專利名稱：一種小麥遺傳轉化方法
技術領域：
本 發明涉及ー種小麥遺傳轉化方法，具體來說涉及一種通過抗生素梯度篩選增加小麥遺傳轉化效率的方法。
背景技術：
小麥是世界上最重要的糧食作物之一，是僅次于水稻的第二大糧食作物，在世界各地都被廣泛種植。小麥是我國人民賴以為生的農作物，隨著我國人口的増加和人民生活水平的提高，對小麥的產量和品質也提出了越來越高的要求。傳統的常規育種已經不能滿足對小麥的品種和品質的要求，轉基因技術的發展打破了常規育種的限制，已經成功地在棉花、玉米、大豆、油菜等作物中培育出高產新品種，創造了良好的經濟效益和社會效益。小麥由于轉化效率較低，轉基因株系較難獲得，因而與其它作物相比分子育種相對落后。目前小麥的轉化方法主要有花粉管通道法、基因槍法、農桿菌法、電激轉化法和PEG法。由于小麥原生質體再生困難，所以限制了電激轉化法和PEG轉化法的應用。花粉管通道介導的遺傳轉化是在植物授粉后將外源DNA片段通過花粉管通道導入胚囊，從而整合到受精卵基因組中，然后發育成種子。花粉管通道法簡單易行，但轉化后代性狀變異復雜，后期篩選工作很困難，因而一直沒有被廣泛使用。農桿菌介導的小麥遺傳轉化一直是植物界研究的一道難題。人們對影響農桿菌介導小麥遺傳轉化的因素作了深入廣泛的研究，包括小麥基因型、外植體源、預培養時間、侵染和共培養時間、こ酰丁香酮、農桿菌菌株、載體以及篩選劑等都會影響轉化率。農桿菌法具有轉基因低拷貝、遺傳穩定、能夠轉化相對較大片段DNA以及成本低廉等優點，但存在受基因型限制、對組織培養技術依賴性強、轉化頻率不高以及起始外植體單一等問題，因而應用受到一定的限制。基因槍法是小麥轉化中應用較為廣泛的一種轉化方法。基因槍轉化法是借助高速運動的金屬微粒使附著于其表面的核酸分子穿過受體的細胞壁，釋放出的DNA分子，并且隨機整合到植物基因組中，然后通過組織培養技術再生出植株。

發明內容
本發明的目的是提供ー種小麥遺傳轉化方法，具體來說涉及ー種通過抗生素梯度篩選增加小麥遺傳轉化效率的方法。本發明提供的小麥遺傳轉化方法，包括如下步驟( I)將小麥胚性愈傷組織進行預培養；(2)將含有目的基因的表達載體通過基因槍法導入完成步驟(I)的胚性愈傷組織；所述表達載體含有潮霉素抗性基因；(3)將完成步驟(2)的胚性愈傷組織進行恢復培養；(4)取完成步驟(3)的胚性愈傷組織，在篩選培養基上培養35-55天(可為35-45天、45-55天、35天、45天或55天);所述篩選培養基中含有35_45mg じ1(可為37_43mg じ1、37-40mg じ1、40_43mg じ1、37mg L'40mg じ1 或 43mg Lベ)的潮霉素；
(5)取步驟(4)得到的胚性愈傷組織，在含有35-45mg じ1 (可為37_43mg じ1、37-40mg じ1、40_43mg じ1、37mg じ1、40mg じ1或43mg じ1)潮霉素的分化培養基上培養10-20天(可為10-15天、15-20天、10天、15天或20天)，得到產生芽點的胚性愈傷組織；(6)取步驟(5)得到的產生芽點的胚性愈傷組織，在含有15_25mg じ1 (可為17-23mg じ1、17-20mg じ1、20_23mg じ1、17mg じ1、20mg じ1 或 23mg じ1)潮霉素的分化培養基上培養30-60天(可為30-47天、47-60天、30天、47天或60天)，得到小苗；(7)取步驟(6)得到的小苗，在生根培養基上培養至生根。所述步驟(I)中，所述預培養采用的培養基可為高滲培養基。所述步驟(I)中，所述預培養的條件為25°C黑暗培養4小吋。所述步驟(2)中，所述表達載體可為植物表達載體。所述表達載體具體可為 PUN1301載體、以pUN1301載體為骨架的載體、在PUN1301載體的多克隆位點插入外源基因得到的載體、PCAMBIA1301載體、以pCAMBIA1301載體為骨架的載體或在pCAMBIA1301載體載體的多克隆位點插入外源基因得到的載體。所述步驟(2)中，所述目的基因可為GUS基因。所述步驟(2)中，所述基因槍法的參數可為所述表達載體的濃度為lug/ul，采用
I.Oiim金粉和IlOOpsi可裂膜。所述PUN1301載體的構建方法如下以PCAMBIA1301載體為骨架載體，在其多克隆位點插入序列表的序列I所示的UbiPro (啟動子)和序列表的序列2所示的Noster (終止子)。所述pUN1301載體的構建方法具體如下以PCAMBIA1301載體為骨架載體，將BamHI和HindIII酶切位點之間的小片段替換為了序列表的序列I所示的UbiPix)(啟動子)，將SacI和EcoRI酶切位點之間的小片段替換為了序列表的序列2所示的Noster (終止子)。所述步驟(3)中，所述恢復培養采用的培養基為高滲培養基。所述步驟(3)中，所述恢復培養的條件為25°C黑暗培養12小吋。所述步驟(4)中，所述篩選培養基為在胚性愈傷誘導培養基中加入潮霉素得到的
培養基。所述步驟(4)中，所述培養的條件為25°C黑暗培養，每10-15天更換新的篩選培養基并繼代。所述步驟(5)中所述分化培養基為胚性愈傷分化培養基。所述步驟(5)中，所述培養的條件為25°C，光暗周期為12小時/12小時。所述步驟(6)中所述分化培養基為胚性愈傷分化培養基。所述步驟(6)中，所述培養的條件為25°C，光暗周期為12小時/12小時。所述步驟(7)中，所述培養的條件為25°C，光暗周期為12小時/12小時。所述小麥可為栽培或野生小麥品種、品系、育種材料或中間材料，具體可為小麥品種“京冬I號”或小麥品種“京花9號”。所述步驟(I)中，所述小麥胚性愈傷組織可為擴繁得到的小麥胚性愈傷組織；所述擴繁的方法如下將小麥胚性愈傷組織在胚性愈傷誘導培養基上25°C黑暗培養4-5個月，每2周繼代一次，繼代時均采用胚性愈傷增殖培養基。以上任一所述胚性愈傷誘導培養基的制備方法如下在MS培養基中加入2，4- ニ氯苯氧こ酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2，4-ニ氯苯氧こ酸的濃度為l-2mg じ1 (如
I.5_2mg じ1、I. 5mg じ1 或 2mg じ1)、谷氨酰胺的濃度為 200_700mg じ1 (如 300_700mg じ1、300_500mg *L \500-700mg L \500mg *L \300mg *L 1 或 700mg *L 0、水解酪蛋白的濃度為500-700mg じ1 (如 300-700mg r\300-500mg r\500-700mg L_\500mg U\300mg じ1或 700mg L 1X以上任一所述胚性愈傷增殖培養基的制備方法在MS培養基中加入2，4-ニ氯苯氧こ酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2，4-ニ氯苯氧こ酸的濃度為l-2mg じ1 (如1-1. 5mg じ1、I. 5_2mg じ1、如Img じ1、I. 5mg じ1或2mg じ1)、谷氨酰胺的濃度為200-700mg じ1 (如 300-700mg r\300-500mg r\500-700mg L_\500mg U\300mg じ1 或 700mg じ1)、水解酪蛋白的濃度為 500-700mg じ1 (如 300_700mg r\300-500mg じ1、500_700mg L \500mg L \300mg L 1 或 700mg L 1X以上任一所述高滲培養基的制備方法在所述胚性愈傷誘導培養基中加入甘露醇，使得甘露醇的濃度為0. 3-0. 8mol じ1 (如0. 3-0. 4mol じ1、0. 4-0. 8mol じ1、
0.3mol L \0. 4mol L 1 或 0. 8mol L 1X以上任一所述篩選培養基的制備方法在所述胚性愈傷誘導培養基中加入潮霉素，使得潮霉素的濃度為35-45mg じ1 (可為37-43mg じ1、37_40mg じ1、40_43mg じ1、37mg じ1、40mg じ1 或 43mg じ1)。以上任一所述胚性愈傷分化培養基的制備方法在MS培養基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的濃度為0. 5-4mg じ1 (如I. 5-3mg じ1、
1.5_2mg じ1、2-3mg じ1、I. 5mg L'2mg じ1或3mg じ1、)、水解酪蛋白的濃度為500-700mg じ1 (如 200-500mg r\500-700mg !/1AOOmg L_\200mg じ1 或 700mg じ1)。以上任一所述生根培養基的制備方法在MS培養基中加入a-萘こ酸，使得a-萘こ酸的濃度為0. 5-1. Omg じ1 (如0. 5mg Lベ)。以上任一所述的方法均可用于小麥育種。以上任一所述MS培養基的制備方法具體為按照表I的加入量將各個組分溶于水并用水定容至1し。本發明提供的是ー種利用梯度篩選法提高基因槍法轉化小麥的轉化效率的方法。發明操作簡單易行，轉化效率高，轉化后所得到轉基因小麥幼苗生長狀態良好，具有非常大的實際應用價值和市場推廣前景。


圖I為胚性愈傷誘導培養基上培養4-5個月后得到的愈傷組織的照片；A為照片；B為局部放大的照片。圖2為高滲培養基上培養4小時后愈傷組織的照片。圖3為篩選培養基上培養45天后抗性愈傷組織的照片。圖4為培養基甲上培養15天后產生芽點的胚性愈傷組織的照片；A為照片;B為局部放大的照片。圖5為培養基こ上培養47天時愈傷組織的照片。圖6為生根過程中的小苗的照片。
圖7為移栽至花盆后植株生長過程中的照片。圖8為移栽至花盆后結實植株的照片。圖9為培養基こ或培養基甲上培養3-4周時愈傷組織的照片。圖10為⑶S染色后的照片。圖11為實施例5的照片。圖12為pCAMBIA1301載體的結構示意圖。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法，具體步驟可參見((Molecular Cloning: ALaboratoryManual》(Smaorook, J.，Ressule L., David W.，Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。小麥品種“京冬I號”:參考文獻《新農業》;題目冬小麥新品種——京冬I號；作者翟惠，期卷2003年09期44頁。小麥品種“京花9號”:參考文獻《麥類作物學報》，題目高產優質早熟冬小麥新品種一點花9號；作者劉建平張立全田立平蘇青趙克勇單福華張立平趙昌平；期卷:2008年，28期5卷:921頁。實施例I、培養基的制備本實施例的各個培養基的pH值均為5. 8，配制完成后120°C高壓滅菌20分鐘。一、MS培養基的制備每升MS培養基加入的各個組分及其加入量見表I。表I姆升MS培養基中各個溶質的含量
權利要求
1.一種小麥遺傳轉化方法，包括如下步驟 (1)將小麥胚性愈傷組織進行預培養； (2)將含有目的基因的表達載體通過基因槍法導入完成步驟(I)的胚性愈傷組織；所述表達載體含有潮霉素抗性基因； (3)將完成步驟(2)的胚性愈傷組織進行恢復培養； (4)取完成步驟(3)的胚性愈傷組織，在篩選培養基上培養35-55天；所述篩選培養基中含有35-45mg L—1的潮霉素； (5)取步驟(4)得到的胚性愈傷組織，在含有35-45mg L_1W潮霉素的分化培養基上培養10-20天，得到產生芽點的胚性愈傷組織； (6)取步驟(5)得到的產生芽點的胚性愈傷組織，在含有15-25mg-L^1潮霉素的分化培養基上培養30-60天，得到小苗； (7)取步驟(6)得到的小苗，在生根培養基上培養至生根。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟(I)中，所述預培養采用的培養基為高滲培養基。
3.如權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，所述恢復培養采用的培養基為高滲培養基。
4.如權利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，所述篩選培養基為在胚性愈傷誘導培養基中加入潮霉素得到的培養基。
5.如權利要求I至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(5)和/或所述步驟(6)中，所述分化培養基為胚性愈傷分化培養基。
6.權利要求I至5中任一所述的方法在小麥育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種小麥遺傳轉化方法，具體來說涉及一種通過抗生素梯度篩選增加小麥遺傳轉化效率的方法，包括如下步驟(1)將小麥胚性愈傷組織進行預培養；(2)將含有目的基因和潮霉素抗性基因的表達載體通過基因槍法導入胚性愈傷組織；(3)恢復培養；(4)在篩選培養基上培養35-55天；所述篩選培養基中含有35-45mg·L-1的潮霉素；(5)在含有35-45mg·L-1潮霉素的分化培養基上培養10-20天，得到產生芽點的胚性愈傷組織；(6)在含有15-25mg·L-1潮霉素的分化培養基上培養30-60天，得到小苗；(7)在生根培養基上培養至生根。本發明操作簡單易行，轉化效率高，轉化后所得到小麥幼苗生長狀態良好，具有非常大的實際應用價值和市場推廣前景。
文檔編號A01H4/00GK102952823SQ20121050582
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者種康, 牛遇達, 李春華, 張景昱 申請人:中國科學院植物研究所