專利名稱：利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法。
背景技術：
東北刺人參el la tus Nakai)又名刺參,五加科刺參屬，多年生落葉灌木，是我國長白山特有的藥用植物。東北刺人參分布區域十分狹窄，主要分布于吉林省長白山區，俄羅斯、朝鮮也有少量分布。近10年來，由于人為大量采挖，自然資源遭到嚴重破壞。目前，長白山區天然東北刺人參資源已瀕臨滅絕，被列為國家二類保護植物，吉林省一類保護植物。東北刺人參的根和莖中含有多種皂苷、黃酮、揮發油、蒽醌、脂肪酸、蛋白質、糖類和酚類等成分，以其干燥的根和莖作為藥材，功效可用于治療神經衰弱、低血壓、糖尿病、精神憂郁等，且無任何毒副作用，在長白山區被稱作“木本人參”。東北刺人參具有抗衰老作用，用刺人參醇水提取物給小白鼠灌胃，發現可延長小白鼠持續游泳的時間，耐缺氧能力提高64 %，檢測10多項與衰老相關指標的結果，發現有明顯的抗衰老作用。東北刺人參既可采用有性繁殖也可采用無性繁殖。但有性繁殖，因天然生長的東北刺人參結實率低，種子很少，偶爾采到的種子，發芽率很低。針對刺人參種子發芽率低的問題，劉繼生等采用種子層積處理法促進東北刺人參種胚后熟，從而使發芽率提高到56.8% ;但種子繁殖的苗木經多年栽培后，因 病蟲害危害往往出現死亡現象。刺人參無性繁殖包括分株、壓條或扦插等方式。其中分株法是利用有匍匐莖節間不定芽可獲得分生苗；壓條是在刺人參生長季節，選擇生長旺盛的長枝，并在節間刻傷組織后埋入土中，待小苗長出與母株分離后，成為獨立植株；扦插繁殖是用莖、根或帶芽的根莖作為插穗，用生長素處理后插入苗床，生根率較高，但移植成活率低。將通過無性繁殖得到的苗(扦插、壓條等)進行栽種，發現栽植后有假死現象，且恢復期生長期長。另外，無性繁殖的另一問題是，因種質資源瀕危的現狀，繁殖材料來源短缺。東北刺人參也可通過組織培養，獲得種苗，但東北刺人參試管苗的馴化條件苛刻，成活率低，難以大量提供生產用苗。為了引種野生植株，1989年柳麗等利用仿生栽培技術，對刺人參進行引種試驗，結果發現刺人參帶根移植成活率高，扦插苗成活率較低。此外，張順捷等也做了引種試驗，發現東北刺人參苗木在牡丹江地區引種可以成活。盡管如此，目前，東北刺人參尚未建立完善的苗木繁殖和人工栽培體系，所以在中藥及臨床應用上存在資源短缺的問題，導致刺人參產品及醫藥產業的發展受到阻礙。目前，因野生資源逐年匱乏，許多藥用植物都在進行人工栽培。但大田栽培時，植物生長受氣候、地理和季節的限制，且由于栽培管理中使用了農藥化肥，導致有害物質的殘留；同時有效物質含量不穩定、藥材與農作物爭地等問題也是困擾我國中藥材產業發展的難題。植物組織或器官培養物中有效成分含量高且穩定，因此，以組織培養物代替其原植株作為藥源，是實現野生東北刺人參資源可持續利用的有效方式之一，這對拯救野生東北刺人參資源有著極其重要的意義。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法。具體是以東北刺人參種子誘導的不定根為材料，通過生物反應器諸理化參數的調控，進而建立不定根反應器培養體系，同時探明東北刺人參的抗氧化特性，為長白山區瀕危植物東北刺人參資源的保護和開發利用提供一種新方法。為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案:
一種利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法，在5 L生物反應器中注入4 L MS培養基附加IBA 3 4 mg/L，白糖40 50 g/L，pH為5.8，注入空氣75 100 mL/min，接種20 40g不定根外植體進行暗培養，培養4(T50 d后獲得大量東北刺人參不定根，其中液體培養基的注入量與生物反應器的體積呈倍性增加的關系，所述的生物反應器為氣升式生物反應器。本發明的氣升式生物反應器是氣動式反應器中的一種，其流動性均勻，提供低剪切力環境，結構簡單，沒有其他生物反應器(如攪拌式反應器)所具有的如泄漏點和死角多等缺點。其主要的工作原理:氣體由反應器底部的流量計和過濾膜進入反應器，通過氣體分布裝置(噴嘴)霧狀噴入反應器內培養基中，經過氣液分離后在反應器上部排除，從而帶動液體和培養物在反應器的循環流動，達到攪拌目的。利用氣升式生物反應器對東北刺人參不定根進行培養可以提高增殖速度，在短期內獲得大量的外植體。同時從成本角度考慮，生物反應器培養可減少培養基成本(瓊脂使用費)，另一方面又可以減少操作人員數，從而降低勞動強度和生產成本。因此，生物反應器培養可為商業化生產提供一種新的途徑，并能解決目前東北刺人參野生植株瀕危及人工栽培難度大的問題，為長白山區瀕危植物東北刺人參資源的保護和開發利用提供一種新方法。 下面結合附圖對本發明`實施例進行詳細說明。


圖1為本發明生物反應器的結構示意圖。
具體實施例方式如圖1，利用氣升式生物反應器培養東北刺人參不定根，圖1中a:插頭；b:氣泵；c:空氣流量計；d:過濾膜；e:多孔噴嘴(孔徑15Mm) ； f:出氣口 ；箭頭表示空氣流動方向。具體實施步驟如下:
(一)材料與方法
1.東北刺人參不定根生物反應器培養 ①.1BA濃度的篩選
在5 L氣升式生物反應器中，注入4 L液體培養基，培養基為MS (植物組織培養常用的培養基)加入不同濃度的IBA (吲哚乙酸)(2、3、4、5和6 mg/L)，pH調節5.8，在溫度121。。，壓力為1.2 kg/cm2的條件下高壓滅菌40 min，冷卻后注入反應器中，然后在每個反應器中接入 20 g 不定根，注入 50 mL/min (air volume/culture volume/min.)的空氣,在溫度為25±2 °C的條件下進行暗培養，培養40 d后調查不定根的鮮物重和干物重。②.白糖濃度的篩選
依據上述試驗結果，以白糖作為碳源，濃度設為30、40、50和60 g/L，其它條件同上，培養40 d后調查不定根的鮮物重和干物重。③.培養密度的篩選
依據上述試驗結果，在MS+IBA 3 mg/L+白糖50 g/L的培養基中，分別在每個反應器內接種10、20、30和40 g不定根，其它條件同上，培養40 d后調查不定根的鮮物重和干物重。④.空氣注入量的篩選
依據上述試驗結果，每個反應器內接種20 g不定根，暗培養，通氣量設置為50、75、100和125 mL/min，其它條件同上，培養40 d后調查不定根的鮮物重和干物重。⑤.培養天數的確定
依據上述實驗結果，通氣量設置為75 mL/min，其他條件同上，接種后5 d開始每隔
5d停止培養一個反應器，調查不定根的鮮物重和干物重，直至第50 d。2.東北刺人參不定根的抗氧化活性
從東北刺人參反應器培養40 d的不定根和栽培2年和5年植株根和莖中提取酚及多糖，比較酚和多糖含量，并采用DPPH自由基清除活性方法分析其抗氧化活性。(二)結果與分析
1.東北刺人參不定根生物反應器培養:..IBA濃度的篩選
植物生長調節劑對不定根生長影響很大，本試驗結果表明IBA濃度在31 mg/L范圍內鮮物重和干物重較高，平均值分別達到332.9 g和29.7 g，其中IBA濃度為3 mg/L時鮮物重和干物重達到最大值，分別為378.3 g和34.8 g。當IBA濃度在3 4 mg/L范圍之外鮮物重和干物重逐漸下降，不定根的增殖率也呈下降的趨勢，在IBA濃度為3 mg/L時增殖系數最大，達到18.0。f.白糖濃度的篩選
將東北刺人參根切成約I Cm長，接種于MS附加IBA 3 mg/L的培養基中，30 d后調查結果，白糖濃度為4(T50 g/L時，不定根的增殖系數較大，平均值達到25.05，當白糖濃度為50 g/L時增殖系數最大，達到26.6，顯著好于其它處理。1.培養密度的篩選
本試驗結果表明反應器內接種密度為20 40 g時，不定根的鮮物重、干物重和增殖系數均較高，顯著好于其他處理，平均值分別達到355.47 g、32.47 g和12.23，當接種量為20g時，不定根的鮮物重、 干物重和增殖系數最大，分別為412.4 g、40.5 g和19.6，接種量增加產量下降不利于其生長。S.空氣注入量的篩選
反應器中通入空氣，不僅能夠維持培養基中的氧氣濃度，而且對植物的生長以及代謝產物都起到作用。當通氣量為75 100 mL/min時，不定根長勢較好，鮮物重和干物重平均值分別達到346.7 g和35.25 g，其中通氣量為75 mL/min時鮮物重和干物重達到最大，分別為368.9 g和38.1 g,均好于其他處理。當通氣量為50 mL/min時,可能是由于氧氣不足鮮重和干重較少，當通氣量高于100 mL/min時生物量有所下降，由于氣體脅迫，不定根生長和分化效果不好。⑤.培養天數的確定
將東北刺人參不定根接種在含有MS+ IBA 3 mg.L—1+白糖50 g.L—1培養基中，培養至第
5d時幾乎沒有太大變化，10 d左右不定根開始膨大變粗，到15 d時，不定根開始分化出細根，18 d浮于液面上，不定根顏色較白，35 d之后不定根生長緩慢，在40飛0 d時鮮物重和干物重較高，其中40 d時干重達到最大26.3 g02.東北刺人參不定根的抗氧化活性
反應器培養40 d刺人參不定根和2年生和5年生栽培刺人參根和莖中酚和多糖含量的比較，發現反應器中培養40 d的東北刺人參不定根和栽培的刺人參在總酚含量上有區別，本試驗結果得出培養40 d后的不定根的總酚含量明顯高于栽培刺人參根和莖中的含量，不定根中總酚達到56 mg/g DW，產量達到490.0 mg/L，栽培的刺人參根和莖中總酚含量很接近，根中略高。多糖方面，不定根中含量和2年生刺人參中的含量相接近，達到70.0 mg/gDW，產量達到 612.5 mg/L。同時，還可以看出反應器生產的不定根的多糖提取液和酚提取物對DPPH自由基有較明顯的清除能力，且清除能力隨著濃度的升高而增強。其中，酚提取物對DPPH消除率從26.6 %增長至94 %，而栽培2年生和5年生的無論是根還是莖的提取液在濃度為0.8mg/L時只達到了 50 %左右。在相同的濃度下，反應器中不定根的多糖和酚溶液的消除率均顯著高于2年生和5年生的栽培刺人參。東北刺人參不定根具有較高的抗氧化活性，因此作為抗氧化藥物的開發 ，有很高的利用價值。
權利要求
1.一種利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法，在5 L生物反應器中注入4 LMS培養基附加IBA 3 4 mg/L,白糖40 50 g/L，pH為5.8，注入空氣75 100 mL/min，接種2(T40 g不定根外植體進行暗培養，培養4(T50 d后獲得大量東北刺人參不定根，其中液體培養基的注入量與生物反應器的體積呈倍性增加的關系，所述的生物反應器為氣升式生物反應器。`
全文摘要
本發明公開了一種利用生物反應器培養東北刺人參不定根的方法，在5L氣升式生物反應器中注入4LMS培養基附加IBA3~4mg/L，白糖40~50g/L，pH為5.8，注入空氣75~100mL/min，接種20~40g不定根外植體進行暗培養，培養40~50d后獲得大量東北刺人參不定根。所獲得的東北刺人參不定根總酚含量均高于2年生和5年生栽培刺人參根和莖中的含量；不定根中多糖含量與2年生栽培刺人參根中的含量接近；本發明可以提高增殖速度，在短期內獲得大量的外植體。生物反應器培養可減少培養基成本，又降低勞動強度和生產成本，解決目前東北刺人參野生植株瀕危及人工栽培難度大的問題，為商業化生產提供一種新的途徑。
文檔編號A01H4/00GK103141394SQ20131010190
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月28日 優先權日2013年3月28日
發明者廉美蘭, 樸炫春, 高日, 于丹, 吳春花, 吳松權 申請人:延邊大學