國專利(申請)200910304829、201010133426、201010197820、201010252871、201010253333、20101058534、201110096851、201110139539、201110327423、201110375059 等。然而，草莓莖尖脫毒，需要用手術工具連續剝離十余層包裹于莖(尖)外的莖片，操作難度大、工作效率低，更為嚴重的是，雖然大多數情況下能夠脫毒，但是即使有經驗的技術人員也難以徹底剝離與消毒(經我們用多重RT-PCR同步快速檢測方法檢測，通常有60%的(混合)污染率，造成育苗品質的不穩定；而且，采用上述方法還存有外植體分化速度和脫毒試管苗繁殖速度較慢，長勢弱及移植大田生產偏低等問題。為此，本發明人經過長期而艱苦的研究，憑借一些運氣，開創性地采用以草莓的根尖為外植體進行脫毒和組培，省卻了使用顯微鏡的步驟，而且大大降低了污染率，并為此研究出了具體的草莓脫毒與組培方法，其步驟以及條件與現有技術的差異很大。另外，為了檢驗草莓脫毒的效果，尤其是脫多種病毒的效果，本發明人還研究獲得了多重RT-PCR同步快速檢測方法，可以對草莓組織直接實施高靈敏度的病毒檢測，無需分離、純化，而且其中的 各引物及其配比經過優化，基本消除了檢測中的相互干擾。

發明內容
本發明目的在于提供新的草莓脫毒與組培的方法以及可以與之配套的多重RT-PCR同步快速檢測草莓病毒的方法。本發明的草莓脫毒與組培的方法相對于現有技術的操作繁瑣、效率低、消毒難徹底、組培苗污染率高等問題，更加地操作簡便、效率高、消毒易徹底、組培苗污染率低、繁殖速度快、苗質好。具體而言，在第一方面，本發明提供了草莓脫毒與組培的方法，其包括
1)對草莓進行預處理，獲得消毒的根尖；
2)在根尖誘導培養基上將根尖誘導培養成再生植株幼芽；
3)在增殖培養基上將幼芽增殖培養成小苗；
4)在繼代生長培養基上使得小苗長成繼代小苗；
5)在生根培養基上使得繼代小苗長成試管苗；和
6)任選檢測試管苗是否侵染病毒。優選在本發明第一方面的方法中，
根尖誘導培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/L+BA (6-卞氨基嘌呤)O. 3-0. 5mg/L+2, 4-D (2，4 一二氯笨氧乙酸)O. 1-0. 3mg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 鹿糖 20 g/L ；
增殖培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500 mg/L + KH2P0450 mg/L +BA 0. 2-0. 5 mg/L+ NAA (萘乙酸)0. 1-0. 3mg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 蔗糖 20 g/L ；繼代生長培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/0. 5L+BA O. 1-0. 3mg/L + 水解乳蛋白 I g/L+ 蔗糖 20 g/L ;和 / 或，
生根培養基的配方為MS基本培養基+NH4N03400mg/L+ KN03500 mg/L + KH2PO4 50 mg/L + NAAO. 1-0. 5mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L。更優選在本發明第一方面的方法中，各步驟為
I)將草莓放入滅菌細沙內于37 土:TC下進行熱處理，直至抽生根系；取l-2cm長的主根根尖，消毒并水洗次后，直接將前端O. 1-0. 2mm根尖切下作為外植體；2)將外植體接種在根尖誘導培養基上，在25土 3°C，光強1000 土 2001ux、光照16 土 2小時/天下培養，四周后光強增強到2000 土 500 lux，六周后增強到4000 土 500 lux，培養直至從根尖誘導出再生植株幼芽；
3)將再生植株幼芽接種在增殖培養基上，在25土 3°C，光強2500 土 5001ux、光照16 土2小時/天下培養，直至長成8-lOcm長的小苗；
4)將小苗剪成l-3cm長的小段，接種在繼代生長培養基上，在25土 3°C，光強2500 土5001ux、光照16 土 2小時/天下培養，直至長成8-10cm長的繼代小苗；和/或
5)將繼代小苗接種到生根培養基上，在25土 3°C，光強2500 土 5001ux、光照16 土 2小時/天下培養，直至長出根系。也優選在本發明第一方面的方法中，檢測試管苗是否侵染病毒是通過采用如下混合引物對的RT-PCR進行檢測的
SMoV 上游引物 P1: 5 ‘ -TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3，
SMoV 下游引物 P2: 5 ‘ -TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3，
SMYEV 上游引物 P3: 5 ‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’
SMYEV 下游引物 P4: 5 ‘ -CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3，SVBV 上游引物 P5: 5 ‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’
SVBV 下游引物 P6: 5 ‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’
SCrV 上游引物 P7: 5 ‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’
SCrV 下游引物 P8: 5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。進一步優選其中，混合引物對中Pl P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8的含量比為0. 3 0· 5 0. 3 O. 5 0. 4 O. 6 :0. 4 O. 6 :0. 8 I 0. 8 I 0. 9 I. I 0. 9 I. 1，優選為 O. 4 0. 4 O. 5 :0. 5 :0· 9 :0· 9 I :1ο在第二方面，本發明提供了草莓根尖在草莓脫毒與組培中的應用。其中優選草莓脫毒與組培是本發明第一方面的方法。在第三方面，本發明提供了多重RT-PCR同步快速檢測草莓病毒的方法，其中采用如下混合引物對
SMoV 上游引物 P1: 5 ‘ -TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3，
SMoV 下游引物 Ρ2: 5 ‘ -TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3，
SMYEV 上游引物 Ρ3: 5 ‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’
SMYEV 下游引物 Ρ4: 5 ‘ -CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3，
SVBV 上游引物 Ρ5: 5 ‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’
SVBV 下游引物 Ρ6: 5 ‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’
SCrV 上游引物 Ρ7: 5 ‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’
SCrV 下游引物 Ρ8: 5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。除了檢測所需的引物，RT-PCR所用的試劑以及方法流程是本領域技術人員所熟知的，而且有許多已經商品化了。而引物的增多容易引起相互干擾，為此本發明人進行了優化。優選其中，混合引物對中Pl Ρ2 Ρ3 Ρ4 Ρ5 Ρ6 Ρ7 Ρ8的含量比為O. 3 O. 5 :0. 3 O. 5 O. 4 O. 6 0. 4 O. 6 0. 8 I 0. 8 I 0. 9 I. I 0. 9 I. 1，優選為 O. 4 0. 4 0. 5 0. 5 0. 9 0. 9 I :1。
優選在本發明第三方面的中，檢測的對象是草莓試管苗，優選是本發明第一方面的方法獲得的試管苗。本發明取得的有益效果在于
1、操作容易、效率顯著提高因草莓的“莖尖”是由外圍十余層莖片包裹中心的莖尖而組成，以往在顯微鏡下，用手術工具連續剝除十余層莖片是一項難度較大而效率很低的工作；而草莓的“根尖”直接暴露在外，切取其根尖的尖端就顯得十分容易，效率可提高幾十倍至上百倍；
2、消毒徹底，污染率低莖尖脫毒由于其外圍莖片不易除凈，消毒也就難以徹底，導致組培苗污染率往往高達60%左右；而根尖脫毒由于其外圍無任何包裹，消毒容易而徹底，故其組培苗污染率可大為下降；
3、提高了組培苗的質量本發明以根尖為外植體不僅成功培育出了草莓組培苗,并通過試驗后明確，根尖組培苗比莖尖組培苗在外植體分化速度、植株再生速度、試管苗繁殖速·度及產量上均有提高；
4、經大田種植試驗后明確，根尖脫毒組培苗其生根率和移栽成活率高達98%以上；
5、整個方法充分適合了根尖的特點，對各級培養基作了全面的改進與調整，確保了根尖組培的成功；
6、另外開發了多重RT-PCR同步快速檢測草莓病毒的技術，與前述脫毒和組培方法聯合使用，可以確保草莓組培苗的零帶毒，從而為草莓組培苗的優質、安全、高產和大面積推廣奠定了基礎。


圖I是本發明的草莓脫毒與組培方法培育出的草莓苗的長勢照片，其中A、B和C分別顯示了草莓苗在試驗田、大田和設施(大棚)中的種植情況。圖2是現有技術培育出的草莓苗的長勢照片。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，具體實例僅是為了說明，并不構成對本發明范圍的限制。顯然本領域的普通技術人員可以根據本文說明，在本發明的范圍內對本發明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發明的范圍內。另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻也是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本發明進行參考，就好像它們的全文已經在本發明說明書中重復敘述過一樣。
具體實施例方式以下通過具體的實施例進行說明，其中未特別詳細說明的材料、試劑均為本領域技術人員所熟知的，可以從市場所購買(草莓品種為紅俠和章姬；MS基本培養基可購自武漢晟亞生物技術有限公司，型號M524 (其中已經添加瓊脂)，也可以參見植物組培的書籍或實驗手冊。實施例I多重RT-PCR同步快速檢測草莓組織的病毒侵染
委托合成核苷酸序列如下的草莓病毒特異性引物對，并混合成SMoV的兩種引物含量分別為4 μ M、SMYEV的兩種引物含量分別為5 μ M、SVBV的兩種引物含量分別為9 μ M、SCrV的兩種引物含量分別為10 μ M的混合引物溶液
SMoV 上游引物 P1: 5 ‘ -TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3，
SMoV 下游引物 Ρ2: 5 ‘ -TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3，
SMYEV 上游引物 Ρ3: 5 ‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’
SMYEV 下游引物 Ρ4: 5 ‘ -CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3，
SVBV 上游引物 Ρ5: 5 ‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’SVBV 下游引物 Ρ6: 5 ‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’
SCrV 上游引物 Ρ7: 5 ‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’
SCrV 下游引物 Ρ8: 5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。取草莓組織Ig,放入IOOmL含O. 5%Triton X-100和O. 4 %Na2S03的溶液中于37°C浸提20min,然后于室溫(25°C)浸提Ih,過濾,取濾液以12 , OOOr/ min離心IOmin,得樣品溶液。采用RT-PCR反轉錄試劑盒(可購自海基生物科技有限公司，商品編號D0501)，混合上述樣品溶液 2. 5 μ L、5 X RT MasterMix 2μ L和 Oligo (dT) 20 Primer O. 5 μ L，用去離子水補足至10 μ L,反應程序為25°C溫育10mim,42°C反轉錄45mim, 95°C滅活2mim,得到反轉錄cDNA溶液。混合上述反轉錄cDNA溶液4yL、上述混合引物溶液IyL和2XTaq PCR Mix12. 5 μ L，用去離子水補足至25 μ L，進行PCR，條件為94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸I min，共30個循環；最后72°C延伸10 min。以上引物及配比在檢測草莓組織(尤其是草莓試管苗組織)時不會引起相互干擾，而且SMoV病毒呈陽性，將擴增出15kb條帶，否則未擴增出，呈陰性；SMYEV病毒呈陽性，將擴增出21kb條帶，否則未擴增出，呈陰性；SVBV病毒呈陽性，將擴增出16kb條帶，否則未擴增出，呈陰性；病毒呈陽性，將擴增出23kb條帶，否則未擴增出，呈陰性。這很容易通過瓊脂糖電泳條帶來分辨。實施例2草莓脫毒與組培方法I 配制如下培養基
1)MS基本培養基；
2)根尖誘導培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/L+BAO. 5mg/L+2, 4-D 0. lmg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 鹿糖 20 g/L ；
3)增殖培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500 mg/L + KH2P0450 mg/L +BA
0.5 mg/L+ NAA 0. 2mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L ；
4)繼代生長培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/0. 5L+BA 0. 2mg/L + 水解乳蛋白 I g/L+蔗糖 20 g/L ；
5)生根培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L+ KN03500 mg/L + KH2PO4 50 mg/L +NAA 0. 5mg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 鹿糖 20 g/L ；
根尖脫毒與組培步驟如下1)材料預處理將草莓放入滅菌細沙內于37土 2°C下進行熱處理6-12周，直至抽生根系；取l-2cm長的主根根尖，依次經70% (V/V)酒精消毒30秒，用O. 1%氯化汞加一滴吐溫搖動消毒8分鐘及用無菌水洗3-5次后，直接將前端O. 1-0. 2mm根尖切下作為外植體；
2)根尖誘導再生植株培養將外植體接種在根尖誘導培養基上，在25土 2°C，光強lOOOlux、光照16小時/天下培養，至四周后光強增強到2000 lux，六周后增強到4000lux，培養3. 5-4. 5個月，直至從根尖誘導出再生植株幼芽；
3)幼芽增殖培養將再生植株幼芽接種在增殖培養基上，在25土 2°C，光強25001ux、光照16小時/ d下培養I個月，直至長成8-lOcm長的小苗；
4)繼代生長培養將小苗剪成2-2.5cm長的小段，接種在繼代生長培養基上，在25 土2°C，光強25001ux、光照16小時/ d下培養，直至長成8_10cm長的繼代小苗；
5)生根培養將繼代小苗接種到生根培養基上，在25土 2°C，光強25001ux、光照16小時/ d下培養，直至約I周后長出根系成為試管苗。由此完成脫毒和組培過程，可以移栽大 田或大棚種植。實施例3草莓脫毒與組培方法2 配制如下培養基
2)根尖誘導培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/L+BAO. 8mg/L+2, 4-D 0. 2mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L ；
3)增殖培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500 mg/L + KH2P0450 mg/L +BA
0.35 mg/L+ NAA 0. 35mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L ；
4)繼代生長培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/0. 5L+BA 0. 35mg/L + 水解乳蛋白 I g/L+蔗糖 20 g/L ；
5)生根培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L+ KN03500 mg/L + KH2PO4 50 mg/L +NAA 0. 3mR/L+ 水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L。根尖脫毒與組培步驟同實施例2的步驟。實施例4草莓脫毒與組培方法3 配制如下培養基
2)根尖誘導培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/L+BA
1.Omg/L+2, 4-D 0. 3mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L ；
3)增殖培養基MS基本培養基 + NH4N03400mg/L + KN03500 mg/L + KH2P0450 mg/L +BA0. 2mg/L+ NAA 0. 5mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L ；
4)繼代生長培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/0. 5L+BA 0. 5mg/L + 水解乳蛋白 I g/L+蔗糖 20 g/L ；
5)生根培養基MS基本培養基+NH4N03400mg/L+ KN03500 mg/L + KH2PO4 50 mg/L +NAA 0. lmg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L。根尖脫毒與組培步驟同實施例2的步驟。實施例5本發明與現有技術的比較結果
在浙江省農科院病毒學與生物技術研究所的衛星車間內(浙江省寧波市農科院組織培養中心內)進行脫毒和組培試驗，生產草莓試管苗。實驗組參照實施例2-5所述的方法進行，共進行96組(每種方法不小于做20組)，其中長勢的照片如圖I所示；對照組參照中國專利申請200510030445和中國專利200510062199所記載的方法以及類似方法進行，共進行96組，其中部分長勢照片如圖2所示。取各組培與產生的試管苗，每組隨機取樣96個組織混合后，根據實施例I所述的方法進行檢測。檢測結果如表I所示，實驗組檢出的污染(組內任何一個樣品檢出任何一種病毒就算本組污染)有16個，污染率為16. 6%，而對照組污染64個，污染率高達66. 7% ;實驗組平均愈傷組織為32天，短于對照組的38天；實驗組再生植株平均為126天，短于對照組的132天；實驗組的草莓苗的月平均繁殖速度為5. I倍，高于對照組的4. 8倍；實驗組的試管苗的移栽成活率98%，也高于對照組的96% ;實驗組的初始苗每株可平均繁殖生產苗113. I株，而對照組的僅102株。由此可見，本發明的方法所培育的草莓苗比現有技術的在外植體分化速度、植株再生速度、試管苗繁殖速度組培苗和大田產量等方面均有提1 。表I 本發明與現有技術的脫毒和組培的效果對比表
權利要求
1.草莓脫毒與組培的方法，其包括 1)對草莓進行預處理，獲得消毒的根尖； 2)在根尖誘導培養基上將根尖誘導培養成再生植株幼芽； 3)在增殖培養基上將幼芽增殖培養成小苗； 4)在繼代生長培養基上使得小苗長成繼代小苗； 5)在生根培養基上使得繼代小苗長成試管苗；和 6)任選檢測試管苗是否侵染病毒。
2.權利要求I所述的方法，其中各步驟為 根尖誘導培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/L+BA (6-卞氨基嘌呤)O. 3-0. 5mg/L+2, 4-D (2，4 一二氯笨氧乙酸)O. 1-0. 3mg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 鹿糖 20 g/L ； 增殖培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500 mg/L + KH2P0450 mg/L +BA 0. 2-0. 5 mg/L+ NAA (萘乙酸)0. 1-0. 3mg/L+ 水解乳蛋白 I g/L+ 蔗糖 20 g/L ；繼代生長培養基的配方為MS基本培養基+ NH4N03400mg/L + KN03500mg/L+KH2P0450mg/0. 5L+BA O. 1-0. 3mg/L + 水解乳蛋白 I g/L+ 蔗糖 20 g/L ;和 / 或， 生根培養基的配方為MS基本培養基+NH4N03400mg/L+ KN03500 mg/L + KH2PO4 50 mg/L + NAAO. 1-0. 5mg/L+水解乳蛋白 I g/L+鹿糖 20 g/L。
3.權利要求I或2所述的方法，其為 1)將草莓放入滅菌細沙內于37土 3°C下進行熱處理，直至抽生根系；取l-2cm長的主根根尖，消毒并水洗次后，直接將前端O. 1-0. 2mm根尖切下作為外植體； 2)將外植體接種在根尖誘導培養基上，在25土 3°C，光強1000 土 2001ux、光照16 土 2小時/天下培養，四周后光強增強到2000 土 500 lux，六周后增強到4000 土 500 lux，培養直至從根尖誘導出再生植株幼芽； 3)將再生植株幼芽接種在增殖培養基上，在25土 3°C，光強2500 土 5001ux、光照16 土2小時/天下培養，直至長成8-lOcm長的小苗； 4)將小苗剪成l-3cm長的小段，接種在繼代生長培養基上，在25土 3°C，光強2500 土5001ux、光照16 土 2小時/天下培養，直至長成8-10cm長的繼代小苗；和/或 5)將繼代小苗接種到生根培養基上，在25土 3°C，光強2500 土 5001ux、光照16 土 2小時/天下培養，直至長出根系。
4.權利要求I所述的方法，其中檢測試管苗是否侵染病毒是通過采用如下混合引物對的RT-PCR進行檢測的 SMoV 上游引物 P1: 5 ‘ -TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3， SMoV 下游引物 P2: 5 ‘ -TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3， SMYEV 上游引物 P3: 5 ‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’ SMYEV 下游引物 P4: 5 ‘ -CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3， SVBV 上游引物 P5: 5 ‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’ SVBV 下游引物 P6: 5 ‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’ SCrV 上游引物 P7: 5 ‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’ SCrV 下游引物 P8: 5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。
5.權利要求4所述的方法，其中混合引物對中PlP2 P3 P4 P5 P6 P7 P8的含量比為 0. 3 0· 5 0. 3 O. 5 0. 4 O. 6 :0. 4 O. 6 :0. 8 I 0. 8 I 0. 9 I. I 0. 9 I. 1，優選為 O. 4 .O. 4 :0. 5 :0. 5 :0· 9 :0· 9 I :1。
6.草莓根尖在草莓脫毒與組培中的應用。
7.權利要求6所述的應用，其中草莓脫毒與組培是權利要求1-5之任一所述的方法。
8.多重RT-PCR同步快速檢測草莓病毒的方法，其中采用如下混合引物對SMoV 上游引物 P1: 5 ‘ -TAACGGTTCACGTCCTAGTCTGAC-3，SMoV 下游引物 P2: 5 ‘ -TCTTGGGCTTGGATCGTCACCTG-3， SMYEV 上游引物 P3: 5 ‘-GTGTCCTCAATCCAGCCAG-3’SMYEV 下游引物 P4: 5 ‘ -CATGGCACTCATTGGACCTGGG-3， SVBV 上游引物 P5: 5 ‘-GAATGGGACAATGAAATGAC-3’ SVBV 下游引物 P6: 5 ‘-GTGAGGAGAACTTAGGACA-3’ SCrV 上游引物 P7: 5 ‘-CCCTTCGCAGGCGCGCTAACA -3’ SCrV 下游引物 P8: 5 ‘-GGGGTCCAACTCATAAGCGAT -3’。
9.權利要求8所述的方法，其中混合引物對中PlP2 P3 P4 P5 P6 P7 P8的含量比為 0. 3 0· 5 0. 3 O. 5 0. 4 O. 6 :0. 4 O. 6 :0. 8 I 0. 8 I 0. 9 I. I 0. 9 I. 1，優選為 O. 4 .O. 4 0. 5 0. 5 0. 9 0. 9 I :1。
10.權利要求8所述的方法，其中檢測的對象是草莓試管苗，優選是權利要求1-5之任一所述的方法獲得的試管苗。
全文摘要
草莓的根尖脫毒與快繁技術。本發明提供了草莓脫毒與組培的方法，其包括對草莓進行預處理，獲得消毒的根尖；在根尖誘導培養基上將根尖誘導培養成再生植株幼芽；在增殖培養基上將幼芽增殖培養成小苗；在繼代生長培養基上使得小苗長成繼代小苗；在生根培養基上使得繼代小苗長成試管苗；并任選檢測試管苗是否侵染病毒。另外，本發明還提供了多重RT-PCR同步快速檢測草莓病毒的方法，其中采用了混合引物對。
文檔編號A01H4/00GK102893869SQ20121040358
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者嚴成其, 陳劍平, 錢長根, 錢尖銳, 楊勇, 王栩鳴, 周潔, 張維林, 余初浪, 程曄, 王芳, 沈嵐, 朱宏芬, 劉健, 張國芳, 黃堅 申請人:浙江省農業科學院