本發明涉及了一種月季微繁體系的建立方法，屬于植物遺傳轉化領域，具體地說涉及了一種普通月季的微繁體系建立方法。

背景技術：

月季(Rosa hybrida)在我國已經有1000多年的歷史，主要分為種豐花月季、壯花月季、藤蔓月季、香水月季、灌木月季和月季六大類。2005～2008年三年間，總共831個月季品種在國際上登錄，這當中有豐花月季169個、雜種香水月季204個、小花月季89個、灌叢月季161個、月季106個。在國外，月季在17-18世紀傳入英國和法國。在此之后，歐洲人民將其作為重要種質與薔薇進行雜交，培育出眾多優質的新品種。目前，全世界培育了20000多月季新品種。科學家們經過大量探索，成功培育出多種抗寒、抗旱、抗病的優良月季新品，并進行了改變花色的育種。時至今日，大多數月季種質資源還未曾用于人工育種，其優良性狀還沒有得到挖掘和開發，月季新品種培育因此擁有著巨大的潛力。

為了滿足人們的需要，組織培養技術在上個世紀末應運而生，以此為基礎的轉基因手段為傳統的月季育種提供了一條全新途徑。這種手段可以高效將優良的外源基因轉入到生物體當中并得以表達，同時保持生物體性狀相對的穩定性。穩定的組培體系和基因轉化體系對月季新品種的獲得意義重大，并已獲得重大成就。但目前現有的月季微繁技術并不完善，存在著成花率低，生根率低，成活率低的問題。因此，在微繁殖體系的建立過程中，保證再生植株的成花率，生根率，成活率是我們面臨的重要問題。

技術實現要素：

本發明的目的在于應用植物組織培養技術，在現有技術基礎上，提供一種更加完善完整的月季微繁體系的建立方法，克服月季再生體系成花率低，生根率低，成活率低的問題。

為實現上述目的，本發明所述的月季微繁體系的建立方法中，通過將盆栽月季經過外植體消毒、芽誘導培養、芽增殖培養、花誘導培養、生根培養五個過程，成功的將盆栽月季再生至培養瓶中培養。

該方法具體包括以下步驟：

(1)月季外植體消毒

于花市購買普通月季植株，高20cm-40cm，花色不限；剪取月季當年生健壯枝條，以軟毛刷清除其表面灰塵，置于盛有清水的燒杯中，加少量清洗劑浸泡10min，期間不斷搖動燒杯，流水沖洗1h，Cl₂滅菌20min；在超凈工作臺中用無菌蒸餾水浸泡清洗3次，無菌濾紙吸干；

(2)芽誘導培養

取步驟(1)消毒后的月季枝條，剪取1.5cm-2cm單芽莖段，形態學下端接種于芽誘導培養基中，接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗，培養30d，得無菌苗；其中，所述的芽誘導培養基為MS培養基+噻苯隆(TDZ)+萘乙酸(NAA)+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.1mg/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，pH值為5.83～5.85；

(3)芽增殖培養

取步驟(2)培養30d后的無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種于芽增殖培養基中，每瓶均勻接種4個莖段，接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗，培養45d；其中，所述的芽增殖培養基為MS培養基+TDZ+NAA+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.05mg/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，pH值為5.83～5.85；

(4)花誘導培養

(a)取步驟(3)培養45d后的無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種于花芽誘導培養基中，接種后標注日期，置于智能人工氣候箱中培養40d，獲得叢生芽；培養條件為：25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗；其中，所述花芽誘導培養基為MS培養基+TDZ+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述瓊脂的濃度為7.2g/L，所述蔗糖的濃度為40g/L，pH值為5.83～5.85；

(b)將步驟(a)獲得的叢生芽切取為單叢，接種于芽增殖培養基中，置于人工氣候箱中培養10d，誘導月季開花；培養條件為：25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗；其中，所述芽增殖培養基為MS培養基+TDZ+NAA+活性炭+瓊脂+蔗糖，所述TDZ的濃度為1.0mg/L，所述NAA的濃度為0.1mg/L，所述活性炭的濃度為0.6g/L，所述瓊脂的濃度為7g/L，所述蔗糖的濃度為30g/L，pH值為5.83～5.85；

(5)生根培養

取步驟(4)培養的月季無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種生根培養基中，每瓶均勻接種4個莖段，莖段接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗；其中，所述生根培養基為1/2MS培養基+活性炭1.0g/L+瓊脂7g/L+蔗糖40g/L，所述活性炭的濃度為1.0g/L，所述瓊脂的濃度為7g/L，所述蔗糖的濃度為40g/L，pH值為5.83～5.85。

本發明在微繁體系建立過程中所用到的培養基在配制好后均采用121℃高壓蒸汽滅菌20min，待培養基冷凝至室溫后方可使用。

本發明具有以下優點和積極效果：

1、本發明的月季微繁體系建立中，通過對月季進行外植體消毒、芽誘導培養、芽增殖培養、花誘導培養、生根培養五大過程，成功的將普通盆栽月季再生至培養瓶中微繁培養，并且通過對上述各個過程所需的培養基的不斷調配篩選，找到了各個過程中最適合的培養基，確保在培養瓶中微繁培養的月季成活率高，成花率高，生根率高。

2、本發明的方法較其它微繁體系建立方法相比，所培養的月季成花率與生根率較高，成活率高，為后續的分子生物學研究奠定了基礎，具有巨大的經濟價值。

附圖說明

圖1為花市購買的花色粉紅的月季植株。

圖2為芽誘導過程中月季的生長狀態圖。

圖3為芽增殖過程中月季的生長狀態圖。

圖4為花誘導過程中月季的生長狀態圖。

圖5為生根培養過程中月季的生根情況圖。

圖6為微繁體系建立完成后月季生長狀態圖。

具體實施方式

為使本領域的技術人員清楚明白本發明的技術方案及其優點，下面結合實施案例對本發明作進一步說明：

實施例1

一、培養基的配置

芽誘導培養基(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85；

芽增殖培養基(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L)，pH5.83～5.85；

花誘導過程中的花芽誘導培養基(MS+TDZ 1.0mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖40g/L)，pH5.83～5.85；芽增殖培養基其具體配方為(MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+活性炭0.6g/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L)，pH 5.83～5.85；

生根培養基(1/2MS+活性炭1.0g/L+瓊脂7g/L+蔗糖40g/L)，pH 5.83～5.85。

本發明所述的1/2MS培養基是指將正常MS培養基中的大量元素和微量元素均減少到原來的1/2，具體組成同中國專利CN 104115743B中記載的1/2MS培養基組成一致。

所述MS培養基的配制參照中國專利CN 104115743B中記載的MS培養基的配制方法進行配制。

以上培養基配制好后均采用121℃高壓蒸汽滅菌20min，待培養基冷凝至室溫后，分別用于月季微繁體系建立過程。

二、月季微繁體系建立

(1)月季外植體消毒

于花市購買普通月季植株，高20cm-40cm，花色粉紅；剪取月季當年生健壯枝條，以軟毛刷清除其表面灰塵，置于盛有清水的燒杯中，加少量清洗劑(1滴藍月亮牌洗潔精)浸泡10min，期間不斷搖動燒杯，流水沖洗1h，Cl₂滅菌(1ml濃HCl與25ml NaClO反應生成，具體方法參照中國專利CN 104115743B記載的內容)20min；在超凈工作臺中用無菌蒸餾水浸泡清洗3次，無菌濾紙吸干。

(2)芽誘導培養

取步驟(1)消毒后的月季枝條，剪取1.5cm-2cm單芽莖段，形態學下端接種于芽誘導培養基中，接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗，培養30d，得無菌苗。

(3)芽增殖培養

取步驟(2)培養30d后的無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種于芽增殖培養基中，每瓶均勻接種4個莖段，接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗，培養45d。

(4)花誘導培養

(a)取步驟(3)培養45d后的無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種于花芽誘導培養基中，接種后標注日期，置于智能人工氣候箱中培養40d，獲得月季的叢生芽；培養條件為：25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗；

(b)將步驟(a)獲得的月季叢生芽切取為單叢，接種于芽增殖培養基中，瓶均勻接種4叢，接種100瓶，置于人工氣候箱中培養，培養條件為：25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗。10d后進行統計，其中87瓶有花形成，13瓶未見成花，成花率可達87％。

(5)生根培養

取步驟(4)培養的月季無菌苗，在超凈工作臺中將無菌苗切取為1.5cm-2cm帶節間莖段，形態學下端接種于生根培養基中，每瓶均勻接種4個莖段，接種100瓶，莖段接種后培養條件為25℃，光強2000lx，光周期為16小時光照，8小時黑暗，40d后統計無菌苗生根情況，其中，97瓶生根狀況良好，根系發達，3瓶生根不明顯。最終統計生根生根率可達97％。

對比例1

區別在于步驟(2)芽誘導培養過程中所用的芽誘導培養基為MS+TDZ 0.2mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例2

區別在于步驟(2)芽誘導培養過程中所用的芽誘導培養基為MS+TDZ 0.4mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例3

區別在于步驟(2)芽誘導培養過程中所用的芽誘導培養基為MS+TDZ 0.6mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例4

區別在于步驟(2)芽誘導培養過程中所用的芽誘導培養基為MS+TDZ 0.8mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例5

區別在于步驟(2)芽誘導培養過程中所用的芽誘導培養基為MS+TDZ 2.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例6

區別在于步驟(3)芽增殖培養過程中所用的芽增殖培養基為MS+TDZ 1.0mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例7

區別在于步驟(3)芽增殖培養過程中所用的芽增殖培養基為MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.1mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同。

對比例8

區別在于步驟(3)芽增殖培養過程中所用的芽增殖培養基為MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.2mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同

對比例9

區別在于步驟(3)芽增殖培養過程中所用的芽增殖培養基為MS+TDZ 1.0mg/L+NAA0.5mg/L+瓊脂7.2g/L+蔗糖30g/L，pH 5.83～5.85；其余步驟與實施例1相同

結果：在步驟(2)芽誘導培養過程中，不同TDZ與NAA配比,對月季叢生芽的生長狀況有很大的影響，NAA濃度不變的情況下，設置芽誘導培養基中TDZ濃度梯度分別為0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L，并對芽的高度和節間長度進行差異顯著性分析，如表1所示，在TDZ濃度小于1.0mg/L時，叢生芽的高度均為2.0cm以上，節間長度差異不顯著，當TDZ濃度為2.0mg/L時，叢生芽高度小于2.0cm節間長度較短，與其他濃度下生長狀態差異顯著，當TDZ濃度為1.0mg/L時，叢生芽的高度達3.373cm，節間長度達到了0.238cm，均達到了最大，因此本發明提供了芽誘導過程中TDZ與NAA的最佳濃度配比，并培育出生長狀態良好的叢生芽，以保證最終微繁體系建立完成月季的生長開花狀況最佳。

在步驟(3)芽增殖培養過程中，單芽莖段接種于不同TDZ與NAA配比的芽增殖培養基30d后，對月季組培苗高度進行測量，結果發現：當TDZ濃度不變時，隨著NAA濃度的增加，組培苗高度先增高再降低，當NAA濃度為0.05mg/L時，株高達最大值5.02cm。對月季組培苗節間長度進行測量，結果發現：當TDZ濃度不變時，隨著NAA濃度的增加，組培苗節間長度先增高再降低，當NAA濃度為0.05mg/L時，節間長度達最大值0.40cm。因此本發明提供了芽增殖過程中TDZ與NAA的最佳濃度配比，并培育出生長狀態良好的月季植株，為最終微繁體系建立完成提供了保障。

同時，本發明在花誘導過程中選擇的花芽誘導培養基以及芽增殖培養基均為目前現有的成花率較高的培養基，在生根培養基選擇過程中，也針對最終生根率進行了培養基的選則和活性炭濃度的確定，以保障月季微型繁體系建立后無菌苗的成花率、生根率、成活率。

表1TDZ濃度對叢生芽的影響

表2NAA濃度對月季組培苗株高和節間長度的影響