用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，在本發(fā)明中，膜蛋白與寄主互作最有效的方法是利用泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，而構(gòu)建cDNA文庫較為簡(jiǎn)便快捷的方法是Gateway高效文庫構(gòu)建系統(tǒng)。本發(fā)明通過將膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)與Gateway系統(tǒng)相融合，以載體pPR3-N為模板，用酶切連接的方法引入attR1-Cmr-ccdB-attR2基因，改造成可用Gateway技術(shù)高效構(gòu)建cDNA文庫的pPR3-gateway載體質(zhì)粒，該pPR3-gateway載體用于全長(zhǎng)cDNA的定向克隆、文庫構(gòu)建和測(cè)序，或者用于酵母雙雜交的文庫篩選。
【專利說明】用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)組學(xué)研究已廣泛應(yīng)用于多個(gè)互作系統(tǒng)的研究，包括病毒與寄主細(xì)胞的互作研究，而且研究方法也越來越多樣化，常用方法主要有酵母雙雜交、全長(zhǎng)侵染性克隆、串聯(lián)親和純化和雙分子熒光互補(bǔ)等。對(duì)于病毒編碼的膜蛋白或者膜相關(guān)特性的蛋白，由于具有膜結(jié)合特性，在生物體內(nèi)的互作多發(fā)生在膜上，傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)生在核內(nèi)，雖然試劑盒的載體上加了核定位信號(hào)肽，可以把基因都錨定到酵母核內(nèi)，但與細(xì)胞內(nèi)自然狀態(tài)下的互作情況還是有差異的，而且翻譯后修飾過程等都無法完成。膜相關(guān)蛋白約占細(xì)胞總蛋白質(zhì)中的1/3，它們大都參與了細(xì)胞的諸多生理、病理過程和抗病反應(yīng)機(jī)理。研究膜蛋白的相互作用對(duì)于揭示細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律及尋找作用靶標(biāo)都有重要的意義。針對(duì)在活細(xì)胞中研究膜蛋白相互作用的需要，近年來國際上先后發(fā)展了一系列用于膜蛋白相互作用研究的酵母雙雜交新系統(tǒng)，并在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域取得了許多重要發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)有專門適用于膜蛋白的泛素酵母雙雜交系統(tǒng)，直接在膜系統(tǒng)上發(fā)生互作，解決了這些難題。但是，膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)必須購買對(duì)應(yīng)的文庫或定制，成本較高，且程序復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體，旨在用Gateway技術(shù)高效構(gòu)建cDNA文庫質(zhì)粒,可轉(zhuǎn)化酵母,用于膜蛋白酵母雙雜交。
[0004]本發(fā)明的再一目的在于提供上述用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方
法。`
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述用于cDNA文庫構(gòu)建篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體，由pPR3_N載體和attRl-Cnf-ccdB-attR2基因組成，記為pPR3_gateway載體,其中，所述attRl序列如SEQID N0.1所示,所述Cnf序列如SEQ ID N0.2所示,所述ccdB序列如SEQ ID N0.3所示,所述attR2序列如SEQ ID N0.4所示。
[0007]優(yōu)選地，所述attRl-Cnf-ccdB-attR2基因的5’端和3’端分別經(jīng)SfiI限制性內(nèi)切酶酶切與PPR3-N載體連接。
[0008]優(yōu)選地，所述attRl-Cnf-ccdB-attR2 基因?yàn)檩d體 pDEST22 上 attRl 與 attR2 之間的序列。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0010](I)針對(duì)載體pDEST22上attRl與attR2之間的序列設(shè)計(jì)引物attRlsfiA以及attR2sfiB,選取pPR3-N載體通用測(cè)序引物pPR3_NF以及pPR3_NR ;其中，引物attRlsfiA以及attR2sfiB序列如下所示:
[0011]attRlsfiA:
[0012]5，-agtggccattacggccACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACG-3，，
[0013]attR2sfiB:
[0014]5’ -agaggccgaggcggccACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAACGA-3’ ；
[0015]pPR3-NF和pPR3_NR引物序列如下所示:
[0016]pPR3-NF: 5，GTCGAAAATTCAAGACAAGG3，，
[0017]pPR3-NR: 5，AAGCGTGACATAACTAATTAC3，；
[0018](2)擴(kuò)增序列:以載體pDEST22的DNA序列為模板，用引物attRlsfiA以及attR2sfiB 進(jìn)行擴(kuò)增得到 attRl-Cnf-ccdB-attR2 基因；
[0019](3)構(gòu)建質(zhì)粒:用SfiI限制性內(nèi)切酶分別酶切載體PPR3-N以及attRl-Cmr-ccdB-attR2基因序列，電泳電泳跑膠回收，進(jìn)行連接得到pPR3_gateway載體；將所述pPR3_gateway載體轉(zhuǎn)化ccdB survival strain感受態(tài)細(xì)胞，在含Amp和Cm的LB平板上獲得重組菌落，用引物PPR3-NF和pPR3-N擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)行鑒定；將所述pPR3-gateWay載體轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生情況鑒定致死基因ccdB表達(dá)情況。
[0020]本發(fā)明進(jìn) 一步提供了上述能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用，所述pPR3-gateway載體用于通過Gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶目的基因的目的載體。
[0021]優(yōu)選地,所述Gateway技術(shù)包括以下步驟:
[0022]Ajf目的基因進(jìn)行BP反應(yīng)，構(gòu)建到pD0N0R221載體上；
[0023]B、將所述pD0N0R221載體與pPR3-gateway載體進(jìn)行LR反應(yīng)，將目的基因融合到pPR3-gateway載體上，構(gòu)建得到pPR3_gateway攜帶目的基因的目的載體。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步提供了上述能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用，上述pPR3-gateway載體用于全長(zhǎng)cDNA的定向克隆、文庫構(gòu)建和測(cè)序,或者用于酵母雙雜交的文庫篩選。
[0025]本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，在本發(fā)明中，膜蛋白與寄主互作最有效的方法是利用泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，而構(gòu)建cDNA文庫較為簡(jiǎn)便快捷的方法是Gateway高效文庫構(gòu)建系統(tǒng)。本發(fā)明通過將膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)與Gateway系統(tǒng)相融合，以載體pPR3_N為模板，用酶切連接的方法引入attRl-Cmr-ccdB-attR2基因，改造成可用Gateway技術(shù)高效構(gòu)建cDNA文庫的pPR3_gateway載體質(zhì)粒，該pPR3_gateway載體用于全長(zhǎng)cDNA的定向克隆、文庫構(gòu)建和測(cè)序，或者用于酵母雙雜交的文庫篩選。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中pDEST22載體的質(zhì)粒圖譜；
[0027]圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中pPR3_Gateway (B卩pPR3_N-RlR2)載體的質(zhì)粒圖譜；
[0028]圖3是本發(fā)明實(shí)施例1中pPR3_Gateway載體的構(gòu)建示意圖；
[0029]圖4是本發(fā)明實(shí)施例1中PPR3-N酶切產(chǎn)物及插入片段PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0030]圖5是本發(fā)明實(shí)施例3中平板鑒定庫容量圖；
[0031]圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中文庫插入片段鑒定結(jié)果示意圖。【具體實(shí)施方式】
[0032]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)
本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并
不用于限定本發(fā)明。
[0033]實(shí)施例1高效酵母載體構(gòu)建
[0034]1、引物設(shè)計(jì)
[0035]pDEST22載體的質(zhì)粒圖譜如圖1所示，根據(jù)pDEST22載體的質(zhì)粒圖譜設(shè)計(jì)引物
attRlsfiA以及attR2sfiB,引物序列如下所示:
[0036]attRlsfiA:
[0037]5，-agtggccattacggccACAAGTTTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACG-3，，
[0038]attR2sfiB:
[0039]5， -agaggccgaggcggccACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAACGA-3，；
[0040]attRlsfiA 以及 attR2sfiB 引物 5’ 端帶 SfiI 酶切位點(diǎn)，
[0041]根據(jù)pPR3-N上兩個(gè)中間序列不同的Sfil，分別命名為SfiA和SfiB。
[0042]用pPR3-N載體通用測(cè)序引物pPR3_NF和pPR3_NR測(cè)序鑒定插入片段序列的正確
性，其中，PPR3-NF和pPR3-NR引物序列如下所示:
[0043]pPR3-NF: 5，-GTCGAAAATTCAAGACAAGG-3，，
[0044]pPR3-NR: 5，-AAGCGTGACATAACTAATTAC-3，。
[0045]2、目的基因片段克隆
[0046]通過attRlsf iA以及attR2sf iB弓丨物從pDEST22質(zhì)粒載體上擴(kuò)增出attRl與attR2
之間的序列(attRl-Cmr-ccdB-attR2)
[0047]PCR反應(yīng)體系:
[0048]
【權(quán)利要求】
1.一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體，其特征在于，由PPR3-N載體和attRl-Cmr-ccdB-attR2基因組成，記為pPR3_gateway載體，其中，所述attRl序列如SEQID N0.1所示,所述Cmr序列如SEQ ID N0.2所示,所述ccdB序列如SEQIDN0.3所示,所述attR2序列如SEQ ID N0.4所示。
2.如權(quán)利要求1所述的能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述attRl-Cmr-ccdB-attR2基因的5’端和3’端分別經(jīng)SfiI限制性內(nèi)切酶酶切點(diǎn)與pPR3_N載體連接。
3.如權(quán)利要求2所述的能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體，其特征在于，所述attRl-Cmr-ccdB-attR2 基因?yàn)檩d體 pDEST22 上 attRl 與 attR2 之間的序列。
4.一種能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟: (1)針對(duì)載體PDEST22上attRl與attR2之間的序列設(shè)計(jì)引物attRlsfiA以及attR2sfiB,選取pPR3-N載體通用測(cè)序引物pPR3_NF以及pPR3_NR ;其中，引物attRlsfiA以及attR2sfiB序列如下所示:
attRlsfiA:
5’ -agtggccattacggccACAAGITTGTACAAAAAAGCTGAACGAGAAACG-3’，
attR2sfiB:
5’ -agaggccgaggcggccACCACTTTGTACAAGAAAGCTGAACGA-3’ ； PPR3-NF和pPR3 -NR引物序列如下所示:
PPR3-NF:5’ GTCGAAAATTCAAGACAAGG3’，
PPR3-NR:5’ AAGCGTGACATAACTAATTAC3’ ； (2)擴(kuò)增序列:以載體pDEST22的DNA序列為模板，用引物attRlsfiA以及attR2sfiB進(jìn)打擴(kuò)增得到attRl-Cnf-ccdB-attRZ基因； (3)構(gòu)建質(zhì)粒:用SfiI限制性內(nèi)切酶分別酶切載體pPR3-N以及attRl-Cnf-ccdB-attR2基因序列，電泳電泳跑膠回收，進(jìn)行連接得到pPR3_gateway載體；將所述pPR3_gateway載體轉(zhuǎn)化ccdB survival strain感受態(tài)細(xì)胞,在含Amp和Cm的LB平板上獲得重組菌落,用弓丨物PPR3-NF和pPR3-N擴(kuò)增測(cè)序進(jìn)行鑒定；將所述pPR3-gateway載體轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生情況鑒定致死基因ccdB表達(dá)情況。
5.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用,其特征在于，所述pPR3_gateway載體用于通過Gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶目的基因的目的載體。
6.如權(quán)利要求5所述的能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用，其特征在于，所述Gateway技術(shù)包括以下步驟: A、將目的基因進(jìn)行BP反應(yīng)，構(gòu)建到pD0N0R221載體上； B、將所述pD0N0R221載體與pPR3-gateWay載體進(jìn)行LR反應(yīng)，將目的基因融合到pPR3-gateway載體上，構(gòu)建得到pPR3_gateway攜帶目的基因的目的載體。
7.權(quán)利要求1~3任一項(xiàng)所述的能用于構(gòu)建cDNA文庫篩選的質(zhì)粒載體的應(yīng)用,其特征在于，權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的pPR3_gateway載體用于全長(zhǎng)cDNA的定向克隆、文庫構(gòu)建和測(cè)序，或者用于酵母雙雜交的文庫篩選。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103849638SQ201410058679
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】崔曉艷, 陳新, 智海劍, 顧和平, 袁星星, 張紅梅, 陳華濤 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院