專利名稱：分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞原代細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種高低密度法分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞原代細胞的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細胞具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，細胞替代治療可以治療帕金森氏病、杭廷頓氏舞蹈病和阿耳茨海默氏病等神經(jīng)退行性疾病以及腦卒中、腦外傷等引起的神經(jīng)功能缺失，神經(jīng)干細胞作為基因治療的載體，可以治療帕金森氏病、粘多糖病和顱內(nèi)腫瘤等。但是， 神經(jīng)干細胞的研究目前尚處于初期階段，有許多問題還沒有得到解決，如神經(jīng)干細胞如何在體內(nèi)和體外定向分化為我們需要的某種特定的神經(jīng)細胞，體外分離得到的神經(jīng)干細胞與體內(nèi)的是否有差異等等，這些都需要進一步的研究。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)和研究是近十年來神經(jīng)生物學領(lǐng)域最重要的進展之一，近年來不斷有實驗發(fā)現(xiàn)人胚腦和其它哺乳類動物一樣存在具有自我更新和廣泛分化潛能的神經(jīng)干細胞，如何快速有效地分離培養(yǎng)出人胚神經(jīng)干細胞并長期傳代擴增是進一步研究神經(jīng)干細胞的前提條件。由于胚齡越大，神經(jīng)干細胞越難分離培養(yǎng)，以往學者[1，2]常用小胚齡胚胎(7 9周)分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，而大胚齡胚胎神經(jīng)干細胞的分離和培養(yǎng)的研究則較少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明應(yīng)用高、低密度培養(yǎng)法從13周齡人胚胎大腦皮層中分離和培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，并用免疫熒光法予以鑒定。具體的，本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的方法步驟包括Sl 原代細胞的分離培養(yǎng)取13周水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，加入含 B27(l 50) (GibcoBRL)和 EGF(Serotec) 20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ml 的 DMEM/ F12(l D(GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為IXlO7/ ml，將原代細胞短暫貼壁2次去除成纖維細胞，分別種植于未包被的25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C，5% C02條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)方法分為懸浮細胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細胞法，懸浮細胞培養(yǎng)法7天后首次換液時重新計數(shù)活細胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。我們采用的貼壁細胞培養(yǎng)法與通常貼壁細胞培養(yǎng)法有所不同，每次換液時吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。S2 神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)。采用嚴格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于350 500 μ m)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 μ m)不作處理繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長情況7 10天傳代一次，方法同前。
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S3.單細胞定點動態(tài)觀察克隆形成在貼壁細胞培養(yǎng)法中挑選散在的出現(xiàn)明顯增大具有強折光性的細胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號筆分別標記，動態(tài)定點觀察并照相記錄。當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用自制玻璃微管(內(nèi)徑約250 500 μ m) 逐個吸出克隆球進行分化試驗。S4.誘導分化培養(yǎng)將以上獲得的來自單細胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清終止后分別種植于直徑315cm預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用有血清培養(yǎng)基DM EM/ F12+5% Fcs進行分化培養(yǎng)。S5.免疫熒光法檢測將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行免疫熒光檢測。經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7和14天行免疫熒光檢測。每個培養(yǎng)皿用油性記號筆畫五個圈，分別用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白對照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。神經(jīng)干細胞傳代時， 培養(yǎng)基中加入Brdu (5 μ mol/L)，連續(xù)傳代兩次后種入包被的小培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)12小時后行免疫熒光檢測。本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代細胞懸浮培養(yǎng)法，可以快速形成克隆球，克隆球開始形成時間比維持低密度培養(yǎng)明顯提前，并且生長迅速。而一旦進入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時降低密度， 以避免高密度的抑制作用。


通過下面結(jié)合附圖的詳細描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的方法步驟流程圖；圖2所示為本發(fā)明的分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的步驟流程圖。
具體實施例方式主要實驗儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備公(Olympus CK40)，熒光顯微鏡 (Olympus B)(51)，CO2培養(yǎng)箱(REVCO)，75cm2培直徑培養(yǎng)皿(Corning，NY)。細胞培養(yǎng)試劑和培養(yǎng)液的配制DMEM/F12B27 (Gibco)、EGF(Serotec)和 bFGF (Chemicon International)、 胎牛血清(Gibco)。有血 DM EM/F12(1 1)+5 % Fcs，無血清培 DMEM/F12 (1 1)+5 % Fcs+EGF(20ng/ml)+bFGF(20ng/ml)。免疫熒光抗體一抗為抗 Nestin Ig G(BD 抗神經(jīng)元特異性抗原(NSE)Ig G(An2tibody Diagnostica Inc)、抗膠質(zhì)細胞特異性抗原(GFAP) Ig G (Bio Genx)、抗少突膠質(zhì)細胞特異性抗(CN P) Ig G (Chemicon)、Brdu 和 Anti Brdu (Sig ^ 光二抗(Sigma)。所述高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的方法包括如下步驟Si:原代細胞的分離培養(yǎng)(如圖2所示的步驟)取13周水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液，經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，加入含 B27(l 50) (GibcoBRL)和 EGF(Serotec) 20ng/ml、bFGF (Chemicon) 20ng/ml的DMEM/F12(1 1) (GibcoBRL)無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞，調(diào)整細胞濃度為1 XlO7Ail，將原代細胞短暫貼壁2次去除成纖維細胞，分別種植于未包被的25cm2培養(yǎng)瓶(8ml細胞懸液/瓶)，37°C，5%C02條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)方法分為懸浮細胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細胞法，懸浮細胞培養(yǎng)法7天后首次換液時重新計數(shù)活細胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。我們采用的貼壁細胞培養(yǎng)法與通常貼壁細胞培養(yǎng)法有所不同，每次換液時吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。S2 神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)原代細胞培養(yǎng)出現(xiàn)大量懸浮克隆球后進行傳代培養(yǎng)。采用嚴格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于350 500 μ m)切成數(shù)塊，小克隆球(小于100 μ m)不作處理繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)克隆球生長情況7 10天傳代一次，方法同前。S3.單細胞定點動態(tài)觀察克隆形成在貼壁細胞培養(yǎng)法中挑選散在的出現(xiàn)明顯增大具有強折光性的細胞，在培養(yǎng)瓶底面用記號筆分別標記，動態(tài)定點觀察并照相記錄。當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用自制玻璃微管(內(nèi)徑約250 500 μ m) 逐個吸出克隆球進行分化試驗。S4.誘導分化培養(yǎng)將以上獲得的來自單細胞的克隆球用胰酶消化和胎牛血清終止后分別種植于直徑3. 5cm預先用多聚賴氨酸包被的小培養(yǎng)皿中，用有血清培養(yǎng)基DM EM/ F12+5% Fcs進行分化培養(yǎng)。S5.免疫熒光法檢測將上述獲得的克隆球種入包被的小培養(yǎng)皿，用無血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12小時后行免疫熒光檢測。經(jīng)分化培養(yǎng)后的細胞分別于2、7和14天行免疫熒光檢測。每個培養(yǎng)皿用油性記號筆畫五個圈，分別用抗Nestin Ig G、抗N SEIg G、抗GFAP IgG、抗CNP IgG和空白對照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。神經(jīng)干細胞傳代時， 培養(yǎng)基中加入Brdu (5 μ mol/L)，連續(xù)傳代兩次后種入包被的小培養(yǎng)皿，貼壁培養(yǎng)12小時后行免疫熒光檢測。實驗結(jié)果及分析如下一、原代細胞培養(yǎng)結(jié)果1.懸浮細胞培養(yǎng)法原代細胞聚集成團塊狀，1周時團塊中可形成少量小克隆球， 首次換液后可見克隆球增多并逐漸長大，有少量小克隆球可以從細胞團塊中游出，2周時已經(jīng)有大克隆球(大于200 μ m)形成，單克隆球周圍仍吸附有許多其它細胞，一般經(jīng)過三次傳代后可以得到純的克隆球。2.貼壁細胞法首次換液后，發(fā)現(xiàn)每高倍視野(倒置顯微鏡X 100倍)下大約有 200個細胞貼壁，其中處于有絲分裂期的極強折光性大細胞平均大約有5個，少數(shù)散在的貼壁細胞出現(xiàn)分化現(xiàn)象；培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)又有新的極強折光性大細胞形成，數(shù)量增多至每高倍視野下大約有20個，其中大量未分裂的原代細胞和出現(xiàn)分化的細胞開始死亡并脫落；培養(yǎng)3周后，未分裂的原代細胞基本已經(jīng)脫落干凈，此時已經(jīng)有極強折光性大細胞開始形成緊密小克隆球(大約5 20個細胞組成，直徑約40 60 μ m)，培養(yǎng)4周后，已有大量大小不等的克隆球形成)，許多大克隆球(直徑約200 350 μ m)已脫壁懸浮生長，克隆球周圍無其它細胞吸附。二、神經(jīng)干細胞傳代培養(yǎng)結(jié)果
在傳代培養(yǎng)中，我們發(fā)現(xiàn)克隆球相當緊密，吸管機械吹打不能將克隆球分散，用胰酶消化雖能制成單細胞懸液，但有大量細胞死亡或出現(xiàn)分化，傳代比較困難。用機械法將大克隆球分割成數(shù)塊，小克隆球繼續(xù)培養(yǎng)，可以長期傳代培養(yǎng)。三、單細胞克隆結(jié)果極強折光性細胞經(jīng)標記后定點動態(tài)觀察，能清楚地觀察從單個細胞逐漸分裂增殖形成克隆球，無其它細胞吸附聚集現(xiàn)象，克隆球用微管吸出分離后活力仍很旺盛。四、誘導分化結(jié)果在DMEM/F12+5%FcS有血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，12小時后即可見部分細胞貼壁并有短小突起伸出，2天后可見大部分細胞貼壁生長，形態(tài)不規(guī)則，突起不斷增粗和伸長，1周后分化成形態(tài)不一的、分散成片的多突起星狀細胞和神經(jīng)元樣細胞，突起互相交織成網(wǎng)狀，2周后有部分細胞出現(xiàn)逐漸衰退和死亡。五、免疫熒光檢測結(jié)果貼壁的克隆球呈Nestin抗原陽性，同時NSE、GFAP和CNP免疫熒光染色均呈陰性。 分化細胞在不同時間點均檢測到NSE、GFAP和CNP陽性細胞，Nestin免疫熒光染色在7天時可見部分陽性細胞，2周后幾乎未找到Nestin陽性細胞。Brdu標記表明克隆的大部分細胞為Brdu陽性細胞。由于人們對神經(jīng)干細胞的認識還不夠全面和深入，目前神經(jīng)干細胞尚無準確的定義，一般認為神經(jīng)干細胞終身具有自我更新能力和多分化潛能，能通過對稱和不對稱分裂進行增殖，損傷或疾病能刺激干細胞分化。本發(fā)明在實驗中分離純化的干細胞能夠不斷分裂增殖，并通過定點動態(tài)觀察，可以完整地記錄從單個細胞分裂增殖形成克隆球的經(jīng)過，應(yīng)用Brdu標記可以進一步說明神經(jīng)干細胞的分裂增殖能力；來自單個細胞的克隆球進行誘導分化后同時行神經(jīng)元特異性抗原(NSE)、膠質(zhì)細胞特異性抗原(GFAP)和少突膠質(zhì)細胞特異性抗原(CNP)免疫熒光檢測，均有陽性表達，其中GFA P陽性細胞最多，說明具有多分化潛能；目前人們將神經(jīng)干細胞表達的一種中間絲蛋白-神經(jīng)巢蛋白(Nestin)作為神經(jīng)干細胞的特征性生物學標記，我們分離出的神經(jīng)干細胞檢測均呈Nestin陽性表達，并發(fā)現(xiàn)分化過程中，表達逐漸減少和消失。本發(fā)明中，我們應(yīng)用先高密度(lX107ml)后降低密度(lX105/ml)的原代細胞懸浮培養(yǎng)法，1周后即可以形成克隆球，克隆球開始形成時間比維持1X IO5Ail密度培養(yǎng)O周時開始形成克隆球)明顯提前，并且生長迅速。可能是體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞要進入有絲分裂期需要有其它細胞的相互作用，一旦進入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時降低密度，以避免高密度的抑制作用。由于克隆球周圍吸附其它細胞，所以必須經(jīng)過幾次傳代后才能純化。神經(jīng)干細胞具有一定的貼壁能力，在形成克隆球并長大至200 μ m前，能夠一直保持貼壁狀態(tài)，這有利于貼壁細胞培養(yǎng)法在不改變細胞培養(yǎng)環(huán)境狀態(tài)下動態(tài)觀察從單個干細胞分裂增殖形成克隆球的全過程。原代細胞應(yīng)用開始高密度(lX107ml)而后密度逐漸遞減的貼壁培養(yǎng)法開始形成克隆球的時間較晚，可能與神經(jīng)干細胞密度依賴性有關(guān)，一旦開始形成克隆球，生長速度明顯加快，大約4周時即可以得到大量克隆球。首次培養(yǎng)時使用高密度，神經(jīng)干細胞和其它細胞一樣有較多數(shù)量貼壁，每次換液去除懸浮起的活力下降或死亡的細胞，細胞密度逐漸下降，大約3周時，貼壁細胞密度大約在IX (IO3 IO5)/ml左右， 神經(jīng)干細胞仍能較好地分裂增殖并形成克隆球。貼壁培養(yǎng)法可以準確地觀察從單細胞至克
6隆球的全過程，得到的克隆球周圍無其它細胞的吸附，無需傳代純化，結(jié)合在培養(yǎng)瓶底面標記和微管吸取技術(shù)，可以得到來自單細胞的克隆球。 本發(fā)明并不局限于所述的實施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護范圍以權(quán)利要求書限定的范圍為準。
權(quán)利要求
1.一種分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的方法，其包括如下步驟取大胚齡水囊引產(chǎn)的新無菌條件下分離出大腦皮層組織，剝除腦分成小塊后在PBS液中漂洗三次洗去血細胞，用細吸管輕柔吹打至組織碎塊完全散開，離心洗滌后吹打制成懸液；使用200目尼龍濾網(wǎng)過濾，制成單細胞懸液，無血清培養(yǎng)基，臺盼藍染色計數(shù)活細胞， 調(diào)整細胞濃度為1 X IOVml ；以及將原代細胞短暫貼壁2次去除成纖維細胞，分別種植于未包被的培養(yǎng)瓶，37°C，5% CO2 條件下靜置培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的方法，其中所述培養(yǎng)方法包括懸浮細胞培養(yǎng)法和貼壁培養(yǎng)細胞法。
3.如權(quán)利要求2所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的方法，其中所述懸浮細胞培養(yǎng)法是在高細胞密度培養(yǎng)7天后首次換液時重新計數(shù)活細胞，以1 X 105/ml密度分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求2所述的分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的方法，其中所述貼壁細胞培養(yǎng)法在每次換液時吸取上懸液離心后加新鮮培養(yǎng)基種入新的培養(yǎng)瓶，原瓶中僅保留貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明提出一種分離及培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的原代細胞的方法，其應(yīng)用于大胚齡人神經(jīng)干細胞的培養(yǎng)過程，所述神經(jīng)干細胞培養(yǎng)過程的步驟包括原代細胞的分離及培養(yǎng)；神經(jīng)干細胞的傳代培養(yǎng)；單細胞定點動態(tài)觀察克隆形成；誘導分化培養(yǎng)；以及免疫熒光法檢測。本發(fā)明的高低密度法分離培養(yǎng)大胚齡人神經(jīng)干細胞的方法，先采用高密度，后降低密度的原代細胞懸浮培養(yǎng)法，可以快速形成克隆球，克隆球開始形成時間比維持低密度培養(yǎng)明顯提前，并且生長迅速。而一旦進入有絲分裂期形成克隆球，則必須及時降低密度，以避免高密度的抑制作用。
文檔編號C12N5/0797GK102443569SQ201110447680
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者吳衛(wèi)江 申請人:吳衛(wèi)江