專利名稱：利用改進(jìn)的目的基因表達(dá)盒進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)化植物的方法，特別涉及一種將目的基因以DNA片段的形式(含有目的基因表達(dá)盒)導(dǎo)入目的植物中的方法。
背景技術(shù)：
基因槍轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化效率高、無(wú)宿主限制、簡(jiǎn)單易操作等優(yōu)點(diǎn)，在小麥轉(zhuǎn)化中得到廣泛應(yīng)用，目前小麥遺傳轉(zhuǎn)68. 8%是采用基因槍轉(zhuǎn)化。而傳統(tǒng)的小麥基因槍轉(zhuǎn)化法多以環(huán)形載體轉(zhuǎn)化為主，導(dǎo)致載體骨架序列伴隨目的基因同時(shí)整合進(jìn)植物基因組，外源片段拷貝數(shù)高，目的基因的低表達(dá)甚至外源基因沉默，同時(shí)，載體框架序列中含有的抗生素抗性基因增加了轉(zhuǎn)基因植物的安全隱患。最近的研究還發(fā)現(xiàn)，載體骨架序列會(huì)引起外源基因發(fā)生不同程度的重排、斷裂，導(dǎo)致遺傳不穩(wěn)定。早在1991年，Artelt等就指出，載體框架結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)基因中都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，因此需要對(duì)經(jīng)典的基因槍法進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新。Uze 等(Uz6, M, Potrykus, I and Sautter, C. Single-stranded DNA in thegenetictransformation of wheat(Triticum aestivum L.): transformation fequencyand intergrationpattern. Theor Appl Genet, 1999，99:487-495)在小麥中比較了 Bar 和GUS基因的環(huán)形質(zhì)粒和最小表 達(dá)框(包括啟動(dòng)子、目的基因編碼序列和終止子)的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果表明線性最小表達(dá)框的轉(zhuǎn)化效率高于環(huán)形載體。然而，目前國(guó)際上用最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因小麥的成功報(bào)道還很有限，如何進(jìn)一步提高最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)的轉(zhuǎn)化效率，提高轉(zhuǎn)化基因的表達(dá)效率及穩(wěn)定性仍然需要研究。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)SAR (Scaffold Attachment Region)可作為DNA的邊界兀件與核基質(zhì)結(jié)合，使兩個(gè)SAR之間的基因片段被界定成一個(gè)獨(dú)立的染色質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而阻擋鄰近染色質(zhì)區(qū)的作用與影響，可以提高外源基因的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)化植物的方法。本發(fā)明所提供的轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將目的基因?qū)肽康闹参镏械牟襟E；所述目的基因是通過如下DNA片段(含有目的基因表達(dá)盒)導(dǎo)入目的植物中的(即導(dǎo)入目的植物中的是線性的DNA片段)5’-核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列-啟動(dòng)子-目的基因-終止子-核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列_3’，即所述DNA片段從上游至下游依次由核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列、啟動(dòng)子、目的基因、終止子和核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列組成。在上述方法中，所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列來(lái)源于煙草(如煙草品種W38)基因組，所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列具體如序列表中序列I所示。所述啟動(dòng)子可為Ubiquitin啟動(dòng)子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述Ubiquitin啟動(dòng)子來(lái)源于載體pAHC25,所述Ubiquitin啟動(dòng)子的序列具體如序列表中序列2所示。所述終止子可為NOS終止子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述NOS終止子來(lái)源于載體pAHC25，所述NOS終止子的序列具體如序列表中序列3所示。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物為小麥，具體為小麥(Triticum aestivumL.)品種科農(nóng)199或濟(jì)麥22。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述目的基因?yàn)镚US基因，所述GUS基因來(lái)源于載體PAHC25 ;在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述目的基因?yàn)镚mDREB3基因。更加具體的，所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GUS基因的序列如序列表中序列5所示。在實(shí)際應(yīng)用中，所述DNA片段是與抗性篩選基因共同導(dǎo)入到所述目的植物中的。所述抗性篩選基因是以抗性基因表達(dá)盒的形式導(dǎo)入所述目的植物中的。所述抗性基因表達(dá)盒自5’端至3’端，依次由啟動(dòng)所述抗性基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子、所述抗性基因，以及終止所述抗性基因轉(zhuǎn)錄的終止子組成。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述抗性基因?yàn)锽ar基因；啟動(dòng)所述Bar基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子為Ubiquitin啟動(dòng)子；終止所述Bar基因轉(zhuǎn)錄的終止子為NOS終止子。在上述方法中，所述轉(zhuǎn)化為基因槍轉(zhuǎn)化。本發(fā)明所提供 的轉(zhuǎn)化植物的方法在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本研究在最小表達(dá)框(啟動(dòng)子-目的基因編碼序列-終止子)兩端加SAR序列。通過轉(zhuǎn)化GUS報(bào)告基因比較了不加SAR序列的線性載體與加SAR序列的線性載體的轉(zhuǎn)化效率及GUS基因的表達(dá)穩(wěn)定性。同時(shí)，采用加SAR序列的線性載體轉(zhuǎn)化抗逆相關(guān)基因GmDREB3，通過PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因小麥中插入片段的完整性，結(jié)果表明，本研究改進(jìn)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)可以提聞小麥基因槍轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)，提聞了目的基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的表達(dá)效率及遺傳穩(wěn)定性，且片段完整性良好。改進(jìn)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)為獲得安全轉(zhuǎn)基因小麥提供了新思路。


圖1為重組表達(dá)載體pS⑶S的酶切鑒定圖。其中，A為KpnI和SpeI雙酶切，泳道I為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL10000，泳道2為pS⑶S質(zhì)粒經(jīng)Kpn1、SpeI雙酶切，泳道3為pS⑶S質(zhì)粒對(duì)照，泳道4為DNA MarkerIII ；B為SacI和BamH I雙酶切，泳道M為DNA Marker III，泳道1-2為pS⑶S質(zhì)粒經(jīng)Sac1、BamHI雙酶切，泳道3為pS⑶S質(zhì)粒對(duì)照。圖2為重組表達(dá)載體pS⑶S中線性片段pS⑶S的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，在與EcoRV相鄰的下游有一個(gè)HindIII酶切位點(diǎn)，在與Kpn I相鄰的上游有一個(gè)Xho I酶切位點(diǎn)未在圖中顯示。圖3為重組表達(dá)載體pSHGmDREB3中線性片段pSHGmDREB3的結(jié)構(gòu)示意圖。其中，在與EcoR V相鄰的下游有一個(gè)Hind III酶切位點(diǎn)，在與Kpn I相鄰的上游有一個(gè)Xho I酶切位點(diǎn)未在圖中顯示。圖4為EcoRI單酶切pAHC25質(zhì)粒結(jié)果。泳道I為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL10000 ;泳道2為pAHC25質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切的結(jié)果；泳道3為pAHC25質(zhì)粒對(duì)照；泳道4為DNA MarkerIII。圖5為獲得轉(zhuǎn)線性片段PS⑶S的轉(zhuǎn)基因小麥的過程。A為培養(yǎng)；B為壯苗；C為移栽。
圖6為Ttl及T1代轉(zhuǎn)線性片段pS⑶S的小麥PCR檢測(cè)結(jié)果(⑶S基因檢測(cè))。其中，A為轉(zhuǎn)線性片段pS⑶S的Ttl代小麥PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道1-2為陽(yáng)性植株，泳道3為陰性對(duì)照，泳道4為受體親本科農(nóng)199，泳道5為質(zhì)粒對(duì)照pAHC25，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000 ；B為轉(zhuǎn)線性片段PS⑶S的T1代小麥PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1_9為陽(yáng)性植株，泳道10為陰性對(duì)照，泳道11為受體親本科農(nóng)199，泳道12為質(zhì)粒對(duì)照pAHC25。圖7為轉(zhuǎn)線性片段PSGUS的小麥不同部位不同時(shí)期GUS報(bào)告基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。其中，A為Ttl代轉(zhuǎn)基因小麥根部染色結(jié)果；B為T1代轉(zhuǎn)基因小麥胚乳染色結(jié)果；C為T1代轉(zhuǎn)基因小麥小花染色結(jié)果。M2-1、M2-2、M2-3、M2-4表示四個(gè)PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因株系，kenongl99為受體親本科農(nóng)199。圖8為轉(zhuǎn)線 性片段pSHGmDREB3的小麥的分子檢測(cè)結(jié)果。其中，A為利用引物GmDREB3-F2和GmDREB3_R2進(jìn)行PCR的檢測(cè)結(jié)果，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1-6為陽(yáng)性株系，泳道7為陰性對(duì)照，泳道8為受體親本濟(jì)麥22，泳道9為質(zhì)粒對(duì)照；B為利用引物DREB3-F1和DREB3-R1進(jìn)行RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1-5為陽(yáng)性株系，泳道6為陰性對(duì)照，泳道7為受體親本濟(jì)麥22，泳道8為質(zhì)粒對(duì)照；C為轉(zhuǎn)線性片段pSHGmDREB3的小麥插入片段5’端完整性檢測(cè)結(jié)果(引物A2和Cl)，泳道M為DNA Markerlll，泳道1_4為陽(yáng)性株系，泳道5為陰性對(duì)照，泳道6為受體親本濟(jì)麥22，泳道7為質(zhì)粒對(duì)照；D為轉(zhuǎn)線性片段pSHGmDREB3的小麥插入片段3’端完整性檢測(cè)結(jié)果(引物BI和D1)，泳道M為DNA Markerlll，泳道1_4為陽(yáng)性株系，泳道5為陰性對(duì)照，泳道6為受體親本濟(jì)麥22，泳道7為質(zhì)粒對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。煙草(Nicotiana tabacum L.)品種W38 :記載在“王衛(wèi)鋒,太帥帥，王魯,劉貫山，李鳳霞，高曉明，孫玉合，煙草NtLS基因RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化，2011，中國(guó)煙草科學(xué)，32 (4):31-35”一文中，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。其生長(zhǎng)條件設(shè)置如下光照長(zhǎng)日照設(shè)為16h光照/8h黑暗，短日照設(shè)為IOh光照/14h黑暗；溫度為21。。。大豆(Glycine max L.)品種鐵豐8號(hào)記載在“邵桂花,常汝鎮(zhèn)，陳一舞，聞淑榮，大豆耐鹽性遺傳的研究，1994，作物學(xué)報(bào)，20 (6):721-726” 一文中，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。小麥(Triticum aestivum L.)品種科農(nóng)199 :記載在“李俊明張相岐張愛民王志國(guó)安調(diào)過紀(jì)軍王靜，高產(chǎn)廣適小麥新品種——科農(nóng)199，2007，麥類作物學(xué)報(bào)，27 (2) :368”一文中，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。小麥(Triticum aestivum L.)品種濟(jì)麥22 :記載在“殷貴鴻李根英何中虎劉建軍王輝夏先春，小麥新品種濟(jì)麥22抗白粉病基因的分子標(biāo)記定位，2009，作物學(xué)報(bào)，35 (8)1425-1431” 一文中，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。載體pBluescriptSK :購(gòu)自 Biovector CO. , LTD 公司，貨號(hào) BiovectorOO8 ；載體pAHC25 :記載在“張志云，張虎生，孫毅，梁愛華，雙價(jià)抗蟲基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建，2004，西北植物學(xué)報(bào)，24 (8) :1402-140”一文中，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)
研究所獲得。實(shí)施例1、含有目的基因表達(dá)盒的重組表達(dá)載體的構(gòu)建一、設(shè)計(jì)引物對(duì)載體pBluescriptSK和pAHC25進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析,根據(jù)不同目的設(shè)計(jì)引物(表I)，而小麥內(nèi)標(biāo)基因 puroindoline-b 序列參考 LI 等(Li Z-ff, Hansen J L, Liu Y, RobertS，Zemetra R S and Berger P H. Using Real-Time PCR to Determine Transgene CopyNumberin Wheat. Plant Mol Biol R印，2004，22:179-188)報(bào)道設(shè)計(jì)引物。表I目的基因片段及其對(duì)應(yīng)擴(kuò)增引物序列
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)化植物的方法，包括將目的基因?qū)肽康闹参镏械牟襟E；所述目的基因是通過如下DNA片段導(dǎo)入目的植物中的 5’ -核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列-啟動(dòng)子-目的基因-終止子-核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列如序列表中序列I所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述啟動(dòng)子為Ubiquitin啟動(dòng)子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述Ubiquitin啟動(dòng)子的序列如序列表中序列2所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于所述終止子為NOS終止子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述NOS終止子的序列如序列表中序列3所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于所述植物為小麥。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述目的基因?yàn)镚US基因，或GmDREB3 基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列4所不；所述GmDREB3基因的序列如序列表中序列5所不。
10.權(quán)利要求1-9中任一所述的方法在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)化植物的方法。該方法包括將如下DNA片段導(dǎo)入目的植物中的步驟5’-核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列-啟動(dòng)子-目的基因編碼序列-終止子-核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列-3’。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)化GUS報(bào)告基因比較了不加SAR序列與加SAR序列的線性載體的轉(zhuǎn)化效率及GUS基因的表達(dá)穩(wěn)定性。同時(shí)，采用加SAR序列的線性載體轉(zhuǎn)化抗逆相關(guān)基因GmDREB3，通過PCR的方法鑒定轉(zhuǎn)基因小麥中插入片段的完整性，結(jié)果表明，本發(fā)明改進(jìn)的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)可提高小麥基因槍轉(zhuǎn)化效率；同時(shí)，提高了目的基因在轉(zhuǎn)基因小麥中的表達(dá)效率及遺傳穩(wěn)定性，且片段完整性良好；本發(fā)明為獲得安全轉(zhuǎn)基因小麥提供了新思路。
文檔編號(hào)A01H5/00GK103045648SQ20121055480
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者陳明, 徐惠君, 馬有志, 徐兆師, 李連城, 蘇瑞波, 杜麗璞 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所