專利名稱：月季試管苗試管內開花及雌蕊單性開花的方法及其培養基的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種月季試管苗試管內開花及雌蕊單性開花的方法及其培養基，屬植物生物技術領域或植物遺傳育種或迷你花卉生產領域。
背景技術：
月季(R.chinenSiS)，被稱為花中皇后又稱“月月紅”，薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科，薔薇屬(Rosa)。常綠或半常綠低矮灌木，四季開花，多紅色，偶有白色，可作為觀賞植物，可作為藥用植物，也稱月季花。自然花期5至11月，花大型，有香氣，廣泛用于園藝栽培和切花。月季花種類主要有切花月季、食用玫瑰、藤本月季、地被月季等。中國是月季的原產地之一。陜北地區野生月季一般花較小在當年6月中旬開始開花，花期隨溫度變化較大。月季組培和快繁報道較多，呂汰(2000)研究發現適宜豐花月季離體側芽分花 的培養基為 MS+6-BA2. 00mg/L+NAA0. 10 O. 50mg/L,生根培養基為 1/2MS+NAA0. 30 O. 50mg/L，其生根率在95%以上；在蛭石與營養土的雙層基質中，生根試管苗的移栽成活率達90%。葉貽勛(1999)研究了月季組培過程中節省成本的辦法。莫磊興(1998)通過對5個切花月季品種組培快繁技術的研究，探討了品種、植物生長調節劑、溫度和光照強度等對外植體腋芽萌發、嫩莖增殖和生根的影響。莖段腋芽誘導適宜的條件是:MS+BA3 -Omg/L+NAA0 · 15mg/L，溫度 26°C左右。在 MS+BA3 · 0mg/L+IAA0 · 15mg/L 培養基上，嫩莖增殖達4倍以上。30001uX左右的自然散射光對增殖階段形成健壯嫩芽有利。小苗移植到沙子與椰糠混合的基質上，成活率達80%以上。李啟任(1997)以月季為材料，進行較大規模組培快繁技術研究，改進了表面滅菌，發現MS+BA0. 5mg/誘導腋芽萌發成枝較好；MS+BA1. Omg/L+NAA0. lmg/L用于伊麗莎白及黃和平增殖較好，MS+BA2mg/L+NAA0. lmg/L用于黃玫瑰增殖較好，薩蔓莎及維莎則用MS+BA3mg/L+NAA0. lmg/L較好；MS+BA0. lmg/L 0. 2mg/L+NAA0. Img/用于各品種月季壯苗效果都理想；1/2MS+IBA0. 2mg/L 0. 5mg/L+活性炭5g/L能較好誘導各品種試管苗生根，但黃玫瑰用ΝΑΑ0. 2代替IBA效果更理想。李海燕(2004)通過誘導芽分化和誘導愈傷兩種途徑，研究不同植物生長調節劑及濃度、對月季外植體萌發和生根的影響。發現，細胞分裂素6-BA分別與3種生長素NAA，IAA, IBA配合使用均能誘導月季出芽。月季開花也有報道秦賀蘭(2004)報道了植物生長調節劑對露地月季盛夏開花的影響，發現激素處理可以有效促進腋芽萌發和增加萌芽數量。洪燕萍(2004)報道了月季以月季莖段在MS+NAA0. 5mg/L+BA5mg/L’中進行誘導培養在MS+NAA0. lmg/L+BA3mg/L增技培養，在培養基MS+NAA0. l/mgL+BA2mg/L，大苗開花。周俊輝(2008)用微型月季莖段誘導培養無菌不定芽苗為材料，研究生根與愈傷組織情況、不同氮磷比、不同濃度的蔗糖、2-iP、ABA等處理對離體培養下花芽誘導的影響。結果表明生根不長愈傷組織的無菌不定芽苗的花芽誘導率最低，不生根、長愈傷組織誘導率最高；不同的氮磷比對花芽的誘導率不同，高磷低氮有助于花芽的形成；55g/L的蔗糖濃度較其他濃度對花芽的誘導效果最好；外源激素處理中，2-P和ABA均不利于花芽的誘導。
目前報道的為不論是組培還是試管內開花都不是陜北月季，他們沒有做到試管內二倍體和單倍體同時開花的層次。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是。本發明的技術方案如下一種月季試管苗試管內開花及雌蕊單性開花的方法，包括以下步驟(1)將適合陜北地區栽種的月季品種“月月紅”當年生的莖段，經過無菌處理接入人工制作的MS培養基中，通過初代培養獲得第一代無根試管苗；然后在MS培養基中加入I. 2mg/L的6-節氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照強度為I 5001x+2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下繼代培養25d ;獲得繁殖系數不低于6. 8的無根試管苗； (2)將繼代培養獲得的無根試管苗轉接在不含外源激素的培養基上培養6 8d，再轉入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養基中；通過變溫培養，培養條件為前5d在散光照射下培養，溫度維持早晨8:00 14:00持續升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20°C，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養；(3)將月季試管苗接入誘導開花的培養基中，采取變溫培養，前7d散光培養在光照強度為15001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉為8:00 20:00恒溫250C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養；二倍體開花后重復變溫培養方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% 5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉為維持日夜恒溫24°C培養；培養約2 5d后開放；所述誘導開花的培養基成分如下氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L,硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4. 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L,硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸紙卩多辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脫落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。與現有 MS培養基相比氯化鈣、硝酸氨、硝酸鉀、硫酸鎂等大量元素的含量降低，微量元素和有機元素的含量增減。所述的方法,所述的月季(R.chinensis)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa),在陜北野生的月季花。一種月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花的培養基，所述培養基為氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20)0. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸毗哆辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸 O. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH=5. 8。該方法可使二倍體試管苗開花率達到50%左右；可使二倍體花和雌蕊單倍體花呈塔式開放并且同時存在20 35d、開花率達到30%左右。
具體實施方式
以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。步驟一將月季當年生的莖短剪成長約5cm帶回實驗室。先在自來水下沖洗5 IOmin后，再用84消毒液15ml加蒸懼水到IOOml中浸泡6 8min。然后轉入凈化工作臺備用。在凈化工作臺中，將月季莖段用75%乙醇+1滴吐溫20滅菌10 15s，然后轉入O. 1%氯化汞+1滴吐溫20中滅菌6min，滅菌結束后用無菌水清洗3 5次。剪掉浸毒部位，余下的部分至少含一個芽體，接入準備好的MS培養基中。等接入的莖段中的液體萌發并長到3 5cm長后，將新形成的芽體取出，轉接到在MS培養基中加入I. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)的培養基中，在光照強度為I 5001x±2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下培養25d。通過三次連續實驗，第一次共接入35個液體，獲得了 261個新芽體，第二次實驗共接入28個芽體獲得了 191個新芽體，第三次實驗共接入69個芽體獲得了 471個新芽體。繁殖系數均不低于6. 8。步驟二將繼代培養獲得的無根試管苗在不含激素的MS培養基上培養一次，培養時間為6 8d，培養結束后將植株轉入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養基中。采用變溫培養的方式培養。通過變溫培養，培養條件為前5d在散光照射下培養，溫度維持早晨8:00 14:00持續升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20V，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16 °C，維持16 °C至8:00 ;在光照強度為I5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養。一般可形成50%左右的試管花卉。第一次實驗150株，獲得76株開花試管苗、第二次實驗230株獲得109株開花試管苗、第三次300株獲得157株開花試管苗。上述培養基配方為
氯化鈣(CaCl2·2Η20) 315mg/L、原MS 培養基中為 440mg/L ;硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,原MS培養基中為1600mg/L ;硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L、原MS培養基中為1900mg/L ;硫酸鎂(MgSO4 · 7H20)300mg/L、原 MS 培養基中為 370mg/L ;磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L、原 MS培養基中為170mg/L ;硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L、原MS培養基中為27. 8mg/L ；己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L、原 MS 培養基中為 37. 3mg/L ；硼酸(H3BO3) 20mg/L、原 MS培養基中為6. 2mg/L ;硫酸錳(MnSO4. H2O) 120. Omg/L、原MS培養基中為22. 3mg/L ;硫酸鋅(ZnSO4 ·7Η20) 11. Omg/L、原MS培養基中為8. 6mg/L ;，鑰酸鈉(NaZMoO4. 2H20)O. 30mg/L、原MS培養基中為O. 25mg/L ;硫酸銅(CuSSO4 · 5H20)O. 030mg/L、原MS培養基中為O. 025mg/L ;鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L、原MS培養基中為O. lmg/L ;鹽酸毗哆辛(維生素B6) O. 6mg/L、原MS培養基中為O. 5mg/L ;煙酸O. 6mg/L、原MS培養基中為O. 5mg/L ;肌醇120mg/L、原MS培養基中為100mg/L ;氨基己酸5. Omg/L、原MS培養基中為2. Omg/L ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L,脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH = 5· 8ο步驟四將步驟二中獲得的月季試管苗接入上述培養基中，采取變溫培養，前7d散光培養在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉為8:00 20:00恒溫25 V，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養；二倍體開花后重復變溫培養方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉為維持日夜恒溫24°C培養。培養約2 5d后開放。該方法可獲得30%左右的雙層花。第一次試驗共接種122株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株43株；第二次實驗共接種150株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株55株；第一次試驗共接種136株，獲得二倍體和雌蕊單倍體開花的植株42株。應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種月季試管苗試管內開花及雌蕊單性開花的方法，其特征在于，包括以下步驟(I)將適合陜北地區栽種的月季品種“月月紅”當年生的莖段，經過無菌處理接入人工制作的MS培養基中，通過初代培養獲得第一代無根試管苗；然后在MS培養基中加入I. 2mg/L的6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)和O. 15mg/L的3-吲哚丁酸(IBA)，在光照強度為I 5001x±2001x、相對濕度70% ±5%、溫度為24°C的條件下繼代培養25d ;獲得繁殖系數不低于6. 8的無根試管苗； (2)將繼代培養獲得的無根試管苗轉接在不含外源激素的MS培養基上培養6 8d，再轉入含脫落酸和O. 02mg/L的MS培養基中；通過變溫培養，培養條件為前5d在散光照射下培養，溫度維持早晨8:00 14:00持續升溫從18°C到26°C，26°C維持2h，然后逐步降溫從16:00 19:00溫度降到20°C，從19:00至晚上23:00溫度降到12°C，維持12°C至次日8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%。從第6d開始轉為8:00 20:00恒溫25 V，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養； (3)將月季試管苗接入誘導開花的培養基中，采取變溫培養，前7d散光培養在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;從第8d開始轉為8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18 °C，0:00 4:00溫度降到16 °C，維持16 °C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5% ;待形成花苞后維持日夜恒溫24°C培養；二倍體開花后重復變溫培養方式8:00 20:00恒溫25°C，夜間逐步降溫從20:00 0:00溫度降到18°C，0:00 4:00溫度降到16°C，維持16°C至8:00 ;在光照強度為I 5001x±3001x、相對濕度70% ±5%，約5d后由雌蕊形成單性花蕾，轉為維持日夜恒溫24°C培養；培養約2 5d后開放； 所述誘導開花的培養基成分如下氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L，硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L,硫酸鎂(MgSO4. 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L，硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L，硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L，鑰酸鈉(NaZMoO4 · 2H20) O. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸紙卩多辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸O. 6mg/L,肌醇120mg/L,氨基己酸5.Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L, 6-卞氨基腺嘌呤(6_BA)0. 5mg/L,脫落酸(ABA)O. OOlmg/L，3-吲哚乙酸(IBA) O. 2mg/L, pH = 5. 8 ;蔗糖25g/L，瓊脂5. 5g/L，6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ABA) O. 001mg/L，3_ 吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L，pH = 5. 8。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的月季(R.chinensis)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa),在陜北野生的月季花。
3.一種月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花的培養基，其特征在于，所述培養基為氯化鈣(CaCl2 · 2H20)315mg/L,硝酸氨(NH4NO3) 1200mg/L,硝酸鉀(KNO3) 1800mg/L，硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 300mg/L,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 200mg/L,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 29mg/L,己二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA) 40mg/L，硼酸(H3BO3) 20mg/L，硫酸錳(MnSO4 · H2O) 120. Omg/L,硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) 11. Omg/L,鑰酸鈉(NaZMoO4. 2H20)0. 30mg/L,硫酸銅(CuSSO4 · 5H20) O. 030mg/L,鹽酸硫胺素(維生素BI) I. 2mg/L,鹽酸毗哆辛(維生素B6)0. 6mg/L,煙酸 0. 6mg/L,肌醇 120mg/L,氨基己酸 5. Omg/L,鹿糖 25g/L,瓊脂 5. 5g/L,6-卞氨基腺嘌呤(6-BA) O. 5mg/L，脫落酸(ΑΒΑ) 0. 001mg/L，3-吲哚乙酸(IBA)O. 2mg/L, pH=5. 8。
全文摘要
本發明公開了一種月季試管苗試管內開花及雌蕊單性開花的方法及其培養基，包括以下步驟①繼代培養獲得的無根試管苗；②月季無根試管苗二倍體試管內開花；③月季試管苗二倍體花雌蕊誘導開花；該方法可使二倍體試管苗開花率達到50％左右；可使二倍體花和雌蕊單倍體花呈塔式開放并且同時存在20～35d、開花率達到30％左右。
文檔編號A01H4/00GK102870681SQ20121040832
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月22日 優先權日2012年10月22日
發明者齊向英, 陳宗禮, 張向前, 陳國梁, 薛皓, 孫志宏 申請人:延安大學