專利名稱：擬南芥熱激蛋白基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1的應用的制作方法
技術領域：
:本發明屬于種子生理和植物基因工程領域。具體地，涉及擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hot I在改變種子保藏、種子萌發特性中的應用，同時還涉及該基因T-DNA插入突變株hotl在改變種子萌發和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的種子中的應用。
背景技術：
:種子的保藏是植物種質資源保存的重要手段，其對生物多樣性的保護、對農業生產具有重要的意義。據統計，世界上已收集的植物種質資源有610萬份，其中90%是以種子形式保存在低溫種質庫中的，我國長期貯存的種質數量已達34萬份，居世界首位。但是種質低溫保存也存在很多問題，其中對種質遺傳完整性影響最大的就是種子老化問題，表現為發芽率降低。種子在自然儲藏中發芽力也會逐漸喪失，這就是自然老化(Machado Neto, Custodio et al.2001)。自然老化歷時較長,在品種改良中進行種質篩選時難以應用；人工老化則可克服常溫下自然老化所需時間較長的不足，而被廣泛應用于種子耐貯性的研究，人工老化常采用高溫高濕的方法。種子老化的過程中會發生一系列的生理生化及遺傳變化，包括:質膜傷害、物質能量代謝的變化、有機物質含量及種類的變化和遺傳結構的變化(Galleschi, Capocchi et al.2002;Andreev, Spiridonova etal.2004; Freitas, Dias et al.2006)。因此,進行種子老化的相關研究,揭示種子老化機理并進一步找出相關應對策略，對于種質資源保存具有重要的現實意義。種子是農林、園藝生產中的重要生產資料，其萌發直接影響農林園藝的生產。人們為播種獲得齊苗狀苗而設法使種胚打破休眠迅速整齊恢復生長，為豐產奠定基礎。種子的萌發受環境因素(如光、溫度和濕度等)和內部因素(如基因、激素、糖、含氮化合物、種皮的顏色和結構等)的協同調控(BeWleyl997)。激素調控方面，赤霉素(GA3)、生長素(IAA)和脫落酸(ABA)是調控種子休眠和萌發的主要植物激素。ABA抑制萌發，誘導休眠，赤霉素和生長素促進萌發，是拮抗ABA的主要因子，為種子萌發所必需(Flores，Jurado etal.2006;Rizza, Boccaccini et al.2010)。目前，由休眠到萌發的“開關”機制尚未明確，尤其是對種子萌發調控相關基因的研究方面。熱激蛋白質Heat Shock Protein (HSP)廣泛存在于植物細胞膜、細胞質、葉綠體、線粒體等組織中(Zhang, Wang et al.2007),是一組結構保守的蛋白質,依其分子量大小與序列的同源性，可分為small HSPs(sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90與HSP100等五類(Papp, Nardai et al.2003)。它們的主要功能有:(I)防止受熱變性的蛋白質聚集；(2)將已聚集的變性蛋白質分開；(3)輔助變性的蛋白質折疊回其原有的構形；(4)協助分解已變形的蛋白質(Suk-Whan and Elizabeth2001)。大部分的熱激蛋白質在演化上是高度保守的。以反義抑制方式，阻止擬南芥HSPlOl的表達，會使突變株喪失獲得性耐熱性，突變株在經38°C, 90分鐘的前處理下仍然無法在45°C的環境生存(Gurley2000; Suk-Whan andElizabeth2001)。熱激蛋白和熱激轉錄因子除了在熱激下起作用外，還和其它多種非生物脅迫有關，如干旱，高鹽和低溫脅迫等(Kotak, Larkindale et al.2007) 番爺sHSP可被低溫誘導，HSP21被發現包含在抗氧化途徑中，At HSP17.6則可被滲透壓所誘導。在種子萌發，特別是早期，基因轉錄活躍，蛋白質大量合成，細胞的增殖和分化非常劇烈，細胞的環境在不斷變化，細胞對外界刺激十分敏感。這個時期的HSPs變化和作用表現得非常突出(Hsu, Lai et al.2010)。目前，現有技術中未見擬南芥基因HSPlOl缺失及該基因的T-DNA插入突變株hotl能夠改變種子保藏、種子萌發特性的報道
發明內容
:本發明的目的在于提供一種擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在種子萌發、保藏和農作物生產中的應用。本發明的目的還在于提供一種擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有提高種子萌發和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的種子中的應用。為了實現本發明的上述目的，本發明采用了如下技術方案:擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發中的應用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲藏中的應用。擬南芥熱激蛋白基因 HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發勢。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長素IAA升高，有利于萌發。擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發的轉基因植物中的應用。擬南芥基因HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲藏的轉基因植物中的應用。擬南芥HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長素IAA的種子中的應用。本發明所述的基因HSPIOI在GenBank中的編號是AT 1G74310，該基因的CDS長2736bp，編碼911個氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I所示。利用從擬南芥生物資源中心 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)獲得的 HSPlOl 基因 T-DNA 插入的擬南芥突變體hotl作為研究對象，突變體株系的種子編號為SALK_066374，突變體hotl源于載體PR0K2上的一段T-DNA插入基因HSP101的外顯子中，導致基因突變，插入位點處的側翼序列如表2所示。
本發明在模式植物擬南芥中發現熱激蛋白基因HSPlOl功能與種子的萌發和老化有關，該基因缺失可使得擬南芥種子具有更高的萌發勢，但對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏，同時內源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長素(IAA)升高，有利于萌發。因此本發明發現操作基因HSPlOl能夠改變種子保藏和萌發特性，在種質資源保存和農作物生產中有很好的應用前景。


:圖1 為 Western Blot 鑒定；圖2為PCR試驗，圖2A為PCR引物設計示意圖；圖2B為電泳結果理論預期示意圖；圖3為PCR鑒定電泳結果；圖4為擬南芥種子萌發勢；圖5為擬南芥種子自然老化，圖5A為擬南芥種子自然老化兩年；圖5B為擬南芥種子自然老化兩年萌發率；圖6為擬南芥種子人工老化；圖7為擬南芥種子內源激素含量；圖7A為種子內源GA3含量；圖7B為種子內源IAA含量；圖7C為種子內源ABA含量。實施例1:突變株的獲得:本發明所述擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在GenBank中的編號是AT1G74310，該基因的CDS長2736bp，核苷酸序列如序列表所示(表1)，編碼911個氨基酸，氨基酸序列如序列表所示(表I)。從美國擬南芥生物資源中心Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)購買了此基因的T-DNA插入株系種子(SALK_066374)，突變株名稱為hotl，其插入位點側翼序列如表2。表1HSP101的⑶S序列和氨基酸序列 I ATGAATCCAGAGAAATTCACACACAAGACAAACGAGACAATTGCTACAGCTCATGAGCTAI METAsnProGluLysPheThrHisLysThrAsnGluThrIIeAlaThrAlaHisGluLeu61 GCTGTGAATGCAGGACATGCTCAATTCACTCCTTTGCATTTAGCTGGTGCTTTGATCTCT21 AlaValAsnAlaGlyHisAlaGlnPheThrProLeuHisLeuAlaGlyAlaLeuIIeSerI2I GATCCCACCGGTATATTTCCTCAAGCAATCTCTAGTGCCGGTGGCGAGAACGCAGCTCAA41 AspProThrGlyIIePheProGlnAlaIIeSerSerAlaGlyGlyGluAsnAlaAlaGln181 TCTGCTGAAAGAGTGATCAATCAAGCCTTGAAGAAGCTTCCTTCACAATCTCCTCCACCT61 SerAlaGluArgValIleAsnGlnAlaLeuLysLysLeuProSerGlnSerProProPro241 GATGATATTCCAGCGAGTTCTAGTCTTATTAAGGTCATTCGTCGTGCTCAAGCTGCTCAG81 AspAspIleProAlaSerSerSerLeuIIeLysValIIeArgArgAlaGlnAlaAlaGln
301 AAGTCACGAGGTGATACTCATTTGGCTGTTGACCAGTTGATTATGGGTCTTCTTGAAGAT101 LysSerArgGlyAspThrHisLeuAlaValAspGlnLeuIIeMETGlyLeuLeuGluAsp361 TCTCAAATCAGGGATTTGTTGAACGA AGTCGGTGTAGCGACGGCGAGGGTAAAGTCTGAG121 SerGlnIIeArgAspLeuLeuAsnGluValGlyValAlaThrAlaArgValLysSerGlu
42IGTTGAGAAGCTTCGTGGGAAAGAAGGGAAGAAAGTTGAGAGTGCTTCAGGGGACACAAAT141ValGluLysLeuArgGlyLysGluGlyLysLysValGluSerAlaSerGlyAspThrAsn48ITTTCAAGCTTTAAAGACTTATGGAAGAGATTTGGTTGAGCAAGCAGGGAAGCTTGATCCT161PheGlnAlaLeuLysThrTyrGlyArgAspLeuvalGluGlnAlaGlyLysLeuAspPro54IGTGATTGGTCGTGATGAGGAGATTAGAAGAGTCGTGAGGATTCTTTCGAGGAGAACGAAG181ValIIeGlyArgAspGluGluIIeArgArgValValArgIIeLeuSerArgArgThrLys
601AACAATCCTGTGCTATTGGAGAGCCAGGAGTTGGTAAAACAGCTGTGGTTGAAGGTTTA201AsnAsnProValLeuIleGlyGluProGlyValGlyLysThrAlaValValGluGlyLeu66IGCACAAAGGATTGTGAAAGGAGATGTGCCCAACAGTCTTACTGATGTGAGATTAATTTCG221AlaGlnArgIleValLysGlyAspValProAsnSerLeuThrAspValArgLeuIIeSer721TTGGACATGGGTGCGTTAGTTGCTGGTGCTAAATACCGAGGAGAGTTTGAAGAAAGGTTG241LeuAspMETGlyAlaLeuValAlaGlyAlaLysTyrArgGlyGluPheGluGluArgLeu78IAAATCTGTTTTGAAAGAAGTTGAGGACGCTGAAGGCAAAGTGATTCTCTTTATTGATGAG261LysSerValLeuLysGluValGluAspAlaGluGlyLysValIIeLeuPheIIeAspGlu84IATTCATTTGGTTCTTGGTGCTGGCAAAACTGAAGGGTCGATGGATGCAGCTAATCTGTTC281IleHisLeuValLeuGlyAlaGlyLysThrGluGlySerMETAspAlaAlaAsnLeuPhe
901AAGCCCATGTTAGCTAGAGGGCAGCTTCGATGCATTGGTGCTACAACGCTTGAAGAATAC301LysProMETLeuAlaArgGlyGlnLeuArgCysIIeGlyAlaThrThrLeuGluGluTyr96IAGGAAATATGTTGAGAAAGATGCTGCCTTTGAGAGGAGGTTCCAACAAGTCTATGTTGCG321ArgLysTyrValGluLysAspAlaAlaPheGluArgArgPheGlnGlnValTyrValAla1021 GAGCCAAGTGTGCCTGACACCATTAGTATCCTTAGAGGACTCAAGGAGAAGTATGAGGGA341GluProSerValProAspThrIIeSerIIeLeuArgGlyLeuLysGluLysTyrGluGly108I CATCATGGTGTGCGAATCCAAGACAGAGCTCTTATAAATGCTGCTCAGCTGTCTGCTCGT361HisHisGlyValArgIIeGlnAspArgAlaLeuIIeAsnAlaAlaGlnLeuSerAlaArg1141 TACATAACTGGTCGGCATTTACCGGATAAAGCAATTGATTTGGTTGATGAGGCTTGTGCG381TyrlleThrGlyArgHisLeuProAspLysAlalleAspLeuValAspGluAlaCysAla
1201AATGTGAGAGTCCAGCTTGATAGTCAACCTGAAGAGATTGATAACCTTGAAAGGAAGAGG401AsnValArgValGlnLeuAspSerGlnProGluGluIIeAspAsnLeuGluArgLysArg1261ATGCAGCTGGAAATTGAACTTCACGCCTTGGAAAGGGAGAAGGATAAAGCCAGCAAAGCT421METGlnLeuGlulleGluLeuHisAlaLeuGluArgGluLysAspLysAlaSerLysAla1321 CGACTTATAGAGGTGCGGAAAGAGCTTGATGACCTGAGAGACAAGCTTCAGCCTCTCACG441ArgLeuIIeGluValArgLysGluLeuAspAspLeuArgAspLysLeuGlnProLeuThrI38IATGAAATACAGAAAGGAGAAAGAGAGAATTGATGAGATTCGAAGGCTTAAACAGAAAAGA461METLysTyrArgLysGluLysGluArglleAspGluIleArgArgLeuLysGlnLysArg1441 GAAGAGCTCATGTTTTCTTTGCAGGAGGCAGAACGAAGATATGACCTTGCAAGAGCTGCT481GluGluLeuMETPheSerLeuGlnGluAlaGluArgArgTyrAspLeuAlaArgAlaAla
1501 GATCTAAGATATGGCGCAATTCAAGAAGTGGAATCTGCAATTGCCCAACTTGAAGGAACT501AspLeuArgTyrGlyAlaIleGlnGluValGluSerAlalIeAlaGlnLeuGluGlyThr1561 TCTTCTGAAGAGAATGTGATGCTCACAGAAAACGTTGGGCCTGAACACATTGCTGAGGTT
權利要求
1.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生 長素IAA的種子中的應用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長素IAA升高，有利于萌發。
全文摘要
提供擬南芥基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發和保藏中的應用，該基因T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發和保藏方面的轉基因植物中的應用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長素(IAA)的種子中的應用。本發明在模式植物擬南芥中發現熱激蛋白基因HSP101功能與種子萌發和老化有關，該基因缺失可使得擬南芥種子對人工老化敏感，在自然保存過程中不耐儲藏，同時內源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長素(IAA)升高，有利于萌發。因此本發明發現操作基因HSP101能夠改變種子保藏、種子萌發特性，在種質資源保存和農作物生產中有很好的應用前景。
文檔編號A01H5/10GK103173431SQ20131007660
公開日2013年6月26日 申請日期2012年1月16日 優先權日2012年1月16日
發明者李唯奇, 禹曉梅, 陶發清, 郁步竹 申請人:中國科學院昆明植物研究所