一種人參不定根誘導增殖方法
【專利摘要】本發明涉及一種人參不定根誘導增殖方法，包括以下步驟：將人參組培苗切割成組織小塊后接種于固體誘導培養基中誘導形成不定根，將所述不定根切割成不定根小塊后接種于液體增殖培養基中進行不定根的增殖培養；其中，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為1-10mg/L的吲哚丁酸。利用本發明所提供的方法，可以顯著提高誘導獲得的不定根數量，而且，將誘導獲得的不定根進行增殖培養后，與利用愈傷組織進行不定根誘導的方法相比不定根增殖率更高，增殖效果更好。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物組織培養【技術領域】，具體的涉及一種人參不定根誘導增殖方法。

【背景技術】
[0002] 人參（PanaxginsengC.A.Meyer)是五加科人參屬多年生雙子葉植物，為古老而 名貴的中藥材，具有調節人體免疫力、抗癌和抗糖尿病等多種作用。人參皂苷是其主要的活 性物質。近年來，國內外對于人參的需求快速增長。但是，由于長期過度采挖，人參野生資 源已基本枯竭，且人參栽培周期長，易受氣候、病蟲害及栽培條件的影響，難以滿足越來越 大的市場需求。人參組織培養技術周期短，不受季節限制，容易進行大規模的工業化生產， 具有很大的發展前景。
[0003] 利用發根農桿菌誘導人參產生的發根生長迅速，皂苷種類與田間栽培的人參 相同，含量比普通的細胞培養物高，且利用生物反應器大規模培養人參發根的體系也已 建 立[JeongGT,ParkDH,HwangB,etal.Comparisonofgrowthcharacteristics ofPanaxginsenghairyrootsinvariousbioreactors[J]?ApplBiochem Biotechnol，2003, 107:493]。然而，由于發根誘導過程中外源基因的導入具有潛在的安全 性問題，因此該技術沒有用于商業化。
[0004] 近年來，不經過發根農桿菌轉化直接誘導人參不定根的研宄取得了較大進展。但 不定根一般是由人參愈傷組織誘導產生的[SivakumarG,YuKW,PaekKY.Productionof biomassandginsenosidesfromadventitiousrootsofPanaxginsenginbioreactor cultures[J].EngLifeSci, 2005, 4:333]。上述方法的缺陷在于：需要先誘導愈傷組織，導 致實驗周期長。
[0005] 因此，有必要提供一種簡便的直接利用人參組培苗作為外植體的不定根誘導增殖 方法。


【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于提供一種利用人參組培苗的根、莖段或葉片誘導不定根產生及 對不定根進行增殖培養的方法。
[0007] 為達到以上目的，本發明提供了一種不定根誘導增殖方法，包括以下步驟：
[0008] 將人參組培苗切割成組織小塊后接種于固體誘導培養基中誘導形成不定根，將所 述不定根切割成不定根小塊后接種于液體增殖培養基中進行不定根的增殖培養；
[0009] 其中，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養 基含有濃度為l-l〇mg/L的吲哚丁酸（IBA)。
[0010] 優選的為了獲得更好的人參不定根誘導增殖效果，所述固體誘導培養基和液體增 殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為2-5mg/L的吲哚丁酸。
[0011] 可選的，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基還含有濃度為1. 8-2. 2質量％的 蔗糖。
[0012] 可選的，所述誘導增殖方法包括以下步驟：
[0013] 1)將人參組培苗切割成組織小塊，利用固體誘導培養基在培養溫度為23_25°C的 黑暗條件下誘導培養3-6周獲得不定根；
[0014] 2)將步驟1)獲得的不定根切割成不定根小塊，利用液體增殖培養基在培養溫度 為23-25°C的黑暗條件下以50-80rpm的速度震蕩培養3-9周。
[0015] 可選的，所述組織小塊為對人參組培苗根進行切割獲得的人參組培苗根小塊、對 人參組培苗莖段進行切割獲得的人參組培苗莖小塊或對人參組培苗葉片進行切割獲得的 人參組培苗葉小塊。
[0016] 可選的，所述人參組培苗為經種子萌發或者外植體離體培養獲得的組培苗，組培 苗的日齡為28-32天。
[0017] 可選的，所述人參組培苗的品種為石柱參或大馬牙參。
[0018] 利用本發明所提供的方法，可以顯著提高誘導獲得的不定根數量，而且，將誘導獲 得的不定根進行增殖培養后，與利用愈傷組織進行不定根誘導的方法相比不定根增殖率更 高，增殖效果更好。此外本發明所提供的方法可以大大縮短獲得人參不定根的時間，通過直 接對人參組培苗進行不定根誘導增殖避免了將組培苗培養成完整植株后取得外植體進行 愈傷組織誘導培養的步驟，縮短了實驗周期。為利用人參不定根生產人參皂苷奠定了良好 的基礎，也為利用人參不定根進行代謝途徑的基礎研宄提供了重要的材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為人參組培苗不同組織誘導增殖產生的不定根；
[0020] 圖中，（A)為利用人參組培苗根誘導培養不定根的情況；(B)為利用人參組培苗莖 段誘導培養不定根的情況；(C)為利用人參組培苗葉片誘導培養不定根的情況。
[0021] 圖2為人參組培苗不同組織誘導產生不定根的增殖情況；
[0022] 圖中，（A)為組培苗根；⑶為組培苗莖段；（C)為組培苗葉片；l/2MS(-N)+5mg/L IBA和l/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培養基類型；1st代表第一次繼代，2nd代表第二次繼代， 3rd代表第三次繼代。
[0023] 圖3為五年生人參的根愈傷組織誘導產生不定根的增殖培養；
[0024] l/2MS(-N)+5mg/LIBA和l/2MS(-N)+2mg/LIBA代表培養基類型；1st代表第一次 繼代，2nd代表第二次繼代，3rd代表第三次繼代。

【具體實施方式】
[0025] 下面將通過【具體實施方式】對本發明進行詳細說明。
[0026] 本發明提供了一種人參不定根誘導增殖方法，包括以下步驟：
[0027] 將人參組培苗切割成組織小塊后接種于固體誘導培養基中誘導形成不定根，將所 述不定根切割成不定根小塊后接種于液體增殖培養基中進行不定根的增殖培養；
[0028] 其中，所述固體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(_N)培養基為基本培養 基含有濃度為l-l〇mg/L的吲哚丁酸。
[0029] 在本發明所提供的方法中，為了提高誘導和增殖的效果，所述固體誘導培養基和 液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為2-5mg/L的吲哚丁酸。
[0030] 在本發明中，所述人參組培苗為經種子萌發得到的組培苗或者經過外植體離體培 養獲得的再生植株組培苗。優選的情況下，當利用本發明提供的方法對經過離體培養獲得 的人參組培苗進行誘導增殖時，能夠獲得優異的不定根誘導增殖效果。
[0031] 其中，本發明所提供的方法對于經種子萌發得到的組培苗的獲得方法沒有特別的 限制，可以是按照本領域常規的處理方法獲得的，例如，在本發明的一種實施方式中，經種 子萌發得到組培苗的方法可以為：取經層積處理后的人參裂口種子，剝去外殼，經70%乙 醇浸泡1分鐘后，于1 %次氯酸鈉中消毒20分鐘，無菌水清洗3-4次后，于超凈臺剝出完整 胚，接種于1/2MS培養基，在24±2°C黑暗培養3天后，轉入光下培養4周后即可用于不定根 的誘導。
[0032] 其中，本發明所提供的方法對于通過外植體離體培養體系獲得再生植株組培苗的 方法沒有特別的限制，可以是按照本領域常規的處理方法獲得的，例如，在本發明的一種實 施方式中，通過外植體離體培養體系獲得再生植株組培苗的方法可以為：將人參種子去殼 后，用70 %乙醇表面消毒1分鐘后，轉入1 %次氯酸鈉溶液消毒20分鐘，無菌水清洗3-4次， 然后在超凈工作臺用無菌解剖刀小心取出胚，接種至1/2MS培養基（含2%蔗糖和7g/L瓊 月旨，pH值為5. 8)于24±2°C黑暗培養3天后，切下子葉接入MS+lmg/L2, 4-二氯苯氧乙酸的 培養基（含3%蔗糖和7g/L瓊脂，pH值為5. 8)，于24±2°C，16小時光照/8小時黑暗條件 下培養。取生長狀態良好的胚性愈傷組織轉入不含激素的MS培養基（含5%蔗糖和IOg/ L瓊脂，pH值為5. 8)進行體細胞胚的誘導。約一個月后，將誘導出的體細胞胚轉入含5mg/ L赤霉素的1/2MS培養基（含2%蔗糖和2. 5g/L植物凝膠，pH值為5. 8)進行植株的萌發， 然后將再生植株轉入不含順4勵3的1/2MS培養基（含2%蔗糖和2. 5g/L植物凝膠，pH值為 5. 8)進行生根培養，約3周左右即可生根，獲得再生植株組培苗。
[0033] 在本發明所提供的方法中，所述組織小塊為人參組培苗根小塊、人參組培苗莖小 塊或人參組培苗葉小塊。
[0034] 在本發明的一種優選的實施方式中，所述組織小塊的尺寸可以約為 5mmX5mmX3mm。對所述組培苗和不定根進行切割的過程中應注意器械滅菌和保持無菌環 境以避免污染。
[0035] 在本發明所提供的方法中，1/2MS(_N)培養基為大量元素減半其他成分不變的 MS(-N)培養基，其中，MS(-N)培養基是不含有硝酸銨的MS培養基。
[0036] 其中，MS(-N)培養基的配方為：硝酸鉀1900mg/L、磷酸二氫鉀170mg/L、硫酸鎂 370mg/L、氯化f^HAOmg/L、碘化鉀 0? 83mg/L、硼酸 6. 2mg/L、硫酸猛 22. 3mg/L、硫酸鋅 8. 6mg/ U鉬酸鈉0? 25mg/L、硫酸銅0? 025mg/L、氯化鈷0? 025mg/L、乙二胺四乙酸二鈉37. 3mg/L、硫 酸亞鐵27. 8mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、鹽酸硫胺素0?lmg/L、鹽酸[!比卩多醇0? 5mg/L、 煙酸 0? 5mg/L。
[0037] 在本發明的一種實施方式中，為了使人參組培苗的組織小塊以及誘導獲得的不定 根獲得更加充分的營養，所述固體誘導培養基中還含有濃度為1. 8-2. 2質量％的蔗糖以及 濃度為〇. 65-0. 75質量％的瓊脂。所述液體增殖培養基中含有濃度為1. 8-2. 2質量％的蔗 糖。
[0038] 在本發明的一種實施方式中，所述固體誘導培養基、液體增殖培養基的pH為 5. 8-6. 0〇
[0039] 具體的，所述誘導和增殖的步驟包括：
[0040] 1)將人參組培苗切割成組織小塊，利用固體誘導培養基在培養溫度為23_25°C的 黑暗條件下誘導培養3-6周獲得不定根；
[0041] 2)將步驟1)獲得的不定根切割成不定根小塊，利用液體增殖培養基在培養溫度 為23-25°C的黑暗條件下以50-80rpm的速度震蕩培養3-9周。
[0042] 其中在步驟1)中，組織小塊在固體誘導培養基中培養14-28天后開始長出不定 根。一般的，在固體誘導培養基中培養結束后誘導獲得的不定根的數目可以達到4-13個； 具體的，利用人參組培苗根小塊一般能夠誘導獲得10-13個不定根；利用人參組培苗莖小 塊一般能夠誘導獲得8-12個不定根；利用人參組培苗葉小塊一般能夠誘導獲得4-8個不定 根。
[0043] 在所述誘導培養和增殖培養的過程中，一般需要每3周時間更換一次固體誘導培 養基或液體增殖培養基進行繼代培養，并在每次繼代時統計觀察不定根的誘導和增殖情 況。
[0044] 下面通過實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施 例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發明的范圍進行限制。本領域的技術 人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
[0045] 以下實施例中，采用遼寧寬甸縣的石柱參品種。以下實施例中人參組培苗通過種 子萌發的方式獲得，具體為：取經層積處理后的石柱參裂口種子，剝去外殼，經70%乙醇浸 泡1分鐘后，于1 %次氯酸鈉中消毒20分鐘，無菌水清洗3-4次后，于超凈臺剝出完整胚，接 種于1/2MS培養基，24 ±2°C黑暗培養3天后，轉入光下培養，獲得日齡為30天的組培苗。
[0046] 不定根誘導率=(產生不定根的外植體數/接種外植體總數）X100%。
[0047] 第三周不定根增殖率=(增殖第三周收獲不定根鮮重-接種不定根鮮重）/接種 不定根鮮重XlOO% ;
[0048] 第六周不定根增殖率=(增殖第六周收獲不定根鮮重-增殖第三周收獲不定根鮮 重）/增殖第三周收獲不定根鮮重Xioo% ;
[0049] 第九周不定根增殖率=(增殖第九周收獲不定根鮮重-增殖第六周收獲不定根鮮 重）/增殖第六周收獲不定根鮮重X100% ;
[0050] 實施例1
[0051] 本實施例用于說明利用人參組培苗根誘導不定根。
[0052] 取人參組培苗的根，用滅菌刀切割成約5mmX5mmX3mm的小段，轉入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固體誘導培養基上（固體誘導培養基中含2%蔗糖，7g/L瓊脂，pH 值為5. 8)，于24±2°C，黑暗條件下誘導培養不定根的產生。每個培養皿接種30個外植體， 誘導培養過程中每三周繼代一次，統計不定根誘導率和每個外植體產生的不定根數，試驗 重復3次，取平均值，結果列于表1。
[0053] 結果顯示，經過三周培養后，所有的根都能誘導出不定根，且每條根上均只誘導出 1條不定根，但經過六周培養后（誘導培養不定根的情況見圖1A)，平均每條根上產生的不 定根數為11. 33條（見表1)。
[0054] 實施例2
[0055] 本實施例用于說明人參組培苗根誘導產生的不定根的增殖培養。
[0056] 將實施例1中誘導培養六周后得到的人參組培苗根誘導產生的不定根取出，切成 Icm尺寸的小塊，將小塊接入含有100mll/2MS(-N)+2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液體培養基 的培養瓶中，置于搖床中于24±2°C黑暗條件慢速震蕩（60rpm)，進行不定根的增殖培養。 每三周繼代一次，并統計不定根的鮮重，試驗重復3次，取平均值。將培養得到的不定根取 出，滅菌濾紙吸取表面的培養液，置于天平進行稱重，即為鮮重。計算不定根的增殖率，結果 顯示（見圖2A)，在含有2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培養液中培養三周后，增殖率 為17. 73% ;培養六周后，增殖率顯著提高，為27. 45% ;當經過九周培養后，增殖率略有下 降，為 25. 88%。
[0057] 實施例3
[0058] 本實施例用于說明人參組培苗根誘導產生的不定根的增殖培養。
[0059] 根據與實施例2相同的方法對人參組培苗根誘導產生的不定根進行增殖培養。區 別僅在于，所使用的液體增殖培養基為含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液體增 殖培養基。計算不定根的增殖率，結果顯示（圖2A):增殖培養三周后，增殖率為24. 4%;增 殖培養六周后，增殖率為32. 27%，當經過九周培養后，增殖率為22. 25%。
[0060] 實施例4
[0061] 本實施例用于說明利用人參組培苗莖誘導不定根的方法。
[0062] 取人參組培苗的莖段，用滅菌刀切割成約5mmX5mmX3mm的小段，轉入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固體培養基上（固體誘導培養基中含2%蔗糖，7g/L瓊脂，pH值 為5. 8)，于24±2°C，黑暗條件下培養誘導不定根的產生。每個培養皿接種30個外植體，每 三周繼代一次，并統計不定根誘導率和每個外植體產生的不定根數，試驗重復3次，取平均 值。結果顯示，經過三周培養后，有27. 94%的外植體能誘導能產生不定根，且每條根上均只 誘導出1條不定根，但經過六周培養后，所有的外植體都產生了不定根（誘導培養不定根的 情況見圖1B)，平均每條根上產生的不定根數為10. 33條（見表1)。
[0063] 實施例5
[0064] 本實施例用于說明人參組培苗莖誘導產生的不定根的增殖培養方法。
[0065] 將實施例4中培養六周后得到的人參莖誘導產生的不定根取出，切成Icm大小， 接入含有100ml1/2MS(-N) +2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液體增殖培養基的培養瓶中，置于搖 床，24±2°C，黑暗條件慢速震蕩（60rpm)，進行不定根的增殖培養。每三周繼代一次，并統 計不定根的鮮重，試驗重復3次，取平均值。將培養得到的不定根取出，滅菌濾紙吸取表面 的培養液，置于天平進行稱重，即為鮮重。計算不定根的增殖率，結果顯示（見圖2B)，在含 有2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培養液中培養三周后，增殖率為270% ;培養六周 后，增殖率為188% ;當經過九周培養后，增殖率為142%。
[0066] 實施例6
[0067] 本實施例用于說明人參組培苗莖誘導產生的不定根的增殖培養。
[0068] 根據與實施例5相同的方法對人參組培苗莖誘導產生的不定根進行增殖培養。區 別僅在于，所使用的培養基為含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液體增殖培養基。 計算不定根的增殖率，結果顯示（見圖2B)，增殖培養三周后，增殖率為295%;培養六周后， 鮮重增殖率為169%，當經過九周培養后，增殖率為126%。
[0069] 實施例7
[0070] 本實施例用于說明人參組培苗葉誘導不定根的產生。
[0071] 取人參組培苗的葉片，用滅菌刀切割成約5mmX5mmX3mm的小段，轉入含 l/2MS(-N)+2mg/LIBA的固體培養基上（固體誘導培養基中含2%蔗糖，7g/L瓊脂，pH值 為5. 8)，于24±2°C，黑暗條件下培養誘導不定根的產生。每個培養皿接種30個外植體，每 三周繼代一次，并統計不定根誘導率和每個外植體產生的不定根數，試驗重復3次，取平均 值。結果顯示，經過三周培養后，所有的葉片都沒有不定根的產生，但經過六周培養后（誘 導培養不定根的情況見圖1C)，有87. 78%的外植體誘導產生了不定根，平均每條根上產生 的不定根數為6. 33條（見表1)。
[0072] 實施例8
[0073] 本實施例用于說明人參組培苗葉片誘導產生的不定根的增殖培養。
[0074] 將實施例7中培養六周后得到的人參葉片誘導產生的不定根取出，接入含 有100mll/2MS(-N)+2mg/LIBA+20g/L蔗糖的液體增殖培養基的培養瓶中，置于搖床， 24±2°C，黑暗條件慢速震蕩（60rpm)，進行不定根的增殖培養。每三周繼代一次，并統計不 定根的鮮重，試驗重復3次，取平均值。將培養得到的不定根取出，滅菌濾紙吸取表面的培 養液，置于天平進行稱重，即為鮮重。計算不定根的增殖率，結果顯示（見圖2C)，在含有 2mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)液體增殖培養基中增殖培養三周后，增殖率為713%; 培養六周后，增殖率為331% ;當經過九周培養后，增殖率為77. 42%。
[0075] 實施例9
[0076] 本實施例用于說明人參組培苗葉誘導產生的不定根的增殖培養。
[0077] 根據與實施例8相同的方法對人參組培苗葉誘導產生的不定根進行增殖培養。區 別僅在于，所使用的培養基為含有5mg/LIBA和20g/L蔗糖的1/2MS(-N)培養液，計算不定 根的增殖率，結果顯示（見圖2C)，增殖培養三周后，增殖率為638%;培養六周后，增殖率為 216%，當經過九周培養后，增殖率下降為83. 44%。
[0078] 表 1
[0079]

【權利要求】
1. 一種人參不定根誘導增殖方法，其特征在于，包括以下步驟： 將人參組培苗切割成組織小塊后接種于固體誘導培養基中誘導形成不定根，將所述不 定根切割成不定根小塊后接種于液體增殖培養基中進行不定根的增殖培養；其中，所述固 體誘導培養基和液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為l-10mg/ L的吲哚丁酸。
2. 根據權利要求1所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，所述固體誘導培養基和 液體增殖培養基為以1/2MS(-N)培養基為基本培養基含有濃度為2-5mg/L的吲哚丁酸。
3. 根據權利要求1或2所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 將人參組培苗切割成組織小塊，利用固體誘導培養基在培養溫度為23-25°C的黑暗 條件下誘導培養3-6周獲得不定根； 2) 將步驟1)獲得的不定根切割成不定根小塊，利用液體增殖培養基在培養溫度為 23-25°C的黑暗條件下以50-80rpm的速度震蕩培養3-9周。
4. 根據權利要求3所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，所述組織小塊為人參組 培苗根小塊、人參組培苗莖小塊或人參組培苗葉小塊。
5. 根據權利要求4所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，所述固體誘導培養基和 液體增殖培養基中還含有濃度為1. 8-2. 2質量％的蔗糖。
6. 根據權利要求5所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，所述人參組培苗為經種 子萌發或者外植體離體培養獲得的組培苗，組培苗的日齡為28-32天。
7. 根據權利要求1-2,4-6中任意一項所述的不定根誘導增殖方法，其特征在于，所述 人參組培苗的品種為石柱參或大馬牙參。
【文檔編號】A01H4/00GK104472359SQ201410698528
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月26日 優先權日:2014年11月26日
【發明者】盧善發, 王梅珍 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所