迷迭香體胚發生再生體系建立方法
【專利摘要】本發明涉及以迷迭香成熟胚為材料建立再生體系的方法，包括三個培養階段：(1)成熟胚剝離后培養誘導愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(3)愈傷組織中體細胞胚的發生和胚狀體發育成植株。在繼代培養中采用分步降低2，4-二氯苯氧乙酸濃度的方法，使體細胞胚的發生率高達63％，可做為迷迭香遺傳轉化和快繁技術體系。
【專利說明】迷迭香體胚發生再生體系建立方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及迷迭香離體培養再生體系建立的方法。具體講以迷迭香種子成熟胚為 外植體，通過體細胞胚胎發生途徑建立再生體系的方法。屬于植物細胞工程領域。

【背景技術】
[0002] 迷迭香（Rosmarinus officinalis)又名艾菊，唇形科迷迭香屬常綠灌木。有清涼 氣味和甜樟腦的氣息，還有提高和加強記憶功能。主要含有酚、酸、酮、萜等化合物，是目前 公認高效抗氧化植物之一。可用作香料調味品、香水、洗發露原料，在保健飲料、口服液、化 妝品等行業有廣闊的應用前景。迷迭香原產歐洲及地中海沿岸地區，現以法國、西班牙、意 大利、南斯拉夫、突尼斯、摩洛哥等國栽培較多，我國于上世紀80年代引入。迷迭香因種子 發育不良，種子萌發率極低，通常采用扦插育苗。目前，國內外對迷迭香組織培養的研究較 少，通過體胚發生途徑再生體系建立未見報道。
[0003] 建立高頻、穩定的植株再生體系是利用現代生物技術進行品種改良的前提。植株 再生體系是外源基因的良好受體，同時也是體細胞融合的基礎。深入研究迷迭香體細胞胚 的發生還將為迷迭香優良無性系的繁殖和突變體篩選等研究奠定基礎，為細胞培養、原生 質體培養生物制藥提供技術支撐。迷迭香高頻、穩定再生體系的建立成為生物技術育種和 生物制藥的關鍵。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是建立迷迭香的高頻再生體系。
[0005] 本發明是以迷迭香種子成熟胚為外植體進行培養，以此建立迷迭香再生體系的方 法。
[0006] 本發明通過離體培養迷迭香種子成熟胚建立了的再生體系，所獲得的再生植株性 狀均一、穩定、效率高、易于遺傳工程操作。
[0007] 本發明的培養方法包括三個培養階段：（1)成熟胚切塊培養誘導愈傷組織（2)愈 傷組織繼代培養（3)愈傷組織誘導體細胞胚和胚狀體發育成植株，培養基中均含有蔗糖 30g/L，瓊脂7. Og/L，培養溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強2500?3000勒克斯，相對 濕度70 % -80 %，每培養20d更換一次新鮮培養基。
[0008] 本發明三個階段的基本培養基是改良B5培養基（表一），在第（1)階段培 養中所用激素為〇. 5-1. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA)，1000-1500mg/L水解乳蛋 白（LH)，4.0-8.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D)，在第⑵階段的培養基中所用激 素為0? 01-0. 05mg/L2,4-D，0? 02-1. 0mg/L6-BA，在第（3)階段的培養基中所用激素為 0? 1-1. 0mg/L6-BA、0. l-3mg/L 奈乙酸 NAA、100-1000mg/L LH、0. 1-10. lmg/L 赤霉酸（AC)。
[0009] 本發明優選的方法包括以下步驟（1)成熟胚切塊接種于添加4.0-5. 0mg/L2， 4-二氯苯氧乙酸、0.5-2.〇1^/16-芐基氨基腺嘌呤（6-84)和120〇11^/1水解乳蛋白（1^) 的培養基上；（2)誘導得到的愈傷組織第一次繼代培養于0. 4-0. 8mg/L2,4-二氯苯氧乙 酸、0. 5-1. 0mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養基上；第二次繼代培養于0. 5-1. 0mg/L2,4-二 氯苯氧乙酸、0. 1-0. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養基上；第三次繼代培養于0. 1-0. 4mg/ L2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-1. 5mg/L6-芐基氨基腺嘌呤的培養基上（3)繼代的愈傷組織在 400-600mg/L水解乳蛋白（LH)的培養基上，誘導出體細胞胚并發育成植株。
[0010] 本發明方法的優點在于
[0011] 1.此方法建立的再生體系，再生頻率達到63%，為高頻再生體系。
[0012] 2.此方法建立的再生體系，植株發育正常、穩定，是良好的育種平臺。

【具體實施方式】
[0013] 在下面的實施例中進一步說明了本發明，這并不限制本發明的范圍。
[0014] 實施例1
[0015] 本試驗采用由美國引進的迷迭香種子，將迷迭香種子用室溫下的自來水浸泡 10?15小時，然后用70 %酒精表面滅菌2分鐘，無菌水沖洗2遍，接著用0. 1 %氯化汞 (HgC12)表面滅菌10分鐘，無菌水沖洗5遍，用鑷子和解剖刀剖出胚接種在含6-BA1. 3mg/ L，2,4-D4. 5mg/L，1200mg/L水解乳蛋白的改良B5培養基（表1)上。培養基中均含有蔗糖 30g/L，瓊脂7. Og/L。用lmol/L NaOH或HCl調pH值為5. 8?6. 2,高壓蒸汽滅菌20min，培 養溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強2500?30001x，相對濕度70% -80%，每培養20 天更換新鮮培養基。5?7天開始出現愈傷，12天后愈傷快速生長。在附加6-BA1. 2mg/L，2， 4-D4. Omg/L和1500mg/L水解乳蛋白培養基愈傷誘導率可達95 %。誘導出的胚性愈傷組織， 第一次繼代培養基所用激素為2,4-D0. 5mg/L，6-BA0. 8mg/L，第二次繼代為2,4-D0. 8mg/L， 6-BAO. 3mg/L，第三次繼代為2,4-D0. 2mg/L，6-BA0. 6mg/L。經過三次繼代愈傷組織為兩類， 15%為生長較慢的淡黃色膠狀粘性愈傷組織，85%為生長較快的黃綠色無粘性、顆粒狀松 散的愈傷組織，鏡檢為球形、細胞質較濃的胚性愈傷組織。
[0016] 將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加600m/L水解乳蛋白的B5 培養基上，1月以后，觀測到體細胞胚的發生，發生率達63%。在附加600mg/L水解乳蛋白 的B5培養基上，愈傷組織經繼代后能不斷生長，且不斷產生胚狀體，繼代8次后仍保持胚狀 體發生能力，從最初分化的20塊愈傷組織共產生約8600個胚狀體，平均每塊430個。成熟 胚狀體在相同培養基中萌發為具根、莖、葉結構的完整小苗，成苗率63%。
[0017] 實施例2
[0018] 培養程序均按實施例1進行，所不同之處在于第一階段在附加6-BA4. 5mg/L，2， 4-D4. 3mg/L 和 700mg/L，第二階段第一次繼代 2,4-DO. 8mg/L，6-BA 為 0? 9mg/L，第二次繼代 為 2,4-DO. 9mg/L，6-BA 為 0? 4mg/L，第三次繼代為 2,4-DO. 2mg/L，6-BA 為 0? 8mg/L，第三階 段將繼代獲得的胚性愈傷組織，轉到不加生長調節劑，附加600mg/L水解乳蛋白的B5培養 基上進行。
[0019] 表一：B5基本培養基（Gamborg等，1968)和改良培養基成分
[0020]

【權利要求】
1. 一種迷迭香體胚發生再生體系建立方法，其特征在于以迷迭香成熟胚為外植體進行 培養。
2. 根據權利要求1的方法，其特征在于所述方法包括三個培養階段：（1)成熟胚切塊 培養誘導愈傷組織（2)愈傷組織繼代培養（3)愈傷組織誘導體細胞胚和胚狀體發育成植 株，培養基中均含有蔗糖30g/L，瓊脂7. Og/L，培養溫度18?22°C，光暗周期16h/8h，光強 2500?3000勒克斯，相對濕度70% -80%，每培養20d更換一次新鮮培養基。
3. 根據權利要求2的方法，其特征在于本發明三個階段的基本培養基是改良B5培養 基，在第（1)階段培養中所用激素為0. 5-1. 5mg/16-芐基氨基腺嘌呤（6-BA)，1000-1500mg/ 1水解乳蛋白0^)，4.〇-8.〇11^/12,4-二氯苯氧乙酸（2,4-〇)，在第（2)階段的培養基中所 用激素為〇? 01-0. 05mg/12,4-D，0. 02-1. Omg/16-BA，在第（3)階段的培養基中所用激素為 0? 1-1. 0mg/16-BA、0. l-3mg/l 奈乙酸 NAA、100-1000mg/l LH、0. 1-10. lmg/1 赤霉酸（AC)。
【文檔編號】A01H4/00GK104335896SQ201310313914
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2013年7月25日 優先權日:2013年7月25日
【發明者】楊學軍, 曾揚騰, 閆勇義 申請人:張家港芳香生物科技有限公司