專利名稱：一種CoCl₂處理提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體說，是CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術：
青蒿素作為一種有效的抗瘧疾藥物已經得到全世界的認同。目前，青蒿素的主要來源是從青蒿植株的地上部分提取。Artemisia annua L.(青蒿)又名黃花蒿,是一年生草本藥用植物。由于青蒿中青蒿素的含量比較低(占干重的0.01%-1%)，使得這種藥物的大規模商業化生產受到了限制。雖然現在已經能夠人工合成青蒿素，但是由于難度大，產量低，成本高，不具備商業化生產的可行性。利用組織培養及細胞工程來生產青蒿素是一種很有吸引力的方法。然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0.1%，在芽中，最高含量也只有干重的0.16%，而大多數研究在根中沒有檢測到青蒿素，因此利用組織培養及細胞工程技術來生產青蒿素的可行性不高。另外利用基因工程技術獲得青蒿素含量較高的青蒿新品種是一種較可行的方法，但是目前利用基因工程來提高青蒿素含量還處于嘗試階段，整個技術并不成熟。經對現有技術的文獻檢索發現,Dahua Chen等在《Plant Science》(《植物科學》，2000 年 155 期 179-185 頁)發表了題為“Expression of chimeric farnesyl diphosphatesynthase gene in Artemisia annua L.transgenic plants via Agrobacteriumtumefaciens-mediated transformation”(“通過農桿菌介導轉化在青蒿植株中表達法尼基焦磷酸合酶基因”)的論文，報道通過在青蒿植株中過量表達FPS (法尼基焦磷酸合酶)在原有基礎上提高青蒿素含量2-3倍，但仍只有干重的1%左右。

發明內容
本發明的目的在于克服常規技術中的不足，提供一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，使其有效地提高了青蒿中青蒿素的含量，且無需很高的前期投入、操作簡單、便于規模化生產。 本發明是通過如下技術方案實現的:一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先將青蒿的種子種植于發苗培養基中發苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養基質中用普通營養液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進行按期采收；所述的發苗培養基，是通過在MS培養液中另外添加蔗糖和瓊脂而得，蔗糖和瓊脂在發苗培養基中的濃度分別為30g/L 10g/L ;其中MS培養液為Murashige和Skoog于1962年公布；所述的泥炭珍珠巖培養基質中泥炭和珍珠巖的質量比為1:1。所述青蒿移栽的具體方法是當青蒿苗長至5cm時，將其移栽于泥炭珍珠巖培養基質中。
用CoCl2溶液處理的具體方法是待植物生長至開花前期，用CoCl2溶液噴灑整株植株。所述CoCl2溶液的濃度為ImM-lOOmM。所述的普通營養液，其配方是38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/L CaCl2.2H20、
7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量為水。所述采收時間分別在CoCl2處理后的4小時，8小時，16小時，24小時，48小時，72小時或96小時，優選72小時。本發明的原理在于，用CoCl2溶液處理青蒿植株能夠在短時間(4-96小時)內提高一些青蒿素合成關鍵酶基因的表達，打破青蒿素合成途徑中的一些限速步驟，從而在短時間內積累大量的青蒿素。所 述的一些青蒿素合成關鍵酶基因，是指3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase, HMGR)基因 hmgr、法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase, FPS)基因fps、紫穗槐二烯合成酶(amorpha-4, 11-diene synthase,ADS)基因ads和紫穗槐二烯氧化酶(amorpha-4，11-dieneC-12oxidase, CYP71AV1)基因 cyp71avl。本發明建立了通過CoCl2處理提高青蒿素含量的方法，能有效地提高青蒿中青蒿素的含量，處理過的青蒿中青蒿素的含量比對照提高了 100%以上。本發明的方法不需要利用基因工程方法提高青蒿素含量所要求的相對較高的前期投入，操作簡單，便于規模化生產，對降低青蒿素的生產成本具有非常重要的意義。


圖1為用CoCl2溶液處理青蒿植株后不同時期采收的青蒿中青蒿素含量變化示意圖。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明的實施例作詳細說明:本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例將青蒿種子(來源于重慶酉陽青蒿素含量較高的青蒿品種)種植于發苗培養基上發苗，發苗培養基的配方為MS培養液，其中添加30g/L的蔗糖和10g/L的瓊脂而得。待青蒿苗長至5cm左右移栽于泥炭珍珠巖培養基質(泥炭和珍珠巖的比例為1:1)中，用普通營養液每周澆灌一次。其中普通培養液的配方為38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3^8.8mg/LCaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7Η20、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/L NaCl，余量為水。待植株生長到40cm左右(植株開花前期)，用CoCl2溶液處理青蒿植株，同時用水處理的青蒿植株作為對照。分別采收處理4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時后的整株青蒿的葉片以及水處理的整株青蒿的葉片，用高效液相色譜測定青蒿素含量。結果如圖1所示，水處理的青蒿中青蒿素的含量6.172mg/g DW，在CoCl2溶液處理后，青蒿素的含量有了顯著的提高。在CoCl2溶液處理4小時、8小時、16小時、24小時、48小時、72小時、96小時后青蒿素的含量分別為6.491mg/g Dff,7.503mg/g DW、8.969mg/g DW、10.210mg/gDW、ll.140mg/g DW、13.984mg/g Dff,10.104mg/g DW，其中在處理72小時后青蒿
素的含量達到最高，是對照組的2倍多。應用本發明方法，在開花前期用CoC12溶液噴灑青蒿植株進行處理，可以顯著的提高青蒿植株中青蒿素的含量，同時不影響青蒿植株的生物量，從而顯著地提高了青蒿素的產量。由于本方法采用的CoCl2濃度低，因此具有投資少、效果顯著、方便易行的特點，對于降低青蒿素的生產成本、滿足青蒿素的大規模生產具有重要的意義。
以上所述為本發明的較佳實施例而已，但本發明不應該局限于該實施例所公開的內容。所以凡是不脫離本發明所公開的精神下完成的等效或修改，都落入本發明保護的范圍。
權利要求
1.一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:首先將青蒿的種子種植于發苗培養基中發苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養基質中用普通營養液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進行按期采收； 所述的發苗培養基，是通過在MS培養液中添加蔗糖和瓊脂而得，蔗糖和瓊脂在發苗培養基中的濃度分別為30g/L和10g/L ； 所述的泥炭珍珠巖培養基質中泥炭和珍珠巖的質量比為1:1。
2.根據權利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述青蒿移栽的具體方法是當青蒿苗長至5cm時，將其移栽于泥炭珍珠巖培養基質中。
3.根據權利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:用CoCl2溶液處理的具體方法是待植物生長至開花前期，用CoCl2溶液噴灑整株植株。
4.根據權利要求1、2或3所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:所述CoCl2溶液的濃度為ImM-lOOmM。
5.根據權利要求1所述的CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于: 所述的普通營養液，其配方是 38mg/L KN03、33mg/L NH4NO3、8.8mg/L CaCl2.2H20、7.4mg/L MgSO4.7H2 0、3.4mg/L KH2PO4 和 4g/LNaCl，余量為水。
6.根據權利要求1CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收時間在CoCl2處理后的4小時，8小時，16小時，24小時，48小時，72小時或96小時。
7.根據權利要求1CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于:采收時間在CoCl2處理后的72小時。
全文摘要
本發明公開了一種CoCl2處理提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于首先將青蒿的種子種植于發苗培養基中發苗，然后將青蒿苗移栽于泥炭珍珠巖培養基質中用普通營養液每周澆灌青蒿苗一次，在開花前期用CoCl2溶液處理，然后進行按期采收。本發明能有效地提高青蒿中青蒿素含量，操作簡單，不需要基因工程方法所要求的較高的前期投入，有效降低了青蒿素生產成本，對滿足青蒿素醫藥工業大規模生產具有重要意義。
文檔編號A01G31/00GK103168669SQ20131009341
公開日2013年6月26日 申請日期2013年3月21日 優先權日2013年3月21日
發明者開國銀, 李青青 申請人:上海師范大學