專利名稱：一種西洋參不定根組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種西洋參組織培養方法，屬于中藥西洋參組織培養領域。
背景技術：
西洋參(Panaxquinquefolium L.)，又稱美國人參(American ginseng),原產于美國東部和加拿大，是五加科(Araliaceae)人參屬植物，以根入藥最為常見。現代藥理學研究表明，西洋參具有調節糖代謝、增強免疫力、延緩衰老、抗腫瘤、降血壓、預防及治療心血管疾病、保肝護肝、增強學習能力和記憶能力、益智等作用。由于多年來的過度采挖，西洋參賴以生存的森林生態環境遭到嚴重破壞，野生西洋參資源枯竭，目前用于藥用的多為栽培西洋參。然而西洋參的栽培生產周期長，占地面積大，且其品質易受氣候、栽培條件及病蟲害的影響，供應難以滿足市場的需求；農殘超標、老參地等問題也極大地限制了人工栽培西洋參的發展。西洋參組織培養方法具有不受生長季節限制、不攜帶病毒、培養周期短等優點，且易于進行工業化大規模生產，因此具有很大的發展前途。目前我國關于西洋參組織培養的報道很多，但主要集中于愈傷組織以及懸浮細胞的培養。

發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種西洋參不定根組織培養方法。本發明的技術方案概述如下:一種西洋參不定根組織培養方法，包括如下步驟:( I)西洋參愈傷組織的誘導:取滅菌后的西洋參新鮮根除去根皮的組織，切成0.5 Icm2的小塊接種到第一種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 4周，形成愈傷組織；( 2)西洋參愈傷組織的繼代培養:
將愈傷組織接種到第二種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 4周；(3)西洋參不定根的誘導:將步驟(2)獲得的繼代培養出的愈傷組織接種到第三種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 5周，培養出西洋參不定根；(4)西洋參不定根的繼代培養:挑選出生長良好的步驟(3)獲得的西洋參不定根接種到液體培養基內，在搖床上，在無菌、23-25°C及避光條件下培養4 5周，獲得西洋參不定根；(5)西洋參不定根的反應器培養:將步驟(4)獲得的西洋參不定根接種到含有2L液體培養基的3L球形鼓泡式反應器中，在無菌、20-25°C及避光條件下培養4 5周，收獲，干燥；所述第一種固體培養基為:含有1.0-2.0mg/L(2, 4_ 二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)、0.1-0.5mg/L 激動素(KT)、30_40g/L 蔗糖的 pH=5.8-6.0 的 MS 固體培養基；
所述第二種固體培養基為:含有1.0-2.0mg/L (2, 4_ 二氯苯氧基)乙酸(2，4-D)、0.1-0.5mg/L6-芐基腺嘌呤(6-BA)、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固體培養基；所述第三種固體培養基為:含有1.0-5.0mg/L吲哚丁酸(IBA)、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固體培養基；所述液體培養基為含有3.0-5.0mg/L吲哚丁酸(IBA)、0.5-1.0mg/L萘乙酸(NAA)、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS液體培養基。本發明的優點:本發明利用組織培養方法培養西洋參不定根，比培養西洋參細胞更具有實際意義，其生長速率要比原根快很多，(反應器培養時一個培養周期后可增殖21.76倍)并且其活性次生代謝產物的產率高且比較穩定，培養物均一，同時又不受天災等自然環境的影響。本發明具有工藝過程簡單，成本低廉，誘導率高，重復性好，不定根增殖快等特點。提供一種西洋參不定根組織培養及的產品開發的方法。


圖1為不同激素及配比對不定根誘導的影響。圖2為西洋參不定根液體培養體系的建立；圖中:A.西洋參愈傷組織B.不定根的誘導C.不定根接種于液態培養基D.西洋參不定根培養體系。圖3為不同激素對不定根生長的影響。圖4為西 洋參不定根反應器培養及收獲的不定根；圖中:A西洋參不定根反應器培養西洋參不定根反應器培養收獲的不定根。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1一種西洋參不定根組織培養方法，包括如下步驟:( I)西洋參愈傷組織的誘導:將栽培西洋參的新鮮根用自來水沖洗干凈，至于45°C烘箱中烘干表面，然后在超凈臺中用75%的乙醇噴灑表面，用酒精燈火焰灼燒至干以消毒滅菌，之后用滅過菌的解剖刀在根表面割一個Icm的切口，并從兩邊掰開，再把內部的組織切成0.5 Icm2的小塊接到事先準備好的第一種固體培養基上，在無菌、23°C及避光條件下培養4周，形成愈傷組織；(2)西洋參愈傷組織的繼代培養:選擇生長良好的愈傷組織，用事先滅菌的解剖刀和鑷子接種于準備好的第二種固體培養基上，在無菌、23°C及避光條件下培養4周；(3)西洋參不定根的誘導:選擇生長良好步驟(2)獲得的繼代培養出的愈傷組織用事先滅菌的解剖刀和鑷子接種于第三種固體培養基上，在無菌、23°C及避光條件下培養4周，培養出西洋參不定根；(4)西洋參不定根的繼代培養:挑選出生長良好的步驟(3)獲得的西洋參不定根用事先滅菌的解剖刀和鑷子接種到液體培養基內，在IOOrpm速度的搖床上，在無菌、23°C及避光條件下培養4周，獲得西洋參不定根；即可建立西洋參不定根液體培養體系(見圖2)，培養過程中不同激素對不定根生長的影響見圖3。(5)西洋參不定根的反應器培養:選取生長良好的步驟(4)獲得的西洋參不定根用事先滅菌的解剖刀和鑷子接種到含有2L液體培養基的3L球形鼓泡式反應器中，在無菌、23 °C及避光條件下培養5周，收獲西洋參不定根，見圖4，干燥；第一種固體培養基的配制為:將IOOmL含有2.0mg/L2, 4_D、0.5mg/L KT、30g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.8，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘；第二種固體培養基配制為:將IOOmL含有2.0mg/L2, 4_D、0.5mg/L6_BA、30g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.8，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備；第三種固體培養基配制為:將IOOmL含有3.0mg/L IBA、40g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.8，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用；液體培養基配制為:將IOOmL含有3.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、40g/L蔗糖的MS液體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.8，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用。實施例2一種西洋參不定根組織培養方法，包括如下步驟:
( I)西洋參愈傷組織的誘導:取滅菌后的西洋參新鮮根除去根皮的組織，切成0.5 Icm2的小塊接種到第一種固體培養基上，在無菌、24°C及避光條件下培養3.5周，形成愈傷組織；( 2)西洋參愈傷組織的繼代培養:將愈傷組織接種到第二種固體培養基上，在無菌、24°C及避光條件下培養3.5周；(3)西洋參不定根的誘導:將步驟(2)獲得的繼代培養出的愈傷組織接種到第三種固體培養基上，在無菌、24°C及避光條件下培養5周，培養出西洋參不定根；(4)西洋參不定根的繼代培養:挑選出生長良好的步驟(3 )獲得的西洋參不定根接種到液體培養基內，在搖床上，在無菌、24°C及避光條件下培養4.5周，獲得西洋參不定根；(5)西洋參不定根的反應器培養:將步驟(4)獲得的西洋參不定根接種到含有2L液體培養基的3L球形鼓泡式反應器中，在無菌、20°C及避光條件下培養4.5周，收獲，干燥；第一種固體培養基為:將IOOmL 含有 1.0mg/L2, 4_D、0.lmg/L KT、35g/L 蔗糖的 MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.9，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘；第二種固體培養基配制為:將IOOmL含有1.0mg/L2, 4_D、0.lmg/L6_BA、35g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.9，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備；第三種固體培養基配制為:將IOOmL含有1.0mg/L IBA、30g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.9，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用；液體培養基配制為:將IOOmL含有5.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、30g/L蔗糖的MS液體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至5.9，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用。實施例3一種西洋參不定根組織培養方法，包括如下步驟: (I)西洋參愈傷組織的誘導:取滅菌后的西洋參新鮮根除去根皮的組織，切成0.5 Icm2的小塊接種到第一種固體培養基上，在無菌、25°C及避光條件下培養3周，形成愈傷組織；( 2)西洋參愈傷組織的繼代培養:將愈傷組織接種到第二種固體培養基上，在無菌、25°C及避光條件下培養3周；(3)西洋參不定根的誘導:將步驟(2)獲得的繼代培養出的愈傷組織接種到第三種固體培養基上，在無菌、25°C及避光條件下培養3周，培養出西洋參不定根；(4)西洋參不定根的繼代培養:挑選出生長良好的步驟(3)獲得的西洋參不定根接種到液體培養基內，在搖床上，在無菌、25°C及避光條件下培養4周，獲得西洋參不定根；(5)西洋參不定根的反應器培養:將步驟(4)獲得的西洋參不定根接種到含有2L液體培養基的3L球形鼓泡式反應器中，在無菌、25°C及避光條件下培養4周，收獲，干燥；第一種固體培養基為:將IOOmL 含有 1.5mg/L2, 4_D、0.3mg/L KT、40g/L 蔗糖的 MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至6.0，在121 °C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘；第二種固體培養基配制為:將IOOmL含有1.5mg/L2, 4_D、0.3mg/L6_BA、40g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至6.0，在121°C、
0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備；第三種固體培養基配制為:將IOOmL含有5.0mg/L IBA、35g/L蔗糖的MS固體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用；液體培養基配制為:將IOOmL含有3.0mg/L IBA、1.0mg/L NAA、35g/L蔗糖的MS液體培養基用lmol/L的HCl水溶液和lmol/L的NaOH水溶液調pH至6.0，在121°C、0.1MPa的壓力下滅菌15分鐘備用。

實驗表明，本發明的方法各實施例培養的西洋參不定根，其生長速率要比原根快很多，(反應器培養時一個培養周期后可增殖21.76倍)并且其活性次生代謝產物的產率高且比較穩定，培養物均一。取干燥后的西洋參不定根，加入15-25倍重量的蒸餾水，靜置5_12h，水浴1_5次，每次l_3h。重復水浴2-5次，合并濾液，濃縮到一定體積，以無水乙醇調制終濃度為50-90 %，0-6°C靜置過夜，去上清液，用sevage法去蛋白，干燥，粉碎，得到西洋參多糖粉末。取IOOg上述西洋參多糖，200g羥丙甲基纖維素，150g乳糖，混合均勻后，過100目篩，加入20gl-5%的乙基纖維素的乙醇溶液， 60°C干燥5h，然后過20目篩子整粒，即得到西洋參多糖顆粒制劑。
權利要求
1.一種西洋參不定根組織培養方法，其特征是包括如下步驟: (1)西洋參愈傷組織的誘導: 取滅菌后的西洋參新鮮根除去根皮的組織，切成0.5 Icm2的小塊接種到第一種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 4周，形成愈傷組織； (2)西洋參愈傷組織的繼代培養: 將愈傷組織接種到第二種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 4周; (3)西洋參不定根的誘導: 將步驟(2)獲得的繼代培養出的愈傷組織接種到第三種固體培養基上，在無菌、23 25°C及避光條件下培養3 5周，培養出西洋參不定根； (4)西洋參不定根的繼代培養: 挑選出生長良好的步驟(3)獲得的西洋參不定根接種到液體培養基內，在搖床上，在無菌、23-25°C及避光條件下培養4 5周，獲得西洋參不定根； (5)西洋參不定根的反應器培養: 將步驟(4)獲得的西洋參不定根接種到含有2L液體培養基的3L球形鼓泡式反應器中，在無菌、20-25 °C及避光條件下培養4 5周，收獲，干燥； 所述第一種固體培養基為:含有1.0-2.0mg/L(2, 4- 二氯苯氧基)乙酸、0.1-0.5mg/L激動素、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固體培養基； 所述第二種固體培養基為:含有1.0-2.0mg/L(2，4-二氯苯氧基)乙酸、0.1-0.5mg/L6-芐基腺嘌呤、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固體培養基； 所述第三種固體培養基為:含有1.0-5.0mg/L吲哚丁酸、30-40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS固體培養基； 所述液體培養基為含有3.0-5.0mg/L吲哚丁酸、 0.5-1.0mg/L萘乙酸、30_40g/L蔗糖的pH=5.8-6.0的MS液體培養基。
全文摘要
本發明公開了一種西洋參不定根組織培養方法，包括如下步驟(1)西洋參愈傷組織的誘導；(2)西洋參愈傷組織的繼代培養；(3)西洋參不定根的誘導；(4)西洋參不定根的繼代培養；(5)西洋參不定根的反應器培養；本發明的方法，其生長速率要比原根快很多，培養一個培養周期后可增殖21.76倍，并且其活性次生代謝產物的產率高且比較穩定，培養物均一，同時又不受天災等自然環境的影響。本發明具有工藝過程簡單，成本低廉,誘導率高，重復性好，不定根增殖快等特點。
文檔編號A01H4/00GK103141391SQ201310086310
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者高文遠, 劉輝, 郭松波, 滿淑麗, 王娟 申請人:天津大學