專利名稱：牦牛細管凍精制作方法
技術領域：
本發明涉及牦牛的凍精制作方法，特別是涉及牦牛細管凍精的制作方法。
背景技術：
耗牛是生活在我國聞海拔、聞寒牧區的聞原偶蹄目牛科特有物種，耐聞寒、聞海拔缺氧氣候。牦牛的生存能力極強，但生產性能較低，周期長，繁殖技術落后，種公畜利用年限短，加之牦牛性情粗野，活畜引種困難，一直阻礙著牦牛生產的發展。近三十年來人工授精技術已成為家畜繁殖和品種保護的一門先進技術，但是牦牛人工授精技術的關鍵節點之一牦牛精液的冷凍保存至今仍是一個難題。成年牦種公牛的射精量、精液密度、精子活力、耐 凍性都與黃牛、奶牛的有較大區別，難以使用這些牛類的現有方法。如能開發出合適高效的細管凍精制作方法，將會極大地促進牦牛產業的發展。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種牦牛細管凍精制作方法。本發明解決上述技術問題的技術方案為提供一種牦牛細管凍精制作方法。該方法包括以下步驟a、配制稀釋液；b、采精和檢查采取種公牛的精液，并對精液進行常規檢查，合格者用于制作細管凍精；C、稀釋在25 30°C條件下，在待冷凍的精液中加入稀釋液并攪拌；d、灌裝灌裝進凍精細管后，放到冷凍架上，控制溫度在O 5°C，持續I 2小時進行平衡；e、冷凍的細管凍精先使冷凍柜啟動后至4°C，停留5分鐘；待溫度恒定在4°C后將凍精細管移入冷凍箱；從41降至-10°C后停留時間為5分鐘，此為精液移入冷凍箱后的過渡平衡期；然后冷凍箱從-10 °C至-100°C后設定冷凍時間為40分鐘；從-100°C至-140°C后設定冷凍時間為20分鐘；細管結束冷凍進入液氮中保存備用，其液氮中的溫度在_140°C至-193。。；f、鏡檢冷凍結束后，抽檢精液活率，解凍抽檢活率達到O. 6以上移入液氮貯藏罐中冷凍貯藏備用。其中，上述方法中的牦牛細管凍精制作方法，其特征在于所述步驟C的稀釋方法為，鏡檢合格的原精，在25-30°C條件按照1:1的比例加入25-30°C的A液進行稀釋，稀釋液沿盛原精容器壁緩慢加入，輕輕攪拌；檢測精液濃度，再按每細管中的目標精子數和吸管容積，計算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀釋好后用于后繼的灌裝細管步驟；所述稀釋液A液的配方為每IOOmL蒸餾水+2. 97g檸檬酸鈉，然后再每100毫升中加入IOmL卵黃得稀釋液A液；
所述稀釋液B液的配方為每41. 75mL A液+7mL甘油+2. 5g果糖。其中，上述方法中所述稀釋液中加入青毒素至1000單位/毫升，加入鏈毒素至1000微克/暈升。其中，上述方法步驟b要求采集的精液直觀檢測合格無異狀，在35_38°C條件下鏡檢精子活力達O. 7以上者，以及每毫升精液精子數達8億以上者和畸形率為15%以下才可用于后繼步驟。其中，上述方法步驟C的稀釋步驟一般要求按每細管容納2000萬個左右的精子數的要求進行稀釋。檢測精子濃度一般常用分光光度法。本發明的有益效果是在本領域采用本發明制作出來的牦牛細管凍精，在原精液質量滿足要求的情況下，解凍后活率能達O. 6以上，遠好于顆粒凍精等方法，好于現有的其他技術。用此精液進行人工授精配懷率高，能有效提高牦牛質量，克服活畜引種在生態方面的不適應和飼養管理方面的困難，也為本領域提供了一種新的選擇，這對牦牛的資源利用來說具有尤其重要的意義。
具體實施例方式以下通過具體實施方式
的描述對本發明進行詳細的說明。結合上面的檢測方法，本發明方法包括以下步驟a、配制稀釋液。b、采精和檢查按常規方法采取種公牛的精液，并對精液進行常規檢查，要求直觀檢查無異狀，在35-38°C條件下鏡檢精子活力達O. 7以上者，以及每毫升精液精子數達8億以上者和畸形率為15%以下者方可用于制作細管凍精。C、稀釋在25 30°C條件下，在待冷凍的精液中加入稀釋液并攪拌。d、灌裝灌裝進凍精細管后，即放到冷凍架上，控制溫度在O 5°C，持續I 2小時進行平衡。(平衡溫度優選4°C)e、冷凍先使冷凍柜啟動后至4°C，停留5分鐘；待溫度恒定在4°C后將細管精液移入冷凍箱；從41降至-10°C后停留時間為5分鐘，此為精液移入冷凍箱后的過渡平衡期；然后冷凍箱從-10°C至-100°C后設定冷凍時間為40分鐘；-100°C至-140°C后設定冷凍時間為20分鐘；細管結束冷凍進入液氮中保存備用，其液氮中的溫度在_140°C至-193°C。f、鏡檢冷凍結束后，抽檢精液活率，解凍抽檢活率達到O. 6以上合格，才能移入液氮貯藏罐中冷凍貯藏備用。g、冷凍貯藏合格細管凍精移入液氮中貯藏。其中，上述方法中的牦牛細管凍精制作方法，其特征在于所述步驟C的稀釋方法為，鏡檢合格的原精，在25-30°C條件按照1:1的比例加入25-30°C的A液進行稀釋，稀釋液沿盛原精容器壁緩慢加入，輕輕攪拌；用分光光度法檢測精液濃度，再按每細管中的目標精子數和吸管容積，計算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀釋好后用于后繼的灌裝細管步驟；所述稀釋液A液的配方為每IOOmL蒸餾水+2. 97g檸檬酸鈉制成解凍液，然后每100毫升+IOmL卵黃得稀釋液A液；所述稀釋液B液的配方為每41. 75mL A液+7mL甘油+2. 5g果糖。
其中，上述方法中所述稀釋液中加入青毒素至1000單位/毫升，加入鏈毒素至1000微克/暈升。其中，上述方法步驟C的稀釋步驟一般要求按每細管容納2000萬個左右的精子數的要求進行稀釋。在進行本發明的細管凍精方法之前，需要獲取適用的牦牛精液。一般的要求是選取健壯適齡公牦牛，使用常規方法取精。獲取的精液一般要求，直觀檢查無異狀，在35-38°C條件下鏡檢精子活力達O. 7以上者，以及每毫升精液精子數達8億以上者和畸形率為15%以下者作為合格精液，用于制作細管凍精。精子數過少或畸形率過高會影響受胎率。牦牛精液的獲取和檢測一般會涉及如下操作采精制凍用種公牛要求特級或一級以上種公牛，按常規方法采集種公牛精液。對 精液進行常規檢查有如下方法可以選用(一 ) 一般直觀檢查1、色澤正常的精液為乳白色或略帶黃色，凡是淡黃色、褐色或黃綠色均不能使用。2、氣味正常的精液無味或略呈牦牛精液固有的青草腥味。3、鏡下狀態良好的精液用肉眼觀察時，可看到精液有“云霧”或“旋風”式的活動狀態。(二)精子活力測定1、測定精子活力取滴精液于載坡片上，加上蓋坡片，置于顯微鏡下檢查精子運動狀況(在37-38°C )，并估計前進運動的精子占整個視野內精子的百分數。如全部精子呈直線運動為1. O級，如其中90%的精子呈直線運動，則評為O. 9級，以下依此類推。如牦牛精子密度較大，可稀釋后評定。2、精子活率計算計算非前進運動的精子數將蓋玻片推蓋在計數板上，使其互相粘連呈密合狀態，先用低倍鏡找到計算室(方格)，用紅血球稀釋管收取公牛精液到刻度O. 5處，擦去管端附著的精液，而后吸至膨大部，吸入O. 9% Nacl溶液到刻度101處(即將原精液稀釋成200倍)，以拇指和中指緊按兩端，充分擺動混勻。棄掉稀釋管內最初兩滴，然后將管中已稀釋妥的精液滴一滴，至蓋玻與計算板之間的空隙邊緣，使液體彌散至計算室中，放大200-400倍進行觀察，計算一定方格內死亡、顫動、圓圈運動的精子數，即非前進運動的精子數。計算精子總數將上述精子非前進運動精子數后，再加熱(放于恒溫干燥箱內100°C，2分鐘)使精子全部死亡，計算精子總數。精子活率=(總精子數-非前進運動精子數)/總精子數(三)精子密度檢查(I)、目測法取原精液用點滴壓片法鏡檢精子密度，可粗略分為密、中、稀三級。如在多個視野中看不到精子，可評為“無”或“O”。⑵、計算法將蓋玻片推蓋在計算室上，使其互相粘連呈密合，先用低倍鏡找到計算室后，以血球稀釋管準確吸取公牛精液至刻度O. 5處，用紗布擦去管端附著的精液，然后將此精液吸至膨大部。再吸入3% Nacl溶液至刻度11處，充分搖動，混合均勻，棄掉管內最初幾滴，然后滴一滴稀釋的精液至計算器蓋玻片邊緣，待其自行進入計算室內(滴加精液不能過多或過少，不能使計算室內產生氣泡)，放大200-400倍計數。計算5個中方格內的精子數，四角各查一個，中間再查一個，而后推算，I毫升原精內的精子數。計算公式為I毫升原精液中精子數=(X/80) X 400 X 1000 X稀釋倍數X 10其中X為五個中方格(80個小方格)的精子數。400為一個大方格，即I平方毫米內有400個小方格。1000為一立方毫米。10為蓋玻片與計數的實際高度(1/1000毫米)。稀釋倍數200倍數稀釋(以吸取精液O. 5處至101處為200倍稀釋)；100倍稀釋(以取精液O. 5處至1. O處為稀釋100倍)。上式可簡化為1毫升原精液中精子數=XX稀釋倍數X50000 使用此方法檢測，I毫升原精液中精子數應達到8億以上的牦牛精液為佳。(四)精子畸形率的測定1、方法以玻璃棒沾一滴精液于潔凈載玻片之一端，另一載玻片以30°角自載玻片另一端拖向該滴精液，使其邊緣與精液充分接觸后向反方向推去，如此即制成均勻的精液抹片。抹片不宜太厚，牛精液可預先在載坡片上滴上生理鹽水稀釋。待抹片自然干燥后以O. 5%龍膽紫酒精溶液數滴染色3分鐘。再以蒸餾水緩慢沖去染料，待干燥后即可鏡檢。2、計算將抹片置高倍鏡下(400-600倍)檢查500個精子以上，計算其中畸形精子所占比例。畸形精子指核厚帽、赤道板、頂體損害等不正常精子。計算公式畸形率=畸形精子數/精子總數X 100%實施例使用本發明方法進行牦牛的細管凍精制由于牦牛的生物特性和繁殖性能有別與黃牛和奶牛，成年牦種公牛的射精量、精液密度、精子活力、耐凍性都與黃牛、奶牛的有較大區別。因此，使用相關設備進行冷凍處理的各項條件，特別是冷凍曲線和稀釋液，均要優化建立。本發明在大量的前期研究的基礎上，獲得了關鍵的突破，建立起本發明方法。1、原精液鏡檢后的要求按常規方法采取種公牛的精液，并對其精液進行常規檢查，直觀檢查合格，且在35-38°C條件下鏡檢精子活力達O. 7以上者，以及每毫升精液精子數達8億以上者和畸形率為15%以下者方可用于制作細管凍精。2、配制牦牛吸管凍精專用稀釋液和解凍液①稀釋液的配方稀釋液A液每IOOmL蒸餾水+2. 97g檸檬酸鈉+IOmL卵黃；稀釋液B液每41. 75mL A液+7mL甘油+2. 5g果糖；以上各種配方均可加入青毒素至體系中為1000單位/毫升，加入鏈毒素至體系中為1000微克/暈升。②配制方法
A、準確稱取檸檬酸鈉。B、將檸檬酸鈉放入量杯中，加入蒸餾水至需要量，用磁力攪拌器攪拌至完全溶解。C、將檸檬酸鈉溶液用濾紙或棉球過濾，盛于玻璃瓶中，塞上瓶塞，在瓶塞中央插入一根注射針頭，在瓶外對準液面做一標記，然后進行高壓或蒸煮消毒30分鐘，同時消毒適量備用蒸餾水。D、將消毒好的溶液和蒸餾水取出，觀察瓶外面的標記，如液面低于標記，將消毒好備用的蒸餾水加至標記處。E、消毒好的檸檬酸鈉溶液冷卻至25 30°C時 ，加入卵黃，并用磁力攪拌器攪拌均勻，制出A液。卵黃制備可使用本領域的常規技術，由雞蛋中取得。F、取相應A液，加入相應量的甘油、果糖、青霉素和鏈霉素，并充分攪拌制出B液。置于2 5°C的條件下保存備用。鏡檢合格的原精，在25_30°C條件按照1:1的比例加入25_30°C的A液進行稀釋，稀釋液沿盛原精容器壁緩慢加入，輕輕攪拌。用分光光度法檢測精液濃度，再按每細管中的目標精子數和吸管容積，計算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀釋好后進行分裝細管。一般每細管的精子總數常控制在2千萬左右。3、比色分析精子密度本操作使用的是法國卡蘇公司成套設備中的分光光度計檢測精子密度。4、裝入細管和打印牛號為確認每一細管中精液的來源。使用法國卡蘇(IMV)公司的IS4四頭打印一體機對細管進行灌裝、封口和打印。灌裝好后，即將細管放到冷凍用架子上進入制凍制流程。5、平衡細管精液(I)、提前打開平衡柜電源，控制溫度在4°C。待其溫度穩定(此時柜內溫度在O 5°C范圍內即可)。(2)、將放好細管的架子放入平衡柜，關閉柜門進行平衡，持續I 2小時。6、冷凍細管冷凍儀的操作進入卡蘇公司Digitcool 5300自動化精液冷凍儀的計算機程序(使用卡蘇配套軟件-Windows 3T)工作界面后，設定本發明經優化后獲得的針對牦牛精液的冷凍曲線。具體步驟如下選擇Curve Edit (曲線編輯)，New Bovine,然后逐行輸入表I中的數值，設定好冷凍曲線。表I冷凍曲線程序命令和設定數值表
權利要求
1.牦牛細管凍精制作方法，其特征在于其制作步驟包括a、配制稀釋液；b、采精和檢查采取種公牛的精液，并對精液進行常規檢查，合格者用于制作細管凍不目；C、稀釋在25 30°C條件下，在待冷凍的精液中加入稀釋液并攪拌；d、灌裝將精液灌裝進凍精細管后，放到冷凍架上，控制溫度在O 5°C，持續I 2小時進行平衡；e、冷凍的細管凍精先使冷凍柜啟動后至4°C，停留5分鐘；待溫度恒定在4°C后將凍精細管移入冷凍箱；從4°C降至-10°C后停留時間為5分鐘，此為精液移入冷凍箱后的過渡平衡期；然后冷凍箱從-10°C至-100°C后設定冷凍時間為40分鐘；從-100°C至_140°C后設定冷凍時間為20分鐘；細管結束冷凍進入液氮中保存備用，其液氮中的溫度在_140°C 至-193。。；f、鏡檢冷凍結束后，抽檢精液活率，解凍抽檢活率達到O.6以上移入液氮貯藏罐中冷凍貯藏備用。
2.根據權利要求1所述牦牛細管凍精制作方法，其特征在于所述步驟C的稀釋方法為，鏡檢合格的原精，在25 30°C條件按照1:1的比例加入25 30°C的A液進行稀釋， 稀釋液沿盛原精容器壁緩慢加入，輕輕攪拌；檢測精液濃度，再按每細管中的目標精子數和吸管容積，計算出需添加的B液量，并加入盛原精容器，稀釋好后用于后繼的灌裝細管步驟；所述稀釋液A液的配方為每IOOmL蒸餾水+2. 97g檸檬酸鈉，然后再每100毫升中加入IOmL卵黃得稀釋液A液；所述稀釋液B液的配方為每41. 75mLA液+7mL甘油+2. 5g果糖。
3.根據權利要求2所述牦牛細管凍精制作方法，其特征在于所述稀釋液中加入青毒素至1000單位/毫升,加入鏈毒素至1000微克/毫升。
4.根據權利要求3所述牦牛細管凍精制作方法，其特征在于其中，上述方法步驟b要求采集的精液直觀檢測合格無異狀，在35-38°C條件下鏡檢精子活力達O. 7以上者，以及每毫升精液精子數達8億以上者和畸形率為15%以下才可用于細管凍精。
全文摘要
本發明屬于動物的凍精制作領域，特別是涉及牦牛細管凍精的制作方法。本發明所要解決的技術問題是提供一種牦牛細管凍精制作方法。該方法包括以下步驟a、配制稀釋液；b、采精和檢查c、稀釋；d、灌裝；e、冷凍；f、抽檢；g、冷凍貯藏抽檢合格批次的細管凍精移入液氮中貯藏。在本領域采用本發明方法制作牦牛細管凍精，在原精液質量滿足要求的情況下，解凍后活率能達0.6以上，用此精液進行人工授精配懷率會更高，可提高所產牦牛質量。
文檔編號A01N1/02GK102986653SQ20121058626
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者張洪波, 毛進彬, 張永成, 馬樹榮, 阿龍呷, 劉成烈, 孫文平, 王鵬, 代舜堯, 方世界, 楊鵬波, 邵發亮 申請人:甘孜藏族自治州畜牧站