專利名稱：一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法
技術領域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術領域，尤其涉及的是一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法。
背景技術：
單倍體加倍技術是利用化學、物理方法使單倍體細胞染色體變?yōu)闉槎扼w細胞，目前，化學加倍方法應用得最為普遍，主要利用細胞有絲分類抑制劑抑制紡錘絲的形成過程。在玉米上，目前開展的研究主要集中在秋水仙素和4種除草劑(甲基胺草磷、炔苯酰草胺、氟樂靈和氨磺靈)加倍玉米單倍體。加倍方法包括浸芽、浸種和滴心處理等，涉及相應的化學試劑處理濃度和處理時間等因素也不相同，加倍效果也不盡一致。參考陳紹江等，《玉米單倍體育種技術》，主要有以下缺點1)處理時間較遲，加倍效果較差；2)處理濃度較大，藥品耗量較多；3)加倍效果不明顯
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是針對現(xiàn)有技術的不足提供一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法。本發(fā)明的技術方案如下一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法，挑選單倍體誘導系授粉后28天左右單倍體籽粒幼胚，將挑選的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在處理濃度為60 u mol/L以下，處理2h。該技術在單倍體早期進行化學加倍，使得化學處理時間縮短，處理濃度降低，化學藥品消耗減少，對處理人員人身傷害較小，最重要的是提高單倍體加倍效率。


圖1為顯微鏡視野下確定二倍體細胞與單倍體細胞的數(shù)目。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。1.幼胚顯色及籽粒挑選誘導系誘導母本產(chǎn)生單倍體過程，涉及到籽粒胚頂和胚的顯色過程，只有在幼胚生長至一定時間，其顯色才會明顯和充分，否則將無法進行挑選和加倍處理。本試驗首先從授粉后15天開始取樣觀察、每隔2天觀察一次，直到種子成熟。通過觀察，我們發(fā)現(xiàn)在誘導系授粉后22天至25天，玉米籽粒開始顯色，直到28天左右，顯色較為充分，能夠很明顯地區(qū)分單倍體種子和非單倍體種子。因此，在材料選擇上，我們選取誘導系授粉后27天左右的單倍體胚作為研究材料進行進一步的分析。2.單倍體幼胚挑選(材料)
挑選單倍體誘導系授粉后28天左右單倍體籽粒幼胚，這個時候的胚還未完全成熟，分化能力較強，與非單倍體(紫色胚尖)區(qū)別明顯(無紫色)，胚圓潤光滑，便于挑選。3.化學加倍試劑選擇和處理濃度、時間的優(yōu)化(I)試劑類型本試驗采用了 4種常用的玉米單倍體加倍除草劑，即甲基胺草磷(APM)、炔苯酰草胺、氟樂靈和胺磺靈。試劑均采購于美國西格瑪(Sigma)公司，色譜純標準品。(2)試劑原液配制稱取相應除草劑標準品首先溶解于IOml 二甲基亞砜(DMSO)溶液中，至固體粉術充分溶解后加入適量的蒸餾水配制為8000 u mol/L的母液，裝入棕色玻璃瓶中備用。(3)處理濃度的選擇將上述4 中除草劑母液配制成濃度 5 V- mol/L、10 u mol/L、20 u mol/L、40 u mol/L、60 u mol/L和80 u mol/L的濃度，分別裝入棕色玻璃瓶中備用。(4)處理時間的設置設置處理5min、30min、60min(Ih)和2h 4個處理時間。每個試劑、每種處理濃度均按照7個處理時間進行設置。4.幼胚處理將挑選的幼胚放置于不同除草劑、不同處理濃度和不同處理時間下的培養(yǎng)皿中進行浸泡，浸泡完畢后用無菌水 沖洗I 2小時，沖洗后接種于裝有全營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中進行催芽。5.細胞學檢測待單倍體處理后的胚生長至I 2cm長時，取牙尖檢測細胞染色體數(shù)目，在一個顯微鏡視野下確定二倍體細胞與單倍體細胞的數(shù)目(參考圖1，圖1中為一個視野下的細胞數(shù)目，其中包含有加倍成功的二倍細胞(20條染色體，右下角)和未加倍成功的單倍體細胞(10條染色體，右中)，統(tǒng)計二倍體細胞占整個視野細胞的比例，可以在一方面反映出該處理的加倍效果。)，從而計算二倍體細胞占整個視野細胞的比例。從一定水平上反映出各處理試劑在不同濃度和處理時間下的染色體加倍效果。6.散粉情況和結實率統(tǒng)計玉米單倍體加倍成功與否，在很大程度取決于雄花的散粉情況和結實率，因此，判斷某種處理是否優(yōu)劣，需要通過單倍體收獲后的籽粒結實率來反應。將上述(4幼胚處理)處理后的幼苗移栽至大田，管理措施與其他加倍方法一致，以浸芽法和滴心法為對照，通過結實率對比以上方法在加倍玉米單倍體中的效果。應用效果1.各處理對玉米胚的致死率通過對不同除草劑類型、處理濃度和處理時間下的優(yōu)化設計，我們發(fā)現(xiàn)在甲基胺草磷、炔苯酰草胺在處理濃度為60 u mol/L以下，處理2h均對幼胚不造成傷害，而氟樂靈和胺磺靈在濃度40 y mol/L以上，處理30分鐘后便會對幼胚造成傷害，致死率較高。具體情況見下表表1:正交優(yōu)化設計處理下對幼胚生長的影響(致死率，％ )
權利要求
1.一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法，其特征在于，挑選單倍體誘導系授粉后28天左右單倍體籽粒幼胚，將挑選的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在處理濃度為60 u mol/L以下，處理2h0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種化學加倍玉米單倍體幼胚的處理方法，挑選單倍體誘導系授粉后28天左右單倍體籽粒幼胚，將挑選的幼胚放置于甲基胺草磷、炔苯酰草胺在處理濃度為60μmol/L以下，處理2h。該技術在單倍體早期進行化學加倍，使得化學處理時間縮短，處理濃度降低，化學藥品消耗減少，對處理人員人身傷害較小，最重要的是提高單倍體加倍效率。
文檔編號A01H1/08GK103053413SQ20121057150
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月16日 優(yōu)先權日2012年12月16日
發(fā)明者林海建, 張志明, 蘭海, 沈亞歐, 潘光堂 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學