專利名稱：一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病效果的檢驗(yàn)方法，具體涉及一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病效果的簡(jiǎn)易方法，屬于基因功能鑒定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
一般認(rèn)為單細(xì)胞生物的細(xì)菌不存在信息交流的現(xiàn)象，多細(xì)胞生物間才有信息交 流。Nealson等在1970年首次報(bào)道了一種海洋費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)菌體密度與生物發(fā)光呈正相關(guān)，該種菌的發(fā)光行為受細(xì)菌本身的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)所控制。1994年，F(xiàn)uqua首先提出群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)的概念,其定義是指隨著細(xì)菌個(gè)體密度的增大，細(xì)菌產(chǎn)生并向環(huán)境中釋放一種特殊的類似信號(hào)分子的物質(zhì)，當(dāng)這種信號(hào)分子積累到一定量時(shí)，調(diào)控細(xì)菌產(chǎn)生統(tǒng)一的群體行為，如病菌基因的表達(dá)等，這種通過(guò)細(xì)菌信號(hào)分子調(diào)控自身群體行為的現(xiàn)象就稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)菌利用群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控體內(nèi)特定的功能。到目前為止的研究都表明，革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都是通過(guò)信號(hào)分子調(diào)控群體某一特定功能的發(fā)揮，存在群體感應(yīng)調(diào)控系統(tǒng)。研究發(fā)現(xiàn)充當(dāng)細(xì)菌信號(hào)分子的物質(zhì)是一種有機(jī)化學(xué)分子，他是由細(xì)菌自身產(chǎn)生并能通過(guò)一定的途徑進(jìn)入到環(huán)境中。革蘭氏陰性菌利用具有不同酰基側(cè)鏈的高絲氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone, AHL)作為信號(hào)分子。此外，脂肪酸衍生物如3_輕基棕櫚酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester)以及一些順式不飽和脂肪酸(cis-unsaturated fatty acids)也可作為信號(hào)分子。例如青枯菌(Ralstoniasolanacearum)除了產(chǎn)生AHL作為信號(hào)分子外，還可產(chǎn)生的3-羥基棕櫚酸甲酯，來(lái)充當(dāng)信號(hào)分子調(diào)控青枯菌的密度效應(yīng)及增殖。革蘭氏陽(yáng)性菌利用一些寡肽類(AutoinducingP印tide，簡(jiǎn)稱AIP)作為信號(hào)分子感知種內(nèi)自身種群數(shù)量，協(xié)調(diào)多種基因的表達(dá)。還有一類信號(hào)分子是一種呋喃硼酸二聚酯(自體誘導(dǎo)子-2，autoinducer-2，簡(jiǎn)稱AI-2)，這種信號(hào)分子屬于吲哚及其衍生物的高級(jí)結(jié)構(gòu)物。此外，也有報(bào)導(dǎo)稱對(duì)苯二酚和
(S)-3-hydroxytridecan-4-one也是群體感應(yīng)的信號(hào)分子。許多植物病原細(xì)菌通過(guò)群體感應(yīng)信號(hào)分子AHL調(diào)控毒性基因的表達(dá)和毒性因子的產(chǎn)生。病原細(xì)菌對(duì)宿主植物的侵襲主要包括以下3個(gè)階段一是病菌對(duì)植物的侵襲和定殖，其次病原菌致病因子的產(chǎn)生和作用于宿主，最后就是產(chǎn)生對(duì)宿主的免疫抵抗。已有研究發(fā)現(xiàn)致病菌一旦失去了產(chǎn)生群體感應(yīng)信號(hào)分子的能力，則致病性也隨之失去，如果通過(guò)外加信號(hào)分子則又可恢復(fù)其致病性，從而說(shuō)明信號(hào)分子是病菌的致病性關(guān)健。在動(dòng)植物病原菌中表達(dá)異源的AHL內(nèi)酯酶和AHL酰胺酶均能顯著減輕致病菌的致病力，瓦解細(xì)胞密度依賴型細(xì)菌的侵染能力。許多能夠合成AHL內(nèi)酯酶的細(xì)菌如蘇云金芽孢桿菌、熒光假單胞菌等或攜帶外源AHL內(nèi)酯酶基因的工程菌，與致病菌歐文氏胡蘿卜軟腐病菌混合接種馬鈴薯，發(fā)病程度遠(yuǎn)比單獨(dú)接種病原菌的減弱。因此，以病原細(xì)菌QS系統(tǒng)及其信號(hào)分子為靶標(biāo)，干擾和破壞病原細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，能有效地減弱或解除病原細(xì)菌的致病力。這種通過(guò)破壞AHL信號(hào)分子，以干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)的方法被稱為群體粹滅(quorum quenching)。根據(jù)植物對(duì)細(xì)菌QS系統(tǒng)的反應(yīng)，培育產(chǎn)生AHL降解酶的轉(zhuǎn)基因植物，進(jìn)而猝滅病菌的群體感應(yīng)，提高植物抗病性。實(shí)驗(yàn)研究已表明該方法可有效地減弱病原細(xì)菌的致病力，提高寄主植物的抗病性。Dong等從Bacillus 240B1菌株中克隆到了世界上第一個(gè)AHL內(nèi)酷酶(acyl-homoserine lactonase, AHL-Iactonase)基因aii兒該基因的編碼產(chǎn)物為一種可以水解AHL內(nèi)酯鍵的酶，當(dāng)植物中表達(dá)AHL內(nèi)酯酶時(shí)，可水解信號(hào)分子AHL的內(nèi)酯鍵，從而鈍化AHL的活性，破壞病原細(xì)菌群體感應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，降低其致病能力。接著Lin等又在雷爾氏屬細(xì)菌也發(fā)現(xiàn)了存在這種類似基因，該基因編碼產(chǎn)物為酰基轉(zhuǎn)移酶，這種酶通過(guò)水解AHL酰胺鍵后鈍化AHL信號(hào)分子的活性。Park等從鏈霉菌中成功克隆了能產(chǎn)生降解AHL酶的基因ahlM,當(dāng)AhlM蛋白與銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)，能夠顯著抑制銅綠假單胞菌毒性因子的產(chǎn)生。Chen等從青枯菌GMI1000菌株中成功克隆了一個(gè)酰基轉(zhuǎn)移酶基因，并對(duì)其功能的研究表明，基因原核表達(dá)產(chǎn)物能顯著降低混合接種菌株的致病力。邱健等發(fā)現(xiàn)AiiA蛋白可以顯著降低胡蘿卜軟腐病菌胞外蛋白的產(chǎn)量，也能夠降解8種AHL信號(hào)分子。張霞等將aid基因轉(zhuǎn)入到一種熒光假單胞菌P303中，構(gòu)建一種工程菌，該工程菌還對(duì)馬鈴薯軟 腐病和大白菜軟腐病都有一定的抑制作用。張爭(zhēng)等用PCR擴(kuò)增獲得青枯菌GMI1000菌株的aac基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體后，經(jīng)在大腸桿菌中表達(dá)得到AAC融合蛋白，將AAC融合蛋白與胡蘿卜軟腐歐氏桿菌混合后，接種于馬鈴薯塊莖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AAC融合蛋白能顯著降低病菌的致病力。綜上所述，關(guān)于病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病功能的檢測(cè)，未見(jiàn)直接與致病的青枯菌混合接種植株來(lái)檢量其抗病效果的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目前是提供一種病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病功能的簡(jiǎn)易檢測(cè)方法，以篩選有效的病原菌群體猝滅基因，應(yīng)用于抗病轉(zhuǎn)基因育種研究。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病效果的簡(jiǎn)易方法，包括以下步驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉(zhuǎn)速搖菌12 h，然后再取5 μ L菌液接種到含100 yg* mL—1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉(zhuǎn)速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時(shí)，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min,將離心管中沉淀菌體重懸于預(yù)冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,取上清液備用；
2、將青枯菌畫(huà)線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無(wú)菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達(dá)重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹(shù)苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進(jìn)行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，對(duì)照植株接種青枯菌24 h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、葉片下垂，澆水不能減輕缺水癥狀，而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無(wú)明顯的感病癥狀，說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。由于采用了上述的方法，本發(fā)明具有下述的有益效果本發(fā)明所采用的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，容易實(shí)施。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I 一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉(zhuǎn)速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉(zhuǎn)速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時(shí)，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預(yù)冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫(huà)線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無(wú)菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達(dá)重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹(shù)苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進(jìn)行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，對(duì)照植株接種青枯菌24h后，表現(xiàn)出輕微的缺水跡象，頂端葉片萎蔫、葉片下垂，燒水不能減輕缺水癥狀。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無(wú)異常癥狀出現(xiàn)，說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。實(shí)施例2
一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉(zhuǎn)速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉(zhuǎn)速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時(shí)，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預(yù)冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫(huà)線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落，挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無(wú)菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達(dá)重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹(shù)苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進(jìn)行灌根接種，72 h后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，對(duì)照植株接種青枯菌72h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、枝條下垂，幼葉卷曲，燒水不能減輕缺水癥狀。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無(wú)明顯的感病癥狀，說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。實(shí)施例3
一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，具體包括以下步
驟
1、取50μ L含病原菌 群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌接種至到5 mL含100 Ug -πιΓ1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉(zhuǎn)速搖菌12 h。然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g -πιΓ1 Amp5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉(zhuǎn)速搖至菌液0D600為O. 6^1. O時(shí)，加入終濃度為O. 4 mmol *L_1的IPTG,誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h,室溫下8，000 rpm離心5 min。將離心管中沉淀菌體重懸于預(yù)冷的PBS 溶液(150 mmol NaCl, 16 mmol Na2HPO4,4 mmol NaH2PO4, pH 7· 3)中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min,用上清液備用；
2、將青枯菌畫(huà)線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落。挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8cfu · mL-1的菌懸液備用；
3、將漂洗干凈的組培苗置于高錳酸鉀溶液中浸泡30秒，取出后，用無(wú)菌水漂洗；分別取上述步驟I中的原核表達(dá)重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹(shù)苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進(jìn)行灌根接種，7天后觀察植株病癥情況；
4、以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，對(duì)照植株接種青枯菌7天后，大部分幼葉枯黃，整個(gè)植株萎蔫。而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，僅有頂端幼葉表現(xiàn)輕微失水癥狀；說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。總之，本發(fā)明雖然例舉了上述優(yōu)選實(shí)施方式，但是應(yīng)該說(shuō)明，雖然本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以進(jìn)行各種變化和改型，除非這樣的變化和改型偏離了本發(fā)明的范圍，否則都應(yīng)該包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，其特征在于包括以下步驟(1)原核表達(dá)重組蛋白液的制備取50μ L含病原菌群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌接種至到5 mL含100 μ g *mL_1 Amp的LB培養(yǎng)液中，160 rpm轉(zhuǎn)速搖菌12 h;然后再取5 μ L菌液接種到含100 μ g · mL-1 Amp 5 mL LB培養(yǎng)液中，200rpm轉(zhuǎn)速搖至菌液0D600為O. 6 I. O 時(shí)，加入終濃度為O. 4 mmol · Γ1的IPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)9 h，室溫下8，000 rpm離心5 min ;將離心管中沉淀菌體重懸于預(yù)冷的PBS溶液中，用超聲破碎法破碎菌體4 min, 12, 000 rpm離心10 min，取上清液備用；(2)青枯菌液的制備將青枯菌畫(huà)線于含放線菌酮Ig· L—1，新霉素2 g · L—1的TTC培養(yǎng)基，分離出紅色和白色菌落；挑白色致病性青枯菌單菌落于Tm培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再將培養(yǎng)液稀釋成含菌量IO8 cfu · mL-1的菌懸液備用；(3)灌根接種分別取上述步驟I中的原核表達(dá)重組蛋白液與上述步驟2中的青枯菌液各2毫升混合，用尖頭鑷子傷根處理I月苗齡桉樹(shù)苗后，在離植株莖基部3-5cm處土壤中注射上述混合液4mL進(jìn)行灌根接種，24 h后觀察植株病癥情況；(4)對(duì)照試驗(yàn)以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，對(duì)照植株接種青枯菌24h后，表現(xiàn)出缺水跡象，植株萎蔫、葉片下垂，澆水不能減輕缺水癥狀；而混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無(wú)明顯的感病癥狀，說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，其特征在于所述的PBS溶液中NaCl含量為150 Him0LNa2HPO4的含量為16 mmol, NaH2PO4 的含量為 4 mmol。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病能力的簡(jiǎn)易方法，其特征在于所述的PBS溶液的pH值為7. 3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢驗(yàn)病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物抗病效果的簡(jiǎn)易方法，屬于基因功能鑒定技術(shù)領(lǐng)域，包括原核表達(dá)重組蛋白液的制備、青枯菌液的制備、灌根接種、對(duì)照試驗(yàn)等步驟含病原菌群體猝滅基因的陽(yáng)性重組菌經(jīng)過(guò)接種、培育、破碎、離心等過(guò)程處理后得到原核表達(dá)重組蛋白上清液；將青枯菌分離出白色致病菌落，培養(yǎng)后稀釋成含菌量108cfu·mL-1的菌懸液；取上述原核表達(dá)重組蛋白液青枯菌液混合后，進(jìn)行灌根接種；以只接種等量青枯菌的桉樹(shù)苗做對(duì)照，混合接種青枯菌與AIIA蛋白的植株形態(tài)正常、枝葉挺拔，無(wú)明顯的感病癥狀，說(shuō)明病原菌群體猝滅基因原核表達(dá)產(chǎn)物有效降低青枯菌的致病力，延緩植株病癥的發(fā)生；該檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，容易實(shí)施。
文檔編號(hào)A01G7/06GK102972220SQ201210528570
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月11日
發(fā)明者歐陽(yáng)樂(lè)軍, 黃真池, 曾富華, 李莉梅, 李恒 申請(qǐng)人:湛江師范學(xué)院