專利名稱：蓖麻雌性株的繁殖保持方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及蓖麻雌性株的繁殖和保持方法。
背景技術(shù)：
蓖麻(TPicizw1S communist L.)屬重要工業(yè)油源作物,是世界十大油料作物之一，廣泛用于高級(jí)潤滑油、剎車油和防護(hù)油、涂料、增塑劑、尼龍系列、聚氨酯、香料、化妝品等化工生產(chǎn)以及醫(yī)學(xué)抗癌藥物的研制、生物農(nóng)藥的開發(fā)、生物柴油的煉制和優(yōu)質(zhì)飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域。利用蓖麻油生成化學(xué)衍生物已達(dá)175種，系列產(chǎn)品達(dá)2000多項(xiàng)。目前國內(nèi)外對(duì)蓖麻原料的需求呈上升趨勢，原料供需缺口明顯，世界年需蓖麻油約70萬t，但可供能力只有40萬t,國內(nèi)年需籽量約40萬t,而產(chǎn)籽量卻不足20萬t,缺口將近一半。中國是蓖麻主產(chǎn)國之 一，但農(nóng)民因品種混雜，單產(chǎn)產(chǎn)量低而種植積極性不高，蓖麻種植面積不穩(wěn)。在蓖麻原料供不應(yīng)求、種植面積不穩(wěn)的情況下，選育高產(chǎn)雜交種，努力提高蓖麻產(chǎn)量或單產(chǎn)，是調(diào)動(dòng)農(nóng)民積極性、促進(jìn)蓖麻產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的有效途徑之一。單雌蓖麻因花序上全著生雌花，屬不育型材料，作為育種的重要資源，對(duì)提高蓖麻產(chǎn)量具有重要作用，其雜種優(yōu)勢利用前景也十分廣闊。但由于蓖麻繁殖的常異交性和性別表現(xiàn)的復(fù)雜多變，單雌性狀(不育性狀)較難保持，種子繁殖系數(shù)較低，研究人員難以找到一種很好的方法使之保持不育特征。在其保持方法上，存在系統(tǒng)內(nèi)姊妹交、利用環(huán)境高溫誘導(dǎo)雄花、利用植物生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)雄花、利用機(jī)械損傷等農(nóng)藝措施誘導(dǎo)雄花、高空壓接等方法。目前生產(chǎn)上多數(shù)利用姊妹交繁殖雌性(不育)系，但該方法容易導(dǎo)致后代雌性率(不育株率)降低，甚至喪失。鄧崇輝等采用單雌(不育株)率較高的系統(tǒng)內(nèi)單雌(不育)株與兩性(可育)株姊妹交，后代雌株率降低3. 09Γ61. 6% ;張維鋒等采用姊妹交，雌株率保持50%左右；李文昌等采用姊妹交保持雌性系，所得后代雌性率為0% 50%，有些品種后代雌性率完全散失。利用環(huán)境高溫誘導(dǎo)雄花保持雌性系，雖然比較成熟，如Zimmerman、Ankineedu等育成了 ‘240’、‘SKP’系列、‘VP-Γ溫敏型雌性系，但高溫誘導(dǎo)雄花法受到材料及環(huán)境條件的限制，只適合于溫敏型材料，且對(duì)日均溫有要求。機(jī)械損傷法費(fèi)工費(fèi)時(shí)、成功率低，且具體方法未見報(bào)道。高空壓接法雖然繁殖系數(shù)較高，雌性系雌性率可提高到98%以上，但費(fèi)工費(fèi)時(shí)，成本高，且只適合于多年生雌性蓖麻。利用植物生長調(diào)節(jié)劑或化學(xué)藥劑誘導(dǎo)雄花的方法已有報(bào)道，但研究所用材料是否為100%雌株(不育性株)率的雌性系，并不詳細(xì)確鑿，且噴施時(shí)期一般是在開花前的苗期，出現(xiàn)的雄花或兩性株，是原有的還是誘導(dǎo)的難以判斷，其實(shí)際效果如何難以驗(yàn)證。綜上所述，如何有效地繁殖保持(發(fā)現(xiàn)的或優(yōu)良的)蓖麻單雌株，是蓖麻雜交育種的關(guān)鍵問題。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種蓖麻雌性株的繁殖保持方法。該方法通過蓖麻雌性株腋芽離體培養(yǎng)的方式，實(shí)現(xiàn)了蓖麻單雌株的繁殖保持。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的
一種蓖麻雌性株的繁殖保持方法，通過對(duì)蓖麻雌性株進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)蓖麻雌性株的繁殖保持，所述組織培養(yǎng)包括以下步驟
(1)從蓖麻雌性株中選取健康、壯實(shí)的腋芽作為材料，流水沖洗備用；
(2)在超凈工作臺(tái)上，將腋芽依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并沖洗；
(3)剝掉消毒腋芽外面一層苞葉，接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)；
(4)培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)腋芽生長分化形成少量不定芽，將腋芽轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培
養(yǎng);
(5)培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)腋芽增殖形成叢生芽，并生長出植株，將叢生芽生長形成的嫩莖切下，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成健壯的組培生根苗。優(yōu)選地，本發(fā)明所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，還包括組培生根苗的煉苗和移栽。優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步驟(I)中于蓖麻現(xiàn)蕾開花期，可區(qū)別雌性株時(shí)，在晴天或陰天上午采集雌性株上健康、壯實(shí)的腋芽，自來水沖洗干凈備用。優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步驟(2)中酒精濃度為75%，浸泡時(shí)間為30s，倒掉酒精后無菌水沖洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液，浸泡時(shí)間lOmin，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞后用無菌水沖冼3次。優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步驟(3)中腋芽清毒后，放在干凈濾紙上吸干水分，用鑷子和無菌刀剝掉外面一層苞葉，接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中；所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基中添加O. 6mg. Γ1 6-芐氨基嘌呤、O. 5mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%瓊脂制成，pH為5. 8±O. I。優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步驟(4)中培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為26±2°C，光照時(shí)間12-14h/d，光強(qiáng)1500Lx ;腋芽接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基15_20d，腋芽膨大長出新葉，并在基部周邊分化形成新芽，將新芽或外植體轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基，所述增殖培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基中添加O. 3mg. Γ1 6-芐氨基嘌呤、O. 2mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和
O.8%瓊脂制成，pH為5. 8±O. I。優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法的步驟(5)中腋芽在增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)15-25d，增殖形成叢生芽，并生長出植株，將生長長度超過2-3cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基中添加O. 5 mg. L—1萘乙酸、O. I mg. L—1吲哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的瓊脂和O. 5 g. L-1活性炭制成，pH為5. 8±0. I ;培養(yǎng)20_30d后，形成健壯的組培生根苗。進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其中組培生根苗的煉苗和移栽按如下步驟操作將裝有再生苗的培養(yǎng)瓶在室溫放置2d，打開封口膜后再放置2-3d，然后小心取出再生苗，將根上的培養(yǎng)基用自來水清洗干凈，移栽到裝有滅菌培養(yǎng)土的塑料杯或營養(yǎng)缽中，并澆透水，放入生長室培養(yǎng)；所述滅菌培養(yǎng)土由泥炭蛭石營養(yǎng)土=3:3:1的成分組成；生長室溫度為26±2°C，光照時(shí)間12h/d，光強(qiáng)1500Lx ;將生長室中成活、生長健壯并長出新根的幼苗，于生長季節(jié)選擇陰天的早晨或傍晚，帶土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距進(jìn)行栽種，移栽初期用遮陽網(wǎng)遮陽。
本發(fā)明所述的MS培養(yǎng)基和生化藥品可由市場上直接購得。所述的6-芐氨基嘌呤為BA，吲哚丁酸為IBA，吲哚乙酸為IAA，萘乙酸為NAA。采用本發(fā)明的方法，雌性株腋芽離體培養(yǎng)成活率高，繁殖速度快，增殖系數(shù)達(dá)
5.88。所得生根苗栽入大田后生長，進(jìn)入現(xiàn)蕾開花期觀察植株性狀和性別表現(xiàn)，結(jié)果是有的雌性株再生苗全部表現(xiàn)為雌性株，保持了單雌性狀，但部分雌性株的再生苗，有的保持單雌性狀，有的產(chǎn)生了雄花變成兩性株。對(duì)部分再生苗雌性株進(jìn)行同品系隔離開放授粉，成熟時(shí)，將所有雌性株分別單株收獲。將收獲的種子按IOOcmX IOOcm株行距分別播種,現(xiàn)蕾開花期觀察統(tǒng)計(jì)植株性別表現(xiàn)，結(jié)果是雌性再生苗F1代的雌性株率為30-100%，其中2株雌性再生苗的F1代雌株率分別高達(dá)90%和100%。由此可見，通過對(duì)蓖麻雌性株進(jìn)行離體培養(yǎng)得到生根苗，并進(jìn)行常規(guī)雜交可以實(shí)現(xiàn)蓖麻雌性株的繁殖保持，具有非常顯著的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)意義。
具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例的繁殖保持方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，均指重量百分含量。本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料為田間生長的11個(gè)蓖麻品系的雌性植株。實(shí)驗(yàn)步驟如下
I、蓖麻雌性株腋芽的選擇
于蓖麻現(xiàn)蕾開花后，可區(qū)別雌性株時(shí)，在晴天或陰天上午采集雌性株上健康、壯實(shí)的腋芽作為外植體。2、外植體的消毒
將采集的腋芽先用自來水沖洗，再用75%酒精浸泡30s，倒掉酒精后無菌水沖洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液,浸泡lOmin，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞后用無菌水沖冼3次。3、腋芽的分化誘導(dǎo)培養(yǎng)
腋芽清毒后，放在干凈濾紙上吸干水分，用鑷子和無菌刀剝掉外面一層苞葉，接入配制好的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基中添加O. 6mg.L、-芐氨基嘌呤、O. 5mg. L—1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%瓊脂，培養(yǎng)基PH為5. 8±0. 1，滅菌條件是121°C下20min。培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為26±2°C，光照時(shí)間12_14h/d，光強(qiáng)1500Lx。成活率(％)=分化再生的腋芽數(shù)/接種的腋芽總數(shù)X 100%。結(jié)果腋芽接入培養(yǎng)基15-20d，腋芽膨大長出新葉，并在基部周邊分化形成新芽，腋芽成活率為70. 75%。4、腋芽的增殖培養(yǎng)
將腋芽和新芽轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基添加O. 3mg.L^6-芐氨基嘌呤、O. 2mg. L—1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%瓊脂制成，培養(yǎng)基PH為5. 8±0. I。培養(yǎng)條件和步聚3相同。結(jié)果腋芽或新芽在增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)15-25d，增殖形成不定芽，有的不定芽生長形成植株，平均增殖倍數(shù)為5. 88。5、再生芽的生根
將分化生長出的長度超過2-3cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基中添加O. 5 mg. L-1萘乙酸、O. I mg. L-1卩引哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的瓊脂和O. 5
g.L—1活性炭制成，培養(yǎng)基PH為5. 8±0. I ;培養(yǎng)條件和步聚3相同。結(jié)果生根培養(yǎng)20-30d后，長出長的主根和許多側(cè)根，植株長大形成健壯的生根苗。6、生根苗的煉苗和移栽
將裝有再生苗的培養(yǎng)瓶在室溫放置2d，打開封口膜后再放置2-3d，然后小心取出生根苗，將根上的培養(yǎng)基用自來水清洗干凈，移栽到裝有滅菌培養(yǎng)土(泥炭蛭石營養(yǎng)土=3:3:1)的營養(yǎng)缽中，并澆透水，放入生長室培養(yǎng)；生長室溫度為26±2°C，光照時(shí)間12h/d，光強(qiáng)1500LX，根據(jù)情況適時(shí)澆水。待生長室營養(yǎng)缽中的再生苗成活，并長出新根后，于生長季節(jié)選擇陰天的早晨或傍晚，帶土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距進(jìn)行栽種，移栽初期注意用遮陽網(wǎng)遮陽，并適時(shí)澆水。7、再生苗及F1代性別表現(xiàn)觀察
栽入大田的植株進(jìn)入現(xiàn)蕾開花期，觀察植株性狀和性別表現(xiàn)；對(duì)部分再生苗雌性株進(jìn)行同品系隔離開放授粉，成熟時(shí)，將所有雌性株分別單株收獲；將收獲的種子按IOOcmX IOOcm株行距分別播種，現(xiàn)蕾開花期觀察統(tǒng)計(jì)植株性別表現(xiàn)。結(jié)果有些雌性株的再生苗保持了單雌性狀，全部表現(xiàn)為雌性株，但部分雌性株的再生苗，有的保持單雌性狀，有的產(chǎn)生了雄花變成兩性株；表現(xiàn)為雌性的再生苗的F1R的雌性株率為30-100%，其中2株雌性再生苗的F1代雌株率分別高達(dá)90%和100% (表I)。表I蓖麻雌性株再生苗性別表現(xiàn)及雌性再生苗F1代雌株率
權(quán)利要求
1.一種蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于通過對(duì)蓖麻雌性株進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)蓖麻雌性株的繁殖保持，所述組織培養(yǎng)包括以下步驟 (1)從蓖麻雌性株中選取健康、壯實(shí)的腋芽作為材料，流水沖洗備用； (2)在超凈工作臺(tái)上，將腋芽依次用酒精溶液、升汞溶液浸泡消毒并沖洗； (3)剝掉消毒腋芽外面一層苞葉，接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)室中培養(yǎng)； (4)培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)腋芽生長分化形成少量不定芽，將腋芽轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng); (5)培養(yǎng)一段時(shí)間后，當(dāng)腋芽增殖形成叢生芽，并生長出植株，將叢生芽生長形成的嫩莖切下，在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成健壯的組培生根苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于還包括組培生根苗的煉苗和移栽。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步驟(I)中于蓖麻現(xiàn)蕾開花期，可區(qū)別雌性株時(shí)，在晴天或陰天上午采集雌性株上健康、壯實(shí)的腋芽，自來水沖洗干凈備用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步驟(2)中酒精濃度為75%，浸泡時(shí)間為30s，倒掉酒精后無菌水沖洗1-2次，然后加入O. 1%升汞溶液，浸泡時(shí)間lOmin，其間不斷搖動(dòng)，倒掉升汞后用無菌水沖冼3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步驟(3)中腋芽清毒后，放在干凈濾紙上吸干水分，用鑷子和無菌刀剝掉外面一層苞葉，接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中；所述誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的配方為MS培養(yǎng)基中添加O. 6mg. L—1 6-節(jié)氨基嘌呤、O. 5mg. L—1叼丨哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%瓊脂制成，pH為5. 8 + 0. I。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步驟(4)中培養(yǎng)室中培養(yǎng)溫度為26 ±2 °C，光照時(shí)間12-14h/d，光強(qiáng)1500Lx ;腋芽接入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基15-20d，腋芽膨大長出新葉，并在基部周邊分化形成新芽，將新芽或外植體轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基，所述增殖培養(yǎng)基配方為MS培養(yǎng)基中添加O. 3mg. Γ1 6-芐氨基嘌呤、O. 2mg. Γ1吲哚乙酸、3%蔗糖和O. 8%瓊脂制成，pH為5. 8±O. I。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于步驟(5)中腋芽在增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)15-25d，增殖形成叢生芽，并生長出植株，將生長長度超過2-3cm的嫩莖切下，接入生根培養(yǎng)基；生根培養(yǎng)基的配方為1/2MS培養(yǎng)基中添加O. 5 mg. I/1萘乙酸、O. Img. L—1吲哚丁酸、3%蔗糖、O. 8%的瓊脂和O. 5 g. L—1活性炭制成，pH為5. 8 + 0. I ;培養(yǎng)20_30d后，形成健壯的組培生根苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述蓖麻雌性株的繁殖保持方法，其特征在于組培生根苗的煉苗和移栽按如下步驟操作將裝有再生苗的培養(yǎng)瓶在室溫放置2d，打開封口膜后再放置2-3d，然后小心取出再生苗，將根上的培養(yǎng)基用自來水清洗干凈，移栽到裝有滅菌培養(yǎng)土的塑料杯或營養(yǎng)缽中，并澆透水，放入生長室培養(yǎng)；所述滅菌培養(yǎng)土由泥炭蛭石營養(yǎng)土=3:3:1的成分組成；生長室溫度為26±2°C，光照時(shí)間12h/d，光強(qiáng)1500Lx ;將生長室中成活、生長健壯并長出新根的幼苗，于生長季節(jié)選擇陰天的早晨或傍晚，帶土移栽入大田，按IOOcmX IOOcm株行距進(jìn)行栽種，移栽初期用遮陽網(wǎng)遮陽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蓖麻雌性株的繁殖保持方法，通過對(duì)蓖麻雌性株進(jìn)行組織培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)蓖麻雌性株的繁殖保持，所述組織培養(yǎng)包括以下步驟(1)以蓖麻雌性株的腋芽為材料，流水沖洗備用；(2)消毒處理；(3)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)；(4)增殖培養(yǎng)；(5)生根培養(yǎng)。采用本發(fā)明的方法，雌性株腋芽離體培養(yǎng)成活率高，繁殖速度快，增殖系數(shù)達(dá)5.88。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102934610SQ20121040638
公開日2013年2月20日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者譚美蓮, 嚴(yán)興初, 嚴(yán)明芳, 汪磊, 傅春玲, 趙志丹, 王力軍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所