PKCα-siRNA質粒載體的構建、篩選方法及應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種PKCα-siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，包括以下步驟：1）設計及合成靶向PKCα的siRNA，2）構建PKC-αsiRNA的重組質粒載體，以及PKCα-siRNA質粒載體在卵巢癌耐藥方面的應用。本發明的有益效果為：成功建立了幾種靶向PKC-α的siRNA重組質粒載體（pEGFP-iLenti-PKC-α），并將pEGFP-iLenti-PKC-α導入人卵巢癌耐藥細胞株用于卵巢癌耐藥研究，最終篩選出逆轉耐藥效果最好的pEGFP-iLenti-PKC-α492。這一發明為腫瘤多藥耐藥的逆轉研究提供了一種新方法。
【專利說明】PKC a -s i RNA質粒載體的構建、篩選方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學領域，尤其涉及一種PKCd-SiRNA質粒載體的的構建、篩選方法及其應用。
【背景技術】
[0002]化療是繼外科手術外治療腫瘤的主要有效手段。不幸地是，多藥耐藥(multidrugresistance, MDR)的產生嚴重影響了化療效果。因此,如何逆轉腫瘤的多藥耐藥已成為目前腫瘤治療研究的重點。
[0003]蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)是一種磷脂依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在細胞內信號傳導中起重要作用。PKC是一類同工酶家族，它們經生長因子、激素及神經轉化因子作用后發生磷酸化或活化。其中，蛋白激酶C同工酶-a (PKC-a)廣泛存在于各種組織中，具有維持細胞增殖與凋亡之間平衡的作用。在許多轉化細胞及腫瘤細胞中常常發現PKC-a的異常表達。PKC-a的表達水平與腫瘤細胞的侵襲能力密切相關。近年來研究表明，PKC- a在腫瘤多藥耐藥機理上有著重要作用，PKC- a是MDR發生發展過程中的關鍵調節蛋白，可以作為癌癥治療的一個靶點。PKC-a的過度表達與MDR表型的高表達有著密切關系。PKC-a的活化可導致耐藥蛋白P_gpl70的磷酸化及細胞內藥物濃度的下降，而抑制PKC的表達能部分逆轉MDR表型。進一步研究發現，將PKC- a基因轉染到MCF-7乳腺癌細胞中，發現MCF-7對多柔比星和長春新堿的耐藥性得到提高。在臨床上，腫瘤患者中PKC-a表達陽性者的化 療反應率明顯低于陰性表達者，復發患者中PKC-a陽性表達率明顯聞于未復發的患者。
[0004]1998年，Fire等首次將正義鏈和反義鏈的RNA混合物——雙鏈RNA注入線蟲，結果誘發了比單獨注射正義鏈或反義鏈都要強的多的基因沉默，他們將這種現象命名為RNA 干擾(small RNAs mediating RNA interference, RNAi),從而獲得 2006 年諾貝爾獎。RNAi作為真核生物中普遍存在的一種自然現象，是利用雙鏈RNA誘發宿主細胞同源mRNA降解，從而抑制特異目的基因表達的方法。隨著RNAi的深入研究，RNAi已成為腫瘤研究中的一個熱點，RNAi技術在癌基因及抑癌基因的敲除、腫瘤疾病信號傳導途徑以及腫瘤免疫逃逸等方面的研究都被廣泛開展。而近來，RNAi技術在逆轉腫瘤多藥耐藥方面的研究正成為當前腫瘤學研究熱點之一。針對不同的耐藥機制，設計不同的小分子干擾RNA(smallinterference RNA, SiRNA)來逆轉腫瘤耐藥，已經成為研究腫瘤耐藥和腫瘤基因治療的重要組成部分。目前，雖然有關沉默PKC-α基因的siRNA質粒載體尚有一些報道，但仍存在許多問題限制其應用和發展。例如:導入腫瘤耐藥細胞的成功率不高；沉默PKC-a基因的siRNA質粒載體的特異性和靈敏度不夠等，這對于基因調控逆轉耐藥的藥物研發具有非常重要的意義。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種PKCa-siRNA質粒載體的構建、篩選方法及其應用，以克服現有技術存在的上述不足。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現:
一種PKC a -SiRNA質粒載體的構建及其篩選方法，包括以下步驟:
O設計及合成祀向PKCa的siRNA,進一步包括以下步驟:
1.1)根據基因庫PKCa基因序列篩選出候選序列；
1.2)根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列；
1.3)確定靶向PKC- a的siRNA的目標序列；
2)構建PKC-a siRNA的重組質粒載體，進一步包括以下步驟:
2.1)退火連接單鏈目的基因片段；
2.2) Eco31I 酶切質粒 pEGFP-1Lenti ；
2.3) I %瓊脂糖凝膠回收酶切線性空載體；
2.4)連接線性化質粒載體；
2.5)重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞及擴增；
2.6)純化重組質粒。
[0007]進一步的，步驟1.2)根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列，進一步包括以下步驟:
1.2.1)從轉錄本的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點；
1.2.2)利用BLAST軟件將候選序列和相應的基因組數據庫進行比較，排除和其他編碼序列或基因表達序列標簽同源的候選序列；
1.2.3)選出合適的目標序列。
[0008]進一步的，步驟1.3)中確定的目標序列為:
5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’.本發明的PKCa-siRNA 492質粒載體可以逆轉腫瘤耐藥表型。
[0009]本發明的PKC a -siRNA 492質粒載體可以提高腫瘤耐藥細胞的藥物敏感性。
[0010]本發明的有益效果為:成功建立了幾種靶向PKC-a的siRNA重組質粒載體(pEGFP-1Lent1-PKC-a )，并將pEGFP-1Lent1-PKC-a導入人卵巢癌耐藥細胞株用于卵巢癌耐藥研究，最終篩選出逆轉耐藥效果最好的pEGFP-1Lent1-PKC- a 492。這一發明為腫瘤多藥耐藥的逆轉研究提供了一種新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]下面根據附圖對本發明作進一步詳細說明。
[0012]圖1是本發明實施例所述的重組質粒構建的流程示意圖；
圖2是本發明實施例所述用三種不同的轉染試劑分別轉染0V1228/DDP及0V1228/Taxol細胞后觀察各組細胞內熒光強度圖；
圖3是本發明實施例所述的轉染pEGFP-1Lent1-PKC-α干擾質粒后0V1228/DDP細胞中PKC- α與MDRl基因表達水平；
圖4是本發明實施例所述的轉染pEGFP-1Lent1-PKC-α干擾質粒后0V1228/Taxol細胞中PKC- α與MDRl基因表達水平；
圖5是本發明實施例所述的轉染pEGFP-1Lent1-PKC-α干擾質粒后0V1228/DDP細胞中PKC- α與MDRl蛋白表達水平；
圖6是本發明實施例所述的轉染pEGFP-1Lent1-PKC-α干擾質粒后0V1228/Taxol細胞中PKC-α與MDRl蛋白表達水平。
【具體實施方式】
[0013]一、靶向PKCa的siRNA的設計與合成:
1.根據基因庫PKCα基因序列篩選出候選序列；
2.根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列:
①從轉錄本(mRNA)的AUG起始密碼開始，尋找“AA” 二連序列，并記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究結果顯示GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。
[0014]②設計siRNA時不要針對5’和3’端的非編碼區(untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域，而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結合mRNA從而影響siRNA的效果。
[0015]③利用BLAST軟件將候選序列和相應的基因組數據庫進行比較，排除那些和其他編碼序列或基因表達序列標簽(EST)同源的候選序列。
[0016]④選出合適的目標序列。通常一個基因需要設計多個靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
[0017]3.最終確定四段靶向PKC-α的siRNA的目標序列 5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’.二、構建PKC a -siRNA的重組質粒載體 (I)材料 1.質粒
pEGFP-1Lenti 載體質粒購自加拿大 Applied Biological Materials 公司。
[0018]2.主要試劑
DNA回收試劑盒以及質粒小量提取試劑盒購自上海捷瑞公司。AxyPrep質粒大量試劑盒購自Axygen公司。T4DNA連接酶，限制性內切酶以及核酸分子量標準D12000購自大連Takara生物有限公司。
[0019](2)步驟
1.單鏈目的基 因片段的退火連接:各用30μ1退火緩沖液溶解上述合成IOD單鏈目的基因片段。各取2μ1+16i1退火緩沖液混勻。94°C水浴退火自然冷卻至室溫。各取?μ?退火產物+99μ1 Η20做100倍稀釋。[0020]2.質粒 pEGFP-1Lenti 的 Eco31I 酶切:質粒 10μδ, Eco31I 5μ1 酶切，IOX 緩沖液15μ1，三蒸水補足10(^1，31:水浴611。
[0021]3.1 %瓊脂糖凝膠回收酶切線性空載體 I)配制I %的瓊脂糖凝膠，灌膠。
[0022]2)將DNA樣品與上樣緩沖液混合，加樣酶切產物，60V電泳3h。
[0023]3)電泳后在長波紫外線下觀察結果。
[0024]4)取一干凈的離心管，稱重。
[0025]5)在紫外燈下，切下含有目的基因的DNA片段的凝膠(越少越好)，提高DNA回收率，速度要快，避免有基因突變，轉移至準備好的離心管中。
[0026]6)稱重，向膠塊中加入膠塊融化液B (每IOOmg瓊脂糖膠加入300μ1)，均勻混合后，50°C _60°C加熱IOmin融化膠塊，其間每2min顛倒混勻一次。
[0027]7)將上述膠塊融化液移入GenClean柱,3000rpm室溫離心30s,重復一次。
[0028]8)棄去離心液，加入500μ1洗液，8000rpm室溫離心30s，重復一次。
[0029]9)棄去離心液,1000rpm室溫離心I min,完全去除洗液,將GenClean柱放入干凈的1.5ml離心管中。
[0030]10)加入30-50μ1洗脫緩沖液在結合柱膜中央，37°C放置2min，1000rpm室溫離心lmin，離心管中液體即為回收的DNA片段溶液，取2-5μ1電泳檢測濃度，即可用于實驗或-20°C保存。`
[0031]4.連接:取?μ?線性化質粒載體，加入10XT4DNA連接酶緩沖液Ιμ?，T4DNA連接酶?μ?，最后用三蒸水補足?ομ?。22°C水浴連接過夜，_2°C保存。
[0032]5.重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞及擴增
I)取_80°C保存的大腸桿菌DH5 α感受態細胞懸液ΙΟΟμΙ，室溫下解凍后，置于冰上。
[0033]2)加入連接產物10μ1，搖勻后置于冰上放置30min。
[0034]3)放入42°C水中熱休克90s，隨即冰浴3min。
[0035]4)向各管中加入700μ1不含丁胺卡那霉素的LB液體培養基，混勻。
[0036]5)混勻后，3000rpm 離心 5min。
[0037]6)棄去上清，留約ΙΟΟμΙ，用移液器吹打均勻后吸出置于已鋪好的丁胺卡那霉素(終濃度為3(^g/ml)平板上。
[0038]7)消毒取菌環把菌液均勻的鋪平，平放置于37°C孵箱中過夜。
[0039]8)隨機挑取5個左右單個菌落溶于LB液體培養基后，各取2μ1進行PCR鑒定，含陽性克隆的菌落搖菌后，提取質粒。
[0040]6.重組質粒純化:
重組質粒的提取純化參照質粒小量提取試劑盒操作規程操作，所得質粒可用于轉染細胞和其他分子生物學實驗，具體步驟如下:
I)收菌:收集過夜培養的菌液5ml，4°C，1000Orpm離心I min，棄盡上清。
[0041]2)重組懸液:加入ΙΟΟμΙ重懸溶液，振蕩充分懸浮細菌。
[0042]3)堿裂解:再加入200μ1裂解液，上下輕輕混勻，室溫放置2min，直至細菌裂解呈透明蛋清狀態。
[0043]4)中和:加入350μ1中和緩沖液，上下劇烈顛倒6_8次，充分混勻后室溫放置5min, 4°C，12000rpm 離心 5min。
[0044]5)柱預處理:將上一步驟中的上清轉移到GenClean柱中，室溫8000rpm,離心15s，倒掉收集管中廢液。
[0045]6)漂洗:將柱子重新放回收集管中，加入500μ1洗液，lOOOOrpm，室溫離心30s，重
復一至兩次。
[0046]7)再次漂洗:倒掉收集管中廢液,并于lOOOOrpm，室溫離心I min，徹底去除洗液。
[0047]8)洗脫:將柱放入干凈的1.5ml離心管中，加入50μ1洗脫緩沖液在結合柱膜中央,37°C放置 2min, lOOOOrpm 室溫離心 I min。
[0048]9)離心管中的液體即為包含目的質粒的溶液，取2_5μ1進行I %瓊脂糖電泳檢測提取的質粒DNA的大小及濃度。
[0049]7.最終構建出四種帶有綠色熒光標記的載體，即pEGFP-1Lent1-PKC-α 492,746，1114及1676。重組質粒載體構建如圖1所示。
[0050]三、基因遞送載體的選擇
1.細胞株:人卵巢癌細胞株0V1228，人卵巢癌耐順鉬細胞株0V1228/DDP，人卵巢癌耐紫杉醇細胞株0V1228/Taxol。
[0051]2.轉染試劑:Lipofectamine 2000 (Invitrogen ), FuGENE 6 (Roche 公司)，EnoGeneFec (EnoGene 公司)。
[0052]3.實驗分組:
Lipofectamine 2000 轉染 0V1228/DDP 組；
FuGENE 6 轉染 0V1228/DDP 組；
EnoGeneFec 2000 轉染 0V1228/DDP 組；
Lipofectamine 2000 轉染 0V1228/Taxol 組；
FuGENE 6 轉染 0V1228/Taxol 組；
EnoGeneFec 2000 轉染 0V1228/Taxol 組。
[0053]4.轉染步驟:
1)第一日細胞消化接種于24孔板，第二日轉染前細胞匯合度在95%左右；
2)棄去24孔板中舊培養基，加入900ul新鮮完全培養基；
3)IOOul無血清無抗生素培養基分別加入適量質粒和轉染試劑，輕輕混勻后，靜置15min ；
4)將混勻的混合物加入到細胞中，前后左右輕輕晃動以混勻后置于37°C二氧化碳培養箱培養；
5)第三日熒光顯微鏡觀察，檢測轉染效率，見圖2，A，B，C分別為Lipofectamine2000/FuGENE 6/EnoGeneFec 2000 轉染 0V1228/DDP 組；D，E, F 分別為 Lipofectamine 2000/FuGENE 6/EnoGeneFec 2000 轉染 0V1228/Taxol 組。
[0054]5.結果分析:三種轉染試劑對0V1228/DDP、0V1228/Taxol卵巢癌耐藥細胞均具有一定的轉染效率，尤以EnoGeneFec轉染試劑效果最佳,故選擇EnoGeneFec轉染試劑作為PKCa siRNA干擾質粒基因遞送載體。
[0055]四、RT-PCR法檢測PKC α干擾對卵巢癌耐藥的影響
1.實驗目的:檢測卵巢癌細胞株以及耐藥株中PKCa及耐藥相關基因MDRl的基因表達水平，從而評估pEGFP-1Lent1-PKC- α的應用前景。
[0056]2.實驗步驟
2.1 RNA的提取
1)細胞處理:將培養好的細胞按每IOcm2加Iml的Trizol試劑進行處理，室溫下形成TRizol與細胞的混合液；
2)將細胞裂解液轉移至離心管中，在室溫下放置5min，使得核酸蛋白復合物完全分
離；
3)12, OOOg, 4°C離心lOmin，然后小心吸取上清液，移入新的離心管中；
4)裂解液中加入氯仿(每使用ImlTRIzol加0.2ml氯仿)，蓋緊離心管管蓋，用手上下振蕩15s，溶液呈乳白狀，無分層現象；
5)室溫靜置3min ; 12，OOOg，4°C離心 15min ；
6)取出離心管，樣品分為三層:無色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機相。小心吸取無色上清水相移至另一離心管，水相的體積約為所用Trizol試劑的60% ；
7)向得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置IOmin；
8)12，OOOg, 4。。離心 IOmin ；
9)小心去除上清，緩慢沿管壁加入lml75%的乙醇(用DEPC處理過的水配制)，輕輕混勻。每使用Iml Trizol試劑至少加Iml 75%的乙醇；
10)12, 000g,4°C離心IOmin ;小心吸盡上清；
11)室溫干燥沉淀2~5min(不可晾得太干，否則RNA將會很難溶解)，加入30~50μ1的無RNase水溶解RNA沉淀，待完全溶解后于_70°C保存；
12)RNA濃度和純度的測定
取RNA樣品用IXTE Buffer稀釋樣品100倍或適當的倍數，測定樣品在260nm和280 nm的吸收值確定RNA的質量。按以下計算RNA的濃度=0D260X稀釋倍數X0.04μδ/μ?，0D260/280在1.8~2.1視為抽提的RNA的純度很高。
[0057]2.2 RT-PCR反應的實驗操作步驟:
I) RT反應(20μ1體系)；
a)使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s；
b)取滅過菌且無核酸酶的0.2ml PCR管，依次加入
【權利要求】
1.一種PKCa-SiRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: O設計及合成祀向PKCa的siRNA,進一步包括以下步驟: 1.1)根據基因庫PKCa基因序列篩選出候選序列； 1.2)根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列； 1.3)確定靶向PKC- a的siRNA的目標序列； 2)構建PKC-a siRNA的重組質粒載體，進一步包括以下步驟: 2.1)退火連接單鏈目的基因片段； 2.2) Eco31I 酶切質粒 pEGFP-1Lenti ； 2.3) I %瓊脂糖凝膠回收酶切線性空載體； 2.4)連接線性化質粒載體； 2.5)重組質粒轉化大腸桿菌感受態細胞及擴增； 2.6)純化重組質粒。
2.根據權利要求1所述的PKCa -siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于:步驟1.2)根據RNAi目標序列的選取原則優化siRNA序列，進一步包括以下步驟: 1.2.1)從轉錄本的AUG起始密碼開始，尋找AA 二連序列，記下其3’端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點；` 1.2.2)利用BLAST軟件將候選序列和相應的基因組數據庫進行比較，排除和其他編碼序列或基因表達序列標簽同源的候選序列； 1.2.3)選出合適的目標序列。
3.根據權利要求2所述的PKCa -siRNA質粒載體的構建及其篩選方法，其特征在于:步驟1.3)中確定的目標序列為:
5’-492 AAAGGCTGAGGTTGCTGAT-3’，
5’-746 GAACAACAAGGAATGACTT-3’，
5’-1114 AAGGATGTGGTGATTCAGGAT-3’，
5’-1676 AATCCTTGTCCAAGGAGGCTG-3’ 。
4.權利要求1-3任一項所述的構建及其篩選方法獲得的PKCa-siRNA 492質粒載體逆轉腫瘤耐藥表型的用途。
5.權利要求1-3任一項所述的構建及其篩選方法方法獲得的PKCa-siRNA 492質粒載體提高腫瘤耐藥細胞株的藥物敏感性的用途。
【文檔編號】C12N15/66GK103773789SQ201410011031
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月9日 優先權日:2014年1月9日
【發明者】王金華, 趙麗君 申請人:江蘇省腫瘤防治研究所