專利名稱：玫瑰黃鏈霉菌的一個負(fù)調(diào)控基因及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說，涉及玫瑰黃鏈霉菌istr印tomycesroseoflavus) Men-myco-93-63 的 nsdBmgh 基因、制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉花黃萎病、棉花枯萎病和棉鈴蟲是棉花生產(chǎn)上的重大病蟲害，隨著抗蟲棉和抗枯萎病品種的利用，棉鈴蟲和棉花枯萎病均得到了有效的控制。但棉花黃萎病作為ー種世界性的、典型的土傳病害，其防治始終是世界性難題，至今尚無抗病品種或效果明顯的防治藥劑和方法。該病害遍及幾十個植棉國，已成為世界棉花生產(chǎn)上的最主要威脅。九十年代 后該病害在我國各產(chǎn)棉區(qū)不斷爆發(fā)和流行。目前我國毎年棉花種植面積約8000萬畝，黃萎病發(fā)病面積達(dá)3000多萬畝，重病田2000萬畝，每年損失皮棉約10萬噸，折合人民幣14億元。河北省毎年植棉面積約1000萬畝，發(fā)病面積300多萬畝，損失約I. 4億元。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，生物防治因其對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全的優(yōu)點，在世界各國得到了廣泛的重視并發(fā)揮著越來越重要的作用。利用生物防治方法控制棉花黃萎病也越來越受到人們的重視。國內(nèi)外雖均有利用活菌進(jìn)行防治棉花黃萎病研究的報道，但因為活菌易受環(huán)境條件、土壌因素等影響，防效不穩(wěn)定，在生產(chǎn)上很少應(yīng)用。利用生防菌產(chǎn)生的抗生素或其它代謝產(chǎn)物防治該病害可以減輕或避免上述不利因素的影響。抗生素在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用開始于本世紀(jì)50年代，美國的科學(xué)家利用鏈霉素、土霉素及二者的混合物“農(nóng)霉素”防治果樹和蔬菜病害，取得了很好的防治效果。我國在利用抗生素防治植物病害方面也取得了很大進(jìn)展。井崗霉素在防治水稻紋枯病上的大規(guī)模應(yīng)用已取代了化學(xué)農(nóng)藥的防治，且連續(xù)使用多年尚未發(fā)現(xiàn)病原菌產(chǎn)生抗藥性。但當(dāng)前的生產(chǎn)中未發(fā)現(xiàn)利用抗生素防治棉花黃萎病的報道。本研究小組已經(jīng)獨(dú)立發(fā)現(xiàn)并從土壤中分離得到生防鏈霉菌菌株Men-myco-93-63，在室內(nèi)及大田實驗中，已經(jīng)證實該菌株及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌、番茄灰霉病菌、瓜類白粉病菌等十幾種重要植物病原菌的生長均表現(xiàn)很強(qiáng)的抑制作用(Liu D Q, AndersonN A, Kinkei L L. Selection ana characterization οι Streptomyces suppressiveto the potato scab pathogens. Canadian Journal of Microbiology, 1996， 42(5):487-502 ；劉大群，楊文香，祁碧菽，等.拮抗鏈霉菌Men-myco-93-63及其發(fā)酵液對棉花黃萎病菌生長的影響.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，22(4): 79-82 ;郭敬華，孟慶芳，李亞寧，等.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63發(fā)酵液對黃瓜白粉病抗性的影響.華北農(nóng)學(xué)報，2007, 22 (s)，Γ4.；孟慶芳，張汀，劉大群.番茄灰霉病生防菌的篩選與研究.中國生物防治，2005，21:139 144.)。經(jīng)16S r RNA序列分析及120bp的Y可變區(qū)BLAST比較，結(jié)合形態(tài)學(xué)及生理生化特征分析，將該菌株鑒定玫瑰黃鏈霉菌iStreptomyces roseoflavus)(微檢2005年A001號)。另外，本研究小組已在Men-myco-93-63菌株中克隆得到了 nsdAmgh基因(沈鳳英，劉力強(qiáng)，吳偉剛，等.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63負(fù)調(diào)控基因asi/ん&的克隆及序列分析.華北農(nóng)學(xué)報，2009，24(5): 77-80)，試驗表明，阻斷該負(fù)調(diào)控基因后，突變株在搖瓶水平上對棉花黃萎病菌的抑制能力提高了一倍(沈鳳英.玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63接合轉(zhuǎn)移體系及nsdA基因的研究.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文，2009)ο基于上述研究成果,本發(fā)明人進(jìn)ー步深入研究Men-myco-93-63菌株，得到另ー種負(fù)調(diào)控基因/ ·Si/ガー基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh基因。本發(fā)明的第二個目的在于提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因的制備。本發(fā)明的第三個目的在于提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因的應(yīng)用。本發(fā)明人經(jīng)過研究對比發(fā)現(xiàn)，在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)的/浴基因同/^ぬ基因結(jié)構(gòu)相似，都含有TPR結(jié)構(gòu)。nsdB可能編碼含有502個氨基酸的調(diào)控蛋白，該蛋白與灰色鏈霉菌產(chǎn)袍蛋白NrsA的529個氨基酸有27. 9%的一致性，與/ ·的491個重疊氨基酸有42%的一致性。阻斷/^通基因能夠使菌株的放線紫紅素和鈣依賴抗生素產(chǎn)量均提高，但形態(tài)分化沒有明顯變化。因此，本發(fā)明人根據(jù)天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)抗生素代謝途徑中重要的負(fù)調(diào)控基因nsdB的序列自主設(shè)計引物Ns8F和Ns8R，擴(kuò)增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA，得到了 1121bp的片段。非特異性引物錨定PCR方法(Nonspecific Anchored PCR, NPA-PCR)是基于隨機(jī)引物PCR的原理，由彭華正的抑制序列非特異錨定PCR染色體步移方法改進(jìn)而來。非特異性引物錨定PCR (NPA-PCR)中共用到四條引物，兩條隨機(jī)引物，SAPl (Sequence AnchoringPrimer)和SAP2，SAP2是SAPl的一部分，起到非特異性錨定的作用；基因特異性引物GSPl (Gene Specific Primer)和 GSP2，GSPl 為外引物，GSP2 為內(nèi)引物。NPA-PCR 包括四輪反應(yīng)。第一輪反應(yīng)通過ー個低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)使得引物SAPl非特異地結(jié)合到變性DNA上。第一輪反應(yīng)結(jié)束后加入GSP1，第二輪反應(yīng)即SAPl和GSPl的擴(kuò)增反應(yīng)，以篩選第一輪反應(yīng)中正確的結(jié)合子。非特異性擴(kuò)增序列由于兩端接合的同樣引物在退火時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生PCR抑制效應(yīng)，被稀釋消除。第三輪PCR是往第二輪反應(yīng)產(chǎn)物中加入SAP2，擴(kuò)增反應(yīng)在引物SAP2、GSP1之間進(jìn)行，富集模板量。稀釋的第三輪產(chǎn)物作為第四輪反應(yīng)模板加入SAP2、GSP2進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到片段即為目的片段。在設(shè)計引物Ns8F和Ns8R擴(kuò)增Men-myco-93-63基因組DNA得到1121bp片段的基礎(chǔ)上，我們利用非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進(jìn)行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到長度為2073bp的基因全長序列，并在拼接序列兩端設(shè)計引物驗證延伸的正確性，比對發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果與拼接序列一致。該全長序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)キnsdB基因核苷酸 序列有87%同源性，將該新基因命名為/^ /ガー。nsdBmgh新基因的制備為進(jìn)一歩研究和探明玫瑰黃鏈霉菌抗生素合成代謝途徑和調(diào)控機(jī)理提供了又一重要依據(jù)，為抗生素高產(chǎn)基因エ程菌株的獲得奠定了重要基礎(chǔ)。
根據(jù)上述實驗過程,本發(fā)明提供了所述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 IisdBmgh^因，其序列如下
CCTGAGACCTATTACCGCCCAGAGGATCTCCGTGTTGTGTGCATGGGCGATACAGATCCCTTCGTGTGCCTG TTGCATTGCGTGCACCTCCCGGCCCGGCCGCTTTCGGGTGCACCCTGGGGAGTGCCTTGCGGCGACCGGGTCGGGGT
GGCGCACTCCTACCTGACACCCGGGGCCCCCTGGCACACCATCTGGCGCACCCTGGCGAACCCTGGCGAATAGTCGC
TCAGCAACTGACAGGCGGTTACTGTCAACTCAGCCGAGAACCTGGGGGCTTGACGTGAACGGACAACCCAACACCCG
CCTTTCGGACCTGTTCGGCCTGGCCGGCTGGTCCAAGGGTGAGCTCGCGAGGCTGGTGAACCGGCAGGCGGCGGCCA
TGGGCCATCCCCAGCTGGCCACCGACACCTCGCGGGTGCGGCGGTGGATCGACACGGGGGAGATCCCCCGCGATCCG
GTGCCGCGGGTGCTGGCGGTCCTGTTCACCGAGCGTCTCGGCCGTGTCGTGACCACTGAGGATCTCGGTCTGGTCCG
GCAGGGACGCCCAGGGAAGCGGCAGGGCGACGGGAGTGTGGAGCACCCCGACGGCGTGCCGTGGGCGCCCGAGCGGA
CGGCCTCGGTCCTCACCGAATTCACGGGAATGGACCTCATGCTCAACCGACGCGGCTTGGTGGGCGCGGGCGCTGCG
CTTGCCGCAGGCTCCGCGCTCAGCAGCGCCATGCAAGACTGGCTGCACGTCGACCCGGCCCTCGCGGCCGACGCCCC
CCGTACCCACGACCCCCTGCACGTCGACCCCGCAGCCGCCGACCGCTACGAGGCCGCTCCCGTCGGCTCCCAGGAGA
TCGAGGAGCTGGAGCGCTCGGTCGAGGTGTTCCGCGCCTGGGACGCGTCCCGCGGCGGCGGACTCCAGCGCAAGGCC
GTGGTGGGCCAGCTCAACGAGGTGGGCGGCATGCTCGCCTACCGCCACCCCGACCACCTCCAGCGACGCCTGTGGGG
CGTCGCCGCCAACCTCGCAGTCCTCGCCGGCTGGATGTCGCACGACGTCGGCCTCGAACCCACGGCGCAGAAGTACT
TCGTCATCGCGGCGCACGCGGCGCGGGAGGGCGGGGACCGGCCGCGTGCCGGGGAGGCCCTGTCGCGGGCCGCGCGC
CAGATGGTGCACCTCGGCAAGCCGGACGACGCCCTGGACCTGATGAAGCTGGCCAAGTCCGGCGGCGGTGAGGAGGC
CCTGCCGCGCACCAAGGCCATGCTGTACACCATCGAGGCCTGGGCGCAGGCGTCGATGGGGCGCGGCCAGGCCATGC
GGCGCACGCTCGGCCTCGCCGAGGACCTCTTCGTCTCCGACAAGGGGGACGTGGAGCCGCCGAGCTGGATGCAGATG
TTCGACGAGGCGGACCTGCACGGCATGCAGGCCCTGGCCTACCGCACGCTCGCCGAACACGACCCGGCGGCGGCGAG
CGTCGCGCAGCGGCACGCCAAACTCGCCATCGAGCTGCGGGCCAAGGGCCGCGACCGCTCGCAGATCTTCGACTACA
TCTCGCTGGCCTCCGCCTGCTTCATCGCCGACGACCCGGAGCAGGCCGACCGCTACGCACGCCTGGCCCTGGTGTCG
ATAAACTCCAACTCCTCCCACCGCACCTGGGACCGGCTGCGCGAGATGTTCCGACTGACCGCGCAGTACTCCGACTA
CCCGAAGATCCAGGACCTGCGCGAGGAGATCAAGCTCGCGCTGCCGAAGGGGGTCAAGGCGGGAGGCAGGACGGCGA
GGGCGTGACGCGCCCGTCCTGAACACCGGCCCGAGCCCGTCCTCACCACCGAACCGAGGGCGACCGGCCGGACCGTG
TCGTCAGGCGCGGGTCACACCCGTGCCATCAGCAGACAGGCGTCGGCCTCACGCGGCACCTCGTCGAACGCCTCCAT
GACGGCGCGCACGCAGTCCTGCGCGTTGAGCGCCCCGGTGAAGCGGGGTGCCATCGAGAGAAGTTCGGTCGTGGCCG
CGTCCCGGTCGCACCGGGGGACCAGACCGTCGATGCAAAAAACACGGAGATCCTCTGGGCGGTAATAGGTCTCAGG
根據(jù)上述實驗過程，本發(fā)明還提供上述玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63 nsdBmgh基因的制備方法。所述制備方法是以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到1121bp的片段，利用非特異引物錨定PCR(NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進(jìn)行延伸，5’端延伸得到534bp，3’端延伸得到702bp，拼接后得到長度為2073bp的全長序列，并在拼接序列兩端設(shè)計引物驗證延伸的正確性，比對發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增結(jié)果與拼接序列一致。該序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)キnsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該基因命名為asi/ガー。具體的說，本發(fā)明所述的制備方法包括以下步驟
I)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因部分片段的獲得根據(jù)國際基因庫(GenBank)上天藍(lán)色鏈霉菌nsdB基因(GenBank登錄號1102690 ;編號為SC07252)的序列設(shè)計ー對特異引物 Ns8F (GTGGATCGACATGGGAGAGAT )和 Ns8R (CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT )，PCR擴(kuò)增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA ;PCR產(chǎn)物電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序；
2)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因5’端和3’端非特異引物錨定PCR
(NPA-PCR):根據(jù)步驟I)中PCR的測序結(jié)果，設(shè)計5’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSPl (GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA)和 GSP2 (CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG);3，端非特異引物錨定 PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSP3 (GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG)和 GSP4(GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG)，進(jìn)行非特異引物錨定PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。其中，所述步驟I)是，PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng，LA Taq酶I U,5μ mol ·じ1 的上、下游引物各 O. 5 μ L, 10 mmol ·じ1 的 dNTP I μ L,2XGC buffer I 緩沖液12. 5 μ L，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25レし屮0 反應(yīng)程序為先95で5 min ;然后94 0C I min, 60 0C I min，72°C I min30s，共 35 個循環(huán)；最后 72°C 10 min，4°C 保存；
隨后PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫(GenBank)上進(jìn)行序列分析獲得nsdBmgh基因的部分片段序列。步驟2)所述非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)擴(kuò)增體系和程序為
第一輪反應(yīng)為15 μ L體系包含I U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、10 yL 2XGC buffer I,O. I μ M SAPl (非特異引物錨定PCR通用引物)，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 μしPCR反應(yīng)程序為94°C 5 min, 30°C 3 min，以O(shè). 2°C / s升到65°C，65°C 5 min。第二輪反應(yīng)為向第一輪反應(yīng)體系中加入5 μ L引物GSPl (5’端延伸所用引物)或GSP3 (3’端延伸所用引物)(終濃度為O. 5 μΜ)。PCR反應(yīng)程序為94°C 30 s，65°C 3min,共 10 個循環(huán)；72°C 5 min。第三輪反應(yīng)為向第二輪PCR產(chǎn)物中另加2. 5 UL SAP2(非特異引物錨定PCR)(終濃度為 O. 5 μΜ)和 2.5yL 2XGC buffer I。PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 2 min ;然后 94°C30 s，65°C 3 min，共 20 個循環(huán)；72°C 5 min。第四輪反應(yīng)以I yL 50倍稀釋的第三輪產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為0.5μΜ GSP2(5’端延伸所用引物)或GSP4 (3’端延伸所用引物)，O. 5 μ M SAP2,0. 2 μ MdNTPs，2XGC buffer I 和 IU LA Taq 酶。PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 2 min ;然后 94°C 30s，65°C 3 min，共 30 個循環(huán)；72°C 5 min，4°C保存。隨后，將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫(GenBank)上進(jìn)行序列分析獲得/^ /ガー基因的5’端和3’端基因序列。
另外，本發(fā)明所述的制備方法，在步驟2)之后，還包括步驟nsdBmgh基因全長序列的驗證。步驟3)是根據(jù)步驟I)中獲得的測序結(jié)果與步驟B中5’端和3’端的延伸結(jié)果進(jìn)行序列拼接，設(shè)計一對特異引物PR (ACGACCGAACTTCTCTCGATGG)和PF(ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT )進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證拼接結(jié)果的正確性。其中，所述PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng, LA Taq 酶 I U, 5 U mol .171 的上、下游引物各 0. 5 u L, 10 mmol .171的dNTP luL,2XGC buffer I緩沖液12. 5 U L，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 uL ；PCR 反應(yīng)程序為先 95°C 5 min;然后 94°C I min,65°C I min,72°C 3 min，共 35 個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存。PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物按上述方法進(jìn)行克隆，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫(GenBank)上進(jìn)行序列分析。經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增結(jié)果與拼接序列一致。該序列包含一個完整的開放閱讀框，共編碼464個氨基酸，與天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)中nsdB基因核苷酸序列有87%同源性，將該基因命名為/^必一。利用InterPro database 數(shù)據(jù)庫(http://www. ebi. ac. uk/interpro/)對Men-myco-93-63中克隆到的基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其與天藍(lán)色鏈霉菌A3 (2)的似必基因編碼的NsdB蛋白在結(jié)構(gòu)域組織方式上相同，都具有TPR結(jié)構(gòu)域，見圖5。鏈霉菌能產(chǎn)生多種次級代謝物并且經(jīng)歷復(fù)雜的形態(tài)分化，有很多基因已被確認(rèn)在形態(tài)分化中充當(dāng)重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)這些基因的表達(dá)產(chǎn)物均含有類TPR結(jié)構(gòu)。TPR是一個含有34個氨基酸的蛋白重復(fù)序列，編碼a螺旋-轉(zhuǎn)角-a螺旋的二級結(jié)構(gòu)片段，通常以串連形式重復(fù)出現(xiàn)在蛋白結(jié)構(gòu)中，參與蛋白間的相互作用和細(xì)胞內(nèi)的功能調(diào)節(jié)(GaisserS， Bohm G A, Cortes J, et al. Analysis of seven genes from theeryAI-eryKregionof the erythromycin biosynthetic gene cluster in Streptotnyces erythraeus.MolGen Genet, 1997，256(3) : 239-251)。天藍(lán)色鏈霉菌中就預(yù)測有70個含類TPR結(jié)構(gòu)的蛋白，其中包括負(fù)調(diào)控基因。nsdB基因目前只在天藍(lán)色鏈霉菌中被研究和報道，發(fā)現(xiàn)阻斷該基因會使菌株的放線紫紅素和鈣依賴抗生素產(chǎn)量提高，菌株形態(tài)分化沒有明顯變化(Zhang L, Li W C，Zhao C H，et al. NsdB, a TPR-Iike-domain-containingprotein negatively affecting production of antibiotics in Streptomycescoelicolor A3 (2). Acta Microbiologica Sinica, 2007, 47 (5) : 849 854)。本試驗發(fā)現(xiàn)玫瑰黃鏈霉菌的IisdBmgh基因編碼的氨基酸序列與天藍(lán)色鏈霉菌的nsdB基因編碼的NsdB蛋白的結(jié)構(gòu)域相同，都含有TPR結(jié)構(gòu)，因此推測基因在玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中也可能起到重要的負(fù)調(diào)控作用。采用是單交換基因破壞策略來研究的功能。首先將得到的1121 bp的片段連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建pMDNA1121質(zhì)粒，再用VialIII和Xbal雙酶切PMDNA1121，其中包含了部分的基因，將該片段回收后克隆到pKC1139的歷idIII和油a I位點上，得到用于基因單交換的重組質(zhì)粒——pSRNA 1121，構(gòu)建過程見圖6。在接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63作為受體，含有可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的大腸桿菌ET12567 (pUZ8002，pSRNA1121)作為供體。供體大腸桿菌ET12567 (pUZ8002,PSRNA1121)單菌落先于LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，然后待生長達(dá)到對數(shù)期時收集菌液，再用LB液體培養(yǎng)基洗滌兩次，最后將菌體懸浮于0.1倍LB培養(yǎng)基中。玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63接種于PDA培養(yǎng)基中28°C恒溫培養(yǎng)，12天后制備孢子懸浮液，先用2 X YT培養(yǎng)基洗滌兩次，50°C熱激10 min，37°C 2.5 h。將處理好的供體ET12567(PUZ8002，pSRNA1121)與受體玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的孢子懸浮液輕輕混合，離心沉淀，最后只留少量的殘余液懸浮沉淀，涂布在MS培養(yǎng)基上。28°C培養(yǎng)17 h后，用含安普霉素和萘啶酮酸的水溶液均勻覆蓋在MS培養(yǎng)基上。接著在28°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)，10天后，每個平皿均有幾十到幾百個菌落長出。挑取轉(zhuǎn)化子在含有安普霉素和萘啶酮酸的MS培養(yǎng)基上劃線，可以傳代。將傳代的轉(zhuǎn)化子接種在含安普霉素和萘啶酮酸的SGGP液體培養(yǎng)基中30°C 200 rpm震蕩培養(yǎng)48 h，收集菌液并提取質(zhì)粒，分離得到的質(zhì)粒用Hindlll和Xba I雙酶切。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒酶切結(jié)果與PSRNA1121酶切結(jié)果一致，見圖7。說明pSRNA1121已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63中通過轉(zhuǎn)化將pSRNA1121鑄K E. coli ET12567 (pUZ8002)獲得接合轉(zhuǎn)移供體厶coli ET12567 (pUZ8002/ pSRNA1121)，在含有安普霉素的LB平板上總共得到大約150個轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選其中5個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有安普霉素的LB中富集菌體，經(jīng)質(zhì)粒酶切驗證，證明這5個轉(zhuǎn)化子中的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)都是正確的。說明接合轉(zhuǎn)移供體萬.ET12567(PUZ8002/ pSRNAl 121)正確。然后通過接合轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)化到玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的孢子中。在含有安普霉素的MS平板上總共得到大約60個轉(zhuǎn)化子，隨機(jī)挑選其中5個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有安普霉素的SGGP中富集菌體，提質(zhì)粒酶切后，證明這5個轉(zhuǎn)化子都是正確的。將其中一個轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有安普霉素的基本培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)IOd后，制備孢子懸液。經(jīng)適當(dāng)稀釋后，以每個平皿IO4個孢子的濃度涂布在含有安普霉素的PDA培養(yǎng)基平板上，于40°C高溫培養(yǎng)。由于PKC1139具有溫度敏感型復(fù)制子，所以在高于34°C條件下不能正常復(fù)制。因此，只有PSRNA1121上的部分基因序列與玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63染色體發(fā)生了同源重組-單交換的菌株才能在含有安普霉素的基本培養(yǎng)基上生長。結(jié)果在40°C高溫培養(yǎng)長出轉(zhuǎn)化子。為了檢測TisdBmgh阻斷突變株的穩(wěn)定性，挑取IisdBmgh阻斷突變株單菌落接種到不含安普霉素的基本培養(yǎng)基上生長，連續(xù)傳代4次，再挑取300個單菌落分別轉(zhuǎn)接到含有安普霉素的基本培養(yǎng)基上，未發(fā)現(xiàn)抗性消失的菌落。表明阻斷突變株可以穩(wěn)定的遺傳。以棉花黃萎病菌(K dahliae)NAl為檢測菌株，測定菌株代謝產(chǎn)物的生物活性。將野生型菌株玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63阻斷突變株接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)5 d后，將發(fā)酵液離心，菌絲沉淀以丙酮萃取過夜，40°C減壓蒸餾，最后用5 mL甲醇溶解。以紙碟法進(jìn)行抑菌試驗，取棉花黃萎病菌孢子懸浮液0.1 mL涂布于培養(yǎng)皿上，把抗生素粗品定量滴加到濾紙片上，加濾紙片于涂布有指示菌的PDA或Czapek平板上，培養(yǎng)3d后觀察結(jié)果，見圖8。圖中所示，出發(fā)菌株玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63對棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑約1.8 cm，而突變株對棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑增大到約2.7 cm。結(jié)果表明在同樣條件下，nsdBmgh阻斷突變株和野生型菌株均能抑制棉花黃萎病菌的生長,但UsdBmgh阻斷突變株的抑菌活性高于野生株。使用Men-myco-93-63突變株發(fā)酵液、Men-myco-93-63出發(fā)菌株20倍灌根，50%多菌靈500倍和清水作對照進(jìn)行棉花黃萎病的田間藥效試驗。在第二次發(fā)病高峰后期，一次調(diào)查防治效果。病情指數(shù)調(diào)查采用4點取樣，每樣點調(diào)查200株左右，分病級記載。試驗結(jié)果和顯著性差異分析結(jié)果見表2。可以看出，防效最好的為Men-myco-93-63突變株發(fā)酵液的32. 5%，其次是Men-myco-93-63出發(fā)菌株發(fā)酵液29. 73%。對照藥劑50%多菌靈500倍和清水對照防效分別為8. 88%和O。表2不同處理對棉花黃萎病的防治效果
權(quán)利要求
1.一種玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的ast基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列，或與SEQ ID NO :1所示核苷酸編碼相同蛋白的核苷酸序列。
2.一種由權(quán)利要求I所述基因編碼的蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID N0:12所示的氨基酸序列。
3.含有權(quán)利要求I所述基因的載體，或進(jìn)一步包括含有該載體的宿主。
4.權(quán)利要求I所述基因在制備生防菌基因突變株中或在生防菌抗菌活性中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求2所述蛋白在制備生物殺菌劑或在防治植物病害中的應(yīng)用。
6.一種制備權(quán)利要求I所述基因的方法，包括如下步驟 1)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因部分片段的獲得根據(jù)天藍(lán)色鏈霉菌asi浴基因(GenBank登錄號1102690 ;編號為SC07252)的序列設(shè)計一對特異引物Ns8F(GTGGATCGACATGGGAGAGAT)和 Ns8R (CCATGGACAGGTAGTCGAAGAT)，PCR 擴(kuò)增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA ；PCR產(chǎn)物電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pMD19_T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序； 2)玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因5’端和3’端非特異引物錨定PCR(NPA-PCR):根據(jù)步驟I)中PCR的測序結(jié)果，設(shè)計5’端非特異引物錨定PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSPl (GAGCATGAGGTCCATTCCCGTGA)和 GSP2 (CGGACCAGACCGAGATCCTCAGTG);3，端非特異引物錨定 PCR (NPA-PCR)特異性引物 GSP3 (GACGCCCTGGACCTGATGAAGCTG)和 GSP4(GATGCAGATGTTCGACGAGGCGG)，進(jìn)行非特異引物錨定PCR擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物電泳檢測，然后將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述步驟I)中PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng, LA Taq 酶 I U，5 μ mo I · L-1 的上、下游引物各 O. 5 μ L, 10 mmol · L-1 的 dNTPluL,2XGC buffer I緩沖液12. 5 μ L，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 μ L ;PCR反應(yīng)程序為先 95°C 5 min;然后 94°C I min,60°C I min,72°C I min30s，共 35 個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存； 隨后PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫上進(jìn)行序列分析獲得nsdBmgh基因的部分片段序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于，步驟2)所述非特異引物錨定PCR(NPA-PCR)擴(kuò)增體系和程序為 第一輪反應(yīng)為15 μ L體系包含I U LA Taq酶、50 ng模板DNA、0. 2 μ M dNTP混合物、10μ L 2XGC buffer I,O. I μ M SAP1，用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 yL;PCR反應(yīng)程序為94°C 5 min, 30°C 3 min,以 O. 2°C / s 升到 65°C，65°C 5 min ； 第二輪反應(yīng)為向第一輪反應(yīng)體系中加入5 μ L引物GSPl或GSP3，其終濃度為O. 5 μΜ；PCR 反應(yīng)程序為94°C 30 s，65°C 3 min，共 10 個循環(huán)；72°C 5 min ； 第三輪反應(yīng)為向第二輪PCR產(chǎn)物中另加2. 5 yL SAP2，其終濃度為O. 5 μΜ和2.5yL2XGC buffer I ;PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 20 個循環(huán)；72。。 5 min ； 第四輪反應(yīng)以I UL 50倍稀釋的第三輪產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為O. 5 μΜGSP2 或 GSP4, O . 5 μΜ SAP2,0. 2 μ M dNTPs，2XGC buffer I 和 IU LA Taq 酶；PCR 反應(yīng)程序為先 94°C 2 min;然后 94°C 30 s，65°C 3 min，共 30 個循環(huán)；72°C 5 min，4°C 保存； 隨后，將PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，PCR產(chǎn)物連接到克隆載體PMD19-T上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫上進(jìn)行序列分析獲得基因的5’端和3’端基因序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8任意一項所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)之后，所述的制備方法還包括步驟t^nsdBmgh基因全長序列的驗證。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟3)是根據(jù)步驟I)中獲得的測序結(jié)果與步驟B中5’端和3’端的延伸結(jié)果進(jìn)行序列拼接，設(shè)計一對特異引物PR(ACGACCGAACTTCTCTCGATGG)和 PF (ATACAGATCCCTTCGTGTGCCTGT)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增驗證拼接結(jié)果的正確性；其中，所述PCR反應(yīng)體系為模板DNA 50 ng, LA Taq酶I U，5 μ mol · L—1的上、下游引物各 O. 5 μ L, 10 mmol · Γ1 的 dNTP I μ L，2XGC buffer I 緩沖液 12. 5 μ L,用無菌蒸餾水補(bǔ)充反應(yīng)體系至25 口1^屮0 反應(yīng)程序為先951 5 min;然后94°C I min,65°C I min，72°C 3 min，共35個循環(huán)；最后72°C 10 min，4°C保存；PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物按上述方法進(jìn)行克隆，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫上進(jìn)行序列分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及玫瑰黃鏈霉菌(Streptomycesroseoflavus)Men-myco-93-63的nsdBmgh基因、制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明以天藍(lán)色鏈霉菌A3(2)抗生素代謝途徑中重要的負(fù)調(diào)控基因nsdB的序列自主設(shè)計引物Ns8F和Ns8R，擴(kuò)增玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63基因組DNA，得到了1121bp的片段；隨后利用非特異引物錨定PCR(NPA-PCR)方法對該靶序列兩端進(jìn)行延伸，獲得玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的nsdBmgh基因。通過基因中斷對該基因進(jìn)行了功能驗證，基因阻斷突變株比出發(fā)菌株代謝產(chǎn)物的抑菌活性明顯提高。nsdBmgh基因的制備和應(yīng)用為進(jìn)一步研究和探明玫瑰黃鏈霉菌抗生素合成代謝途徑和調(diào)控機(jī)理提供了又一重要依據(jù)，為防治植物病害的抗生素高產(chǎn)基因工程菌株的應(yīng)用奠定了重要的基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/36GK102634523SQ20121008374
公開日2012年8月15日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月18日
發(fā)明者冀紅柳, 劉大群, 孟慶芳, 張娜, 張汀, 張立榮, 李亞寧, 李星 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)