專利名稱：一種云芝菌株以及利用其發酵產物提取云芝葡聚糖的方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，特別是本發明提供一種新的云芝菌株，以及利用該菌株的發酵產物提取云芝葡聚糖的方法。
背景技術：
云芝葡聚糖具有多種生物活性，研究表明其具有顯著的抗腫瘤、抗潰瘍、保肝護肝、抗病毒、降血脂和免疫調節作用，被廣泛應用于臨床。目前的云芝葡聚糖均是從現有的云芝菌株的發酵產物中提取獲得的，并且目前通常采用例如水浸提法、酸提法和堿提法等常規的提取工藝。在采用現有的云芝菌株以及現有的提取工藝中，所提取獲得的云芝葡聚糖的最高收率通常不超過10%。同時水浸提法在提取過程中要消耗大量能量，而酸提法與堿提法則污染嚴重。出人意外地，本申請人發現了一種新的云芝菌株，并進而在此基礎上研發了新的提取工藝，以此來提高云芝葡聚糖的純度含量，很好地滿足了人們對云芝葡聚糖的需求以及環境要求。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新的云芝菌株。本發明的另一目的在于提供一種制備云芝葡聚糖的新方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一種云芝菌株,其屬非招菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae),其命名為Coriolus versicolor，其保藏登記號為CGMCC N0.6760，保藏機構為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間為2012年11月07日。該菌株的實驗室編號為云芝菌株HT-6。本發明的上述云芝菌株是從秦嶺土壤通過初篩、復篩分離得到的。菌株鑒定:通過觀察HT-6菌株的菌體形態、培養特征，測定其生理生化指標，測定16SrDNA基因序列，構建其系統進化樹，最終確定HT-6為云芝菌株。進一步地，本發明涉及一種制備云芝葡聚糖的新方法，其特征在于包括如下步驟:步驟一:菌株發酵步驟:將上述保藏登記號為CGMCC N0.6760的云芝菌株接種于液體培養基中進行發酵培養4-8天，然后將發酵產物在5000r/min離心IOmin得到云芝菌絲體；所述液體培養基的組成為葡萄糖13.8g/L、蔗糖5g/L、酵母粉2g/L、蛋白胨20g/L、KH2PO4 2.5g/L、MgSO4.7H201.5g/L 和 VB1 8mg/L ;所述發酵培養條件為 25 30。。，120 150r/min ；步驟二:提取步驟:( I)將上述云芝菌絲體加入2%的Na2CO3的60°C熱水中，二者的重量比為1: 5，浸提I 2h，反復浸提過濾2 3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的 1/5 1/3 ；
(2)將濃縮后的浸提液采用酶-超聲波聯用法提取云芝葡聚糖，提取方法如下:稱取浸提液置于20倍體積的水中制得水稀釋液，用占水稀釋液總量1.5重量％纖維素酶、0.8重量％木瓜蛋白酶、3.5重量％菠蘿蛋白酶混合酶系在溫度為50°C，pH值為5.5的條件下酶解lOOmin，隨后把酶解的產物經過升溫滅酶，再按照料液比為1: 25的比例，超聲提取20min ；(3)將提取液過濾并減壓濃縮，除去蛋白，并用活性碳進行脫色處理，然后將濾液離心得上清液，在上清液中加入濃度為95%的乙醇進行沉淀，沉淀物用無水乙醇進行濾洗，真空干燥得到云芝多糖粉末，經高效液相色譜測定分子量，紅外光譜測定、GC測定、核磁共振測定進行組成糖分析為云芝葡聚糖。所述步驟⑶中的減壓濃縮是在壓力為-0.03Mpa下，溫度為70°C進行的；濃縮時間為I小時。所述步驟(3)中除去蛋白的方法為Sevag法。除非另有說明，本說明書中的為重量百分比。本發明的制備方法能顯著提高云芝葡聚糖提取率，提取獲得的云芝葡聚糖的收率通常超過30%，與常規的水浸提法、酸提法和堿提法等常規的提取工藝所縮短的操作時間近75%，降低能源的消耗，對環境友好，所采用的儀器自動化程度高操作簡單，從而為云芝多糖的工業化生產提供了可能。


圖1為本發明云芝葡聚糖制備流程圖。
具體實施方案:
下面結合實施例對本發明作進一步描述，但不限于下列實施例。實施例1:一種云芝葡聚糖的制備方法，步驟如下(I)將本申請保藏登記號為CGMCC N0.6760的云芝菌株接種于液體培養基進行發酵培養4天,然后將發酵液在5000r/min離心IOmin得到云芝菌絲體；所述液體培養基的組分為葡萄糖 13.8g/L、蔗糖 5g/L、酵母粉 2g/L、蛋白胨 20g/L、KH2PO4 2.5g/L、MgSO4.7H201.5g/L和VB1 8mg/L ;所述發酵培養條件為25°C，120r/min ；(2)按重量比為1: 5，將云芝菌絲體加入質量分數為2%的Na2CO3的60°〇熱水中，浸提I 2h，反復浸提過濾2 3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/5 1/3 ；(3)稱取浸提液于20倍體積的水中制得水稀釋液，用占水稀釋液總量1.5重量％纖維素酶、0.8重量％木瓜蛋白酶、3.5重量％菠蘿蛋白酶混合酶系在溫度為50°C，pH值為5.5的條件下酶解lOOmin，隨后把酶解的產物經過升溫滅酶，再按照料液比為1: 25的比例，超聲提取20min ；(4)將提取液過濾并在-0.03Mpa，70°C下減壓濃縮濃縮時間為I小時，采用Sevag法除去蛋白，并用活性碳進行脫色處理，然后將濾液離心得上清，在上清液中加入濃度為95%的乙醇進行沉淀，沉淀物用無水乙醇進行慮洗，真空干燥得到云芝多糖粉末，經高效液相色譜測定分子量，紅外光譜測定、GC測定、核磁共振測定進行組成糖分析為云芝葡聚糖。提取獲得的云芝葡聚糖的收率為35%，與常規的水浸提法、酸提法和堿提法等常規的提取工藝所縮短的操作時間約76%，實施例2:—種云芝葡聚糖的制備方法,步驟如下:(I)將本申請保藏登記號為CGMCC N0.6760的云芝菌株接種于液體培養基中進行發酵培養6天，然后將發酵液在5000r/min離心IOmin得到云芝菌絲體。所述發酵液中含葡萄糖 13.8g/L、蔗糖 5g/L、酵母粉 2g/L、蛋白胨 20g/L、KH2PO4 2.5g/L、MgSO4.7H201.5g/L和VB1 8mg/L ;所述發酵培養條件為30°C，140r/min ；(2)按重量比為1: 5，將云芝菌絲體加入質量分數2% Na2CO3的60°C熱水中，浸提I 2h，反復浸提過濾2 3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/5 1/3 ；(3)稱取浸提液于20倍體積的水中制得水稀釋液，用占水稀釋液總量2.0%纖維素酶、I %木瓜蛋白酶、3.0%菠蘿蛋白酶混合酶系在溫度為50°C，pH值為5.5的條件下酶解lOOmin，隨后把酶解的產物經過升溫滅酶，再按照料液比為1: 25的比例，超聲提取20min ；(4)將提取液過濾并在-0.03Mpa, 70°C下減壓濃縮濃縮時間為I小時，Sevag法除去蛋白，并用活性碳進行脫色處理，然后將濾液離心得上清，在上清液中加入濃度為95%的乙醇進行沉淀，沉淀物用無水乙醇進行慮洗，真空干燥得到云芝多糖粉末，經高效液相色譜測定分子量，紅外光譜測定、GC測定、核磁共振測定進行組成糖分析，確定為云芝葡聚糖。提取獲得的云芝葡聚糖的收率為33%，與常規的水浸提法、酸提法和堿提法等常規的提取工藝所縮短的操作時間約75%。本發明的一種云芝菌株以及利用其發酵產物提取云芝葡聚糖的方法已經通過具體的實例進行了描述，本領域技術人員可借鑒本發明內容，適當改變原料、工藝條件等環節來實現相應的其它目的，其相關改變都沒有脫離本發明的內容，所有類似的替換和改動對于本領域技術人員來說是顯而易見的，都被`視為包括在本發明的范圍之內。
權利要求
1.一種云芝菌株，其屬非招菌目(Aphyllophorales)多孔菌科(Polyporaceae),其命名為Coriolus versicolor,其保藏登記號為CGMCC N0.6760,保藏機構為:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間為2012年11月07日。
2.一種制備云芝葡聚糖的方法，其特征在于包括如下步驟: 步驟一:菌株發酵步驟:將權利要求1所述的云芝菌株接種于液體培養基中進行發酵培養4-8天,然后將發酵產物在5000r/min離心IOmin得到云芝菌絲體；所述液體培養基的組成為葡萄糖 13.8g/L、蔗糖 5g/L、酵母粉 2g/L、蛋白胨 20g/L、KH2P042.5g/L、MgSO4.7H201.5g/L和VBl 8mg/L ;所述發酵培養條件為25 30。。，120 150r/min ； 步驟二:提取步驟:(I)將上述云芝菌絲體加入2%的Na2CO3的60°C熱水中，二者的重量比為1: 5，浸提I 2h，反復浸提過濾2 3次，然后合并浸提液并濃縮至原體積的1/5 1/3 ； (2)將濃縮后的浸提液采用酶-超聲波聯用法提取云芝葡聚糖，提取方法如下:稱取浸提液置于20倍體積的水中制得水稀釋液，用占水稀釋液總量1.5重量％纖維素酶、0.8重量％木瓜蛋白酶、3.5重量％菠蘿蛋白酶混合酶系在溫度為50°C，pH值為5.5的條件下酶解lOOmin，隨后把酶解的產物經過升溫滅酶，再按照料液比為1: 25的比例，超聲提取20min ； (3)將提取液過濾并減壓濃縮，除去蛋白，并用活性碳進行脫色處理，然后將濾液離心得上清液，在上清液中加入濃度為95%的乙醇進行沉淀，沉淀物用無水乙醇進行濾洗，真空干燥得到云芝多糖粉末，經高效液相色譜測定分子量，紅外光譜測定、GC測定、核磁共振測定進行組成糖分析為云芝葡聚糖。
3.根據權利要求2所述的制備云芝葡聚糖的方法，其特征在于步驟(3)中的減壓濃縮是在壓力為-0.03Mpa下，溫度 為70°C進行的；濃縮時間為I小時。
全文摘要
本發明涉及一種云芝葡聚糖的制備方法，其特征是將云芝HT-6(保藏登記號為CGMCC No.6760)菌絲體通過Na2CO3、酶-超聲波聯用法提取，再將提取液過濾并減壓濃縮，除去蛋白(Sevag法)，并用活性炭進行脫色處理，離心分離收集上清液，用95％無水乙醇進行沉淀，沉淀物用無水乙醇慮洗，最后真空干燥得到云芝葡聚糖。本發明的制備方法能顯著提高云芝葡聚糖提取率，并明顯縮短操作時間，降低能源的消耗，對環境友好，所采用的儀器自動化程度高操作簡單，從而為云芝葡聚糖的工業化生產提供了可能。
文檔編號A01G1/04GK103070010SQ201210578950
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月27日 優先權日2012年12月27日
發明者唐滿倉, 張鑫, 馬玉明, 安德榮 申請人:陜西恒田化工有限公司