本發明涉及一種藥用原料升壓素的生物提取方法，屬于生物工程領域，具體是一種升壓素溶液的提取工藝。

背景技術：

升壓素又名加壓素、抗利尿激素，是由下丘腦的視上核和室旁核的神經細胞分泌的9肽激素，分子式為：C43H67N15O12S2，分子量為：1050.22，經下丘腦-垂體束到達神經垂體后葉后釋放出來。其主要作用是提高遠曲小管和集合管對水的通透性，促進水的吸收，是尿液濃縮和稀釋的關鍵性調節激素。主要用作尿崩癥、食管靜脈曲張出血的治療。

未見有用生物提取方法制備升壓素的報道，有報道用制備型高效液相純化合成的升壓素，雖然可以達到純度95%以上，但是其收率卻只有20%左右。

技術實現要素：

本發明的目的是尋找出一條工藝路線，在提高產品收率的同時能提高產品的純度。采用樹脂交換、超濾、制備型高效液相純化等技術相結合的手段來純化分離解決了這一問題。

為實現本發明的目的，本發明采用以下技術方案：

一種升壓素溶液的提取工藝，具體步驟如下：

⑴原料提取：垂體后葉粉中加入醋酸，攪拌提取，過濾；濾餅中再次加入醋酸，攪拌提取，過濾；合并兩次濾液；

⑵除蛋白：溶液攪拌加熱至一定溫度，保溫一段時間，冷卻至室溫；

⑶樹脂交換：先用平衡液（1×10-4mol/L的NaOH溶液中加入酸調節pH值）平衡離子交換樹脂柱，然后進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，吸光值在原有吸光值上升時收集升壓素，在收集升壓素的同時，不斷用酸調節收集液的PH值，當吸光值為降至0.4時，停止收集；

⑷超濾：將收集的上述升壓素用超濾器超濾，收集濾液；

⑸制備型高效液相粗分離純化：將步驟⑷中的濾液用0.45μm的濾膜過濾，然后使用制備型高效液相色譜儀進行粗分離純化，具體步驟包括：5a.平衡制備柱；5b.將步驟⑷超濾后的升壓素溶液上樣；5c.平衡制備柱；5d.用流動相洗脫樣品，收集分離純化的粗分液；

⑹制備型高效液相精制：將步驟⑸中的升壓素溶液稀釋，然后使用制備型高效液相色譜儀進行精制純化，步驟具體包括：6a.平衡制備柱；6b.將稀釋后的升壓素溶液上樣；6c.平衡制備柱；6d.用流動相洗脫，分析型高效液相跟蹤測定，收集成分峰；

⑺濃縮：將精制后的升壓素溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮，濃縮至為原體積的2/3以下，加入乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3以下，再加入乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3以下，收集濃縮后的升壓素溶液，用適量注射用水分三次洗滌濃縮圓底燒瓶，并入濃縮液中混合均勻，得升壓素溶液。

優選步驟⑴中的醋酸溶液的濃度為0.2%～0.3%；加入的醋酸溶液的量為20～30mL/g垂體后葉干粉量；提取的溫度為45～55℃；提取時間為10～20min。

優選步驟⑵中的加熱溫度為95～100℃；保溫時間為10～20min。

優選步驟⑶中平衡液的配制中調節PH所用的酸為醋酸，調節PH值為3.5～4.5；用0.1～0.3M的氯化鈉溶液來洗脫；在收集升壓素的過程中調節pH值所用的酸為醋酸，調節PH值為3.5～4.0。

優選步驟⑷中的超濾膜截留分子量為10000道爾頓。

優選步驟⑸中的制備色譜柱為C18柱；流動相為：0.2M磷酸三乙胺緩沖液-乙腈（80～90：20～10）；檢測波長為280nm；步驟5a和5c中平衡制備柱用的平衡液均為0.2M磷酸三乙胺緩沖液。

優選步驟⑹制備色譜柱為C18柱；流動相為：0.5%醋酸溶液-乙腈（比例為75～85：25～15）；檢測波長為280nm；步驟6a和6c中平衡制備柱用的平衡液均為2%醋酸溶液。

優選步驟⑺中減壓濃縮過程中水浴溫度38~40℃，真空壓力為0.07～0.10MPa，加入的乙醇溶液的濃度為95%。

有益效果：

本發明采用多種分離純化手段相結合的工藝，直接從動物腦垂體中分離純化得到升壓素，得到的產品能夠保證收率達到75%以上，同時產品的純度也可以達到98%以上。所用的原料廉價易得，工藝中用到的丙酮、乙醇等有機試劑均可回收再利用。該工藝操作簡單、環保、生產周期短、生產成本較低等優點，適合大規模工業化生產。

具體實施方式

以下結合實例來進一步解釋本發明，但實施案例并不對本發明做任何形式的限制。

實施例1

稱取垂體后葉粉1000g，向垂體后葉粉中第一次加入0.2%的醋酸溶液20L，45℃下攪拌10min，過濾，得到濾液和濾餅，向濾餅中再加入0.2%的醋酸溶液10L，45℃下攪拌10min，得到濾液，合并兩次濾液。將濾液攪拌加熱至95℃，保溫10min后冷卻至室溫。用PH為3.5的平衡液平衡弱酸型離子交換樹脂柱，用濃度為0.1M的氯化鈉溶液通過平衡好的離子柱洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，吸光值在原有吸光值上升時收集升壓素，在收集升壓素的同時，不斷用酸調節收集液的PH值在3.5左右，當吸光值為降至0.4時，停止收集。將收集的升壓素溶液通過節流分子量為10000道爾頓的超濾器，收集濾液。將濾液用0.45μm的濾膜過濾，用制備型高效液相進行粗分離純化，色譜條件：色譜柱：C18柱，檢測波長：280nm，流動相：0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（80/20），粗分離純化具體包括：a.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1～1.5個柱體積平衡制備柱；b.上樣：將過濾后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1個柱體積平衡制備柱；d.洗脫：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（80/20）流動相洗脫樣品，收集分離純化的粗分液 。用制備型高效液相精制，色譜條件：填充料：C18，檢測波長：280nm，流動相：0.5%醋酸/乙腈（比例為75/25），具體包括：a.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱；b.上樣：將稀釋后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱，再用0.5%醋酸溶液平衡制備柱約1個柱體積；；d.洗脫：用流動相洗脫，分析型高效液相跟蹤測定，收集成分峰。最后將精制后的升壓素溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮，水浴溫度為38℃，真空壓力為0.10MPa，濃縮至為原體積的2/3時，加入95%的乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3，再加入乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3以下，收集濃縮后的升壓素溶液，用適量注射用水分三次洗滌濃縮圓底燒瓶，并入濃縮液中混合均勻，得升壓素溶液360ml,檢測其純度為98.6%，收率為75.6%。

實施例2

稱取垂體后葉粉800g，向垂體后葉粉中第一次加入0.25%的醋酸溶液20L，50℃下攪拌15min，過濾，得到濾液和濾餅，向濾餅中再加入0.25%的醋酸溶液12L，50℃下攪拌15min，得到濾液，合并兩次濾液。將濾液攪拌加熱至98℃，保溫15min后冷卻至室溫。用PH為4.0的平衡液平衡弱酸型離子交換樹脂柱，用濃度為0.2M的氯化鈉溶液通過平衡好的離子柱洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，吸光值在原有吸光值上升時收集升壓素，在收集升壓素的同時，不斷用酸調節收集液的PH值在3.8左右，當吸光值為降至0.4時，停止收集。將收集的升壓素溶液通過節流分子量為10000道爾頓的超濾器，收集濾液。將濾液用0.45μm的濾膜過濾，用制備型高效液相進行粗分離純化，色譜條件：色譜柱：C18柱，檢測波長：280nm，流動相：0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（85/15），粗分離純化具體包括：a.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1～1.5個柱體積平衡制備柱；b.上樣：將過濾后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1個柱體積平衡制備柱；d.洗脫：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（85/15）流動相洗脫樣品，收集分離純化的粗分液 。用制備型高效液相精制，色譜條件：填充料：C18，檢測波長：280nm，流動相：0.5%醋酸溶液/乙腈（比例為80/20），具體包括：a.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱；b.上樣：將稀釋后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱，再用0.5%醋酸溶液平衡制備柱約1個柱體積；d.洗脫：用流動相洗脫，分析型高效液相跟蹤測定，收集成分峰。最后將精制后的升壓素溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮，水浴溫度為39℃，真空壓力為0.09MPa，濃縮至為原體積的2/3時，加入95%的乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的1/3，再加入乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3以下，收集濃縮后的升壓素溶液，用適量注射用水分三次洗滌濃縮圓底燒瓶，并入濃縮液中混合均勻，得升壓素溶液270ml，檢測其純度為99.0%。收率為75.9%。

實施例3

稱取垂體后葉粉600g，向垂體后葉粉中第一次加入0.3%的醋酸溶液18L，55℃下攪拌20min，過濾，得到濾液和濾餅，向濾餅中再加入0.3%的醋酸溶液12L，55℃下攪拌20min，得到濾液，合并兩次濾液。將濾液攪拌加熱至100℃，保溫20min后冷卻至室溫。用PH為4.5的平衡液平衡弱酸型離子交換樹脂柱，用濃度為0.3M的氯化鈉溶液通過平衡好的離子柱洗脫，收集洗脫液，將洗脫液在280nm下進行紫外檢測，吸光值在原有吸光值上升時收集升壓素，在收集升壓素的同時，不斷用酸調節收集液的PH值在4.0左右，當吸光值為降至0.4時，停止收集。將收集的升壓素溶液通過節流分子量為10000道爾頓的超濾器，收集濾液。將濾液用0.45μm的濾膜過濾，用制備型高效液相進行粗分離純化，色譜條件：色譜柱：C18柱，檢測波長：280nm，流動相：0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（85/15），粗分離純化具體包括：a.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1～1.5個柱體積平衡制備柱；b.上樣：將過濾后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液1個柱體積平衡制備柱；d.洗脫：用0.2M磷酸三乙胺緩沖液/乙腈（90/10）流動相洗脫樣品，收集分離純化的粗分液 。用制備型高效液相精制，色譜條件：填充料：C18，檢測波長：280nm，流動相：0.5%醋酸溶液/乙腈（比例為85/15），具體包括：a.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱；b.上樣：將稀釋后的升壓素溶液上樣；c.平衡：用2%醋酸溶液平衡制備柱；再用0.5%醋酸溶液平衡制備柱約1個柱體積；d.洗脫：用流動相洗脫，分析型高效液相跟蹤測定，收集成分峰。最后將精制后的升壓素溶液經旋轉蒸發儀減壓濃縮，水浴溫度為40℃，真空壓力為0.07MPa，濃縮至為原體積的2/3時，加入95%的乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3，再加入乙醇溶液，搖勻后繼續濃縮至原體積的2/3以下，收集濃縮后的升壓素溶液，用適量注射用水分三次洗滌濃縮圓底燒瓶，并入濃縮液中混合均勻，得升壓素溶液 200ml，檢測其純度為98.8%，收率為76.1%。