粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法
【專利摘要】本發明涉及一種粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法，包括：采集粗枝云杉自由授粉無性系的球果，分離出未成熟合子胚進行體胚發生培養；所述體胚發生培養包括四個階段：胚性愈傷組織誘導階段、胚性愈傷組織增殖階段、體細胞胚成熟階段和體細胞胚萌發階段。本發明和現有國際上同屬或同類樹種的研究報道相比，胚性愈傷組織誘導率極大提高，體細胞胚的分化能力和萌發能力也極大提高，同時篩選得到胚性愈傷組織的長時間保持和增殖方法，極大降低了喪失胚性的風險。
【專利說明】粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及林業中細胞工程種苗繁殖領域，具體地，涉及一種粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法。
【背景技術】
[0002]粗枝云杉(Picea asperata Mast)為松科,云杉屬樹種，國內俗稱云杉,也叫大果云杉，是我國分布最廣的云杉屬樹種。常綠喬木，高達45m，胸徑達lm。樹皮淡灰褐色，裂成不規則鱗片或稍厚的快片脫落；小枝有疏生或密生的短柔毛，或無毛，一年生時淡褐黃色、褐黃色或淡紅褐色，葉枕有白粉，或白粉不明顯；冬芽圓錐形，有樹脂，基部膨大。針葉四棱狀條形，長I~2cm,寬I~1.5mm,微彎曲,先端微尖或急尖,橫切面四棱形。球果圓柱狀矩圓形或圓柱形，上端漸窄，成熟前綠色，熟時淡褐色或栗褐色，長5~16cm,徑2.5~3.5cm ；中部種鱗倒卵形；種子倒卵圓形，長約4mm，連翅長約1.5cm，種翅淡褐色，倒卵狀矩圓形；子葉6~7枚。花期4~5月，球果9~10月成熟。為我國特有種，主要分布于川西高原、甘肅東南部和陜西西南部的亞高山地區，平均海拔分布在2400~3600m的高山丘陵地帶。粗枝云杉系淺根性樹種，稍耐陰，能耐干燥及寒冷的環境。木材黃白色，較輕軟，紋理直，結構細，有彈性?？勺髟旒?、建筑、家具及木纖維工業原料等用材。材質優良，生長快，適應性強，是分布區的主要造林樹種。目前，人工造林用苗主要通過實生繁殖，但粗枝云杉結實晚，種子成熟率低，且伴有嚴重的“大小年”現象，致使粗枝云杉優良種苗供不應求。
[0003]植物體細胞胚胎發生技術，是指在離體條件下，已分化的體細胞在特定的環境條件下，發育成與合子胚類似的胚狀體的過程。植物體細胞胚胎發生是利用細胞工程手段實現植株再生的重要途徑之一，作為一種利用人工手段能夠最大限度地實現植物擴繁的措施，尤其對于難以扦插繁殖且繁殖周期較長的針葉樹樹種來說具有巨大的應用價值。同時，由于體細胞胚和合子胚具有相似的形態結構和發育過程，體細胞胚胎發生過程又具有相對的遺傳穩定性；開展植物體細胞胚胎發生的研究，已經為揭示植物胚胎的發生機理研究和開展遺傳轉化研究提供了一種模式研究系統。
[0004]針葉樹種是世界范圍內分布最為廣泛的一類樹種之一，由于通常具有優良的木材性質，已經作為北美及北歐等發達國家和地區最為重要的工業用材樹種。然而，由于其不同于顯花植物的特性，針葉樹種對離體條件更為敏感，是體細胞胚胎發生研究過程中難度最大的一類樹種。據不完全統計，截止目前，全世界有約150多個樹種實現了體細胞胚胎發生，其中針葉樹種僅有約50種實現了體細胞胚胎發生和植株再生。
[0005]目前，關于粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法，國內外尚無文獻報道。因此，開發出一種高效的粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法，對于實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗奠定理論基礎和提供切實可行的方法來說尤為必要；同時，也可以為粗枝云杉的生物技術育種、種質資源保存、快速繁殖、遺傳轉化建立良好的實驗體系。

【發明內容】
[0006]為了解決現有技術中的問題，本發明的目的是提供一種粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法。
[0007]本發明提供的一種粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法，包括:采集粗枝云杉自由授粉無性系的球果，分離出未成熟合子胚(即進行外植體的選擇)進行體胚發生培養；所述體胚發生培養包括四個階段:胚性愈傷組織誘導階段、胚性愈傷組織增殖階段、體細胞胚成熟階段和體細胞胚萌發階段。
[0008]其中，所述外植體的選擇中，采用粗枝云杉自由授粉的發育未成熟的合子胚為材料，球果采集日期為六月中旬到九月下旬，優選六月中下旬。分離出未成熟合子胚進行胚性愈傷組織的誘導，整個誘導過程在無菌條件下進行。
[0009]其中，所述胚性愈傷組織誘導階段:采用1/2LM基本培養基，附加植物生長素2，4_氯化苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid,以下簡稱2，4-D)的濃度為5~15 μ Μ,細胞分裂素6-芐基氨基嘌呤(benzylaminmopurine,以下簡稱6-BA)的濃度為2.5 ~10 μ M。所述 2，4-D 優選 10 μ Μ, 6-ΒΑ 優選 5 μ Μ。
[0010]進一步地，胚性愈傷組織誘導階段所用的1/2LM基本培養基中還包括:濃度為1%的蔗糖，500mg.Ι^的谷氨酰胺，lg-L-1的酶解酪蛋白和0.2%的植物凝膠，此條件下能夠獲得最高的胚性愈傷組織誘導頻率。
[0011]其中，所述胚性愈傷組織增殖階段:采用1/2LM液體培養基，附加激素為3.75~10 μ M 的 2，4-D 和 1.25 ~7.5 μ M 的 6-ΒΑ，優選 3.75 ~5 μ M 的 2，4-D 和 1.25 ~3.75 μ M的6-ΒΑ，更優選5 μ M的2，4-D和3.75 μ M的6-ΒΑ，此條件能夠獲得胚性愈傷組織增殖的最佳激素組合，維持胚性愈傷組織的高度胚性，同時獲得較高的胚性愈傷組織收獲量。
[0012]其中，所述胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM液體培養基，細胞體積與培養液體積比為1:3~1:15，優選1:5~1:15，更優選1:7 ;體積比為1:7時能夠獲得最大的胚性愈傷組織收獲量。
[0013]進一步地，胚性愈傷組織誘導階段所用的1/2LM基本培養基(即誘導培養基)中，2，4-D的濃度優選為6-ΒΑ的2倍；所述胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM液體培養基(即增殖培養基)中，2，4-D的濃度稍高于6-ΒΑ的濃度，且增殖培養基中激素濃度較誘導培養基明顯降低，此種激素組合有利于高度胚性的愈傷組織的保持。
[0014]其中，所述胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM液體培養基中，采用蔗糖作為碳源物質，濃度為0.5~3.0%，優選I~1.5%，最優選1%(最優選時和誘導培養基中蔗糖濃度
一致)。
[0015]其中，所述胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM液體培養基(即增殖培養基)中，十分關鍵的一點就是最大限度地降低懸浮培養時的細胞污染頻率。
[0016]本發明中，將胚性愈傷組織放置在裝有液體培養基的250ml的錐形瓶中培養，培養之前需要將錐形瓶高壓滅菌，接種后用通氣封口膜密封后，需要再密封兩層無菌報紙，這樣能夠極大地降低細胞污染的風險，使污染率控制在1%以內。
[0017]其中，所述胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM液體培養基中，還包括:500mg -L-1的谷氨酰胺，Ig.L—1的酶解酪蛋白。進行增殖培養時，搖床轉速為110轉/分鐘。[0018]本發明所述方法，胚性愈傷組織誘導階段采用的激素濃度能夠獲得極高的胚性愈傷組織誘導頻率。在胚性愈傷組織的增殖培養中，本發明采用的是液體懸浮培養方式，對培養條件進行優化，能夠極大地維持胚性愈傷組織的胚性能力，降低其喪失胚性能力的風險；同時，能夠獲得大量且高度均一化的胚性愈傷組織，有利于后期高度同步化體細胞胚的分化。
[0019]其中，所述體細胞胚成熟階段:采用1/2LM基本培養基，附加激素為31~123 μ M的脫落酸(abscisic acid,以下簡稱ABA),優選62~123 μ Μ,更優選92~123 μ Μ,進一步優選100~108 μ M ;在100 μ M的ABA處理下，能夠獲得大量且同步化程度較高的成熟體細胞胚，這樣成本劃算又有利于后期成熟體細胞胚的萌發。
[0020]其中，所述體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM基本培養基中，還包括:滲透調節物質聚乙二醇4000 (簡稱PEG4000)，濃度為O~7.5%，優選3.5~7.5%，再優選5~7.5%，更優選5%。
[0021]其中，所述體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM基本培養基中，采用I~9%的蔗糖，優選I~4.5%，更優選I~3%，進一步優選3%。
[0022]其中，所述體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM基本培養基中，采用O~0.5%的活性炭，優選0.1~0.5%，更優選0.1%。
[0023]其中，所述體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM基本培養基中，采用0.2~0.8%的植物凝膠，優選0.2~0.6%，更優選0.4%。
[0024]其中，所述體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM基本培養基中，還包括:500mg.11的谷氨酰胺和Ig.L-1的水解酪蛋白。
[0025]其中，所述胚性愈傷組織誘導階段、胚性愈傷組織增殖階段和體細胞胚成熟階段的培養條件均可以為:加凝膠前將 PH調至5.8，隨后在121°C、壓力IOlkp高溫、高壓條件下滅菌20分鐘；培養溫度24 土 1°C，黑暗條件培養。
[0026]本發明所述方法，通過對影響體細胞胚誘導和成熟的多種因素進行實驗，篩選得到的最佳成熟培養基組合，有利于實現粗枝云杉體細胞胚的大量和高同步化產生，有利于誘導產生的體細胞胚成熟，為粗枝云杉工廠化育苗的實現提供了最為關鍵的保證。
[0027]其中，所述體細胞胚萌發階段:采用1/4LM基本培養基，活性炭濃度為O~0.5%，優選0.1~0.4%，更優選0.2%。
[0028]其中，所述體細胞胚萌發階段所用的1/4LM基本培養基，采用干化時間為O~21天，優選1-10天，更優選4~10天,最優選4天。
[0029]其中，所述體細胞胚萌發階段所用的1/4LM基本培養基中，采用O~15%的PEG4000，優選O~10%，更優選0%，即不添加PEG4000有利于體細胞胚的萌發。
[0030]其中，所述體細胞胚萌發階段所用的1/4LM基本培養基中，采用I~15%的蔗糖，優選I~7%，更優選I~4%，最優選2%。
[0031]其中，所述體細胞胚萌發階段的培養基中，還包括:500mg 士1的谷氨酰胺，Ig-T1的水解酪蛋白和0.4%的植物凝膠。
[0032]其中，所述體細胞胚的萌發過程中，將體細胞胚水平放置于半固體培養基表面，培養皿傾斜45°角放置，有利于子葉伸展、胚軸和胚根伸長；同時，生長的胚根附著在培養基表面，避免了移栽時幼嫩苗根受損，有利于移栽成活。
[0033]其中，所述體細胞胚的萌發階段的培養條件為:培養溫度為24±1°C ;第一周(以7天為周期)，黑暗培養；第二周(以7天為周期)，20 μ mol.π12 M1光照下，并用一層紙(報紙)遮蓋，光周期為16h光照和8h黑暗；隨后,50 μ mol.τα2.s_1光照下,光周期為16h光照和
8h黑暗培養。
[0034]其中，本發明所述各階段的培養基中，由于使用的谷氨酰胺和ABA不耐高溫，采用過濾滅菌的方式，其他所有成分均采用高溫高壓方式滅菌。
[0035]本發明所述的方法，在對未成熟合子胚進行胚性愈傷組織誘導之前，還包括:對未成熟球果進行消毒，然后在無菌的環境下取出未成熟合子胚。
[0036]其中，所述消毒方式為:利用無水乙醇對粗枝云杉未成熟球果(即上述粗枝云杉自由授粉無性系的球果)消毒15~20min，再用無菌水沖洗至少2次。該種消毒方式能夠使污染率控制在0.1%以內，完全能夠滿足實際操作的需要，且操作簡單、高效、成本低、環境污染小。
[0037]本發明中出現的濃度百分數“％”均指質量-體積濃度g/100mL (即IOOmL溶液里需要添加的物質的克數)。
[0038]截至目前為止，國外采用幼嫩的莖尖為外植體進行誘導最多只能誘導出胚性愈傷組織，均不能分化為體細胞胚。本申請的發明人嘗試過用種子發芽的子葉、胚軸和胚根為外植體進行誘導，能夠誘導出愈傷組織，但是胚性愈傷組織誘導率極低，且不能繼續正常增殖，也不能夠進行體細胞胚的分化。所以，本發明利用整個合子胚作為外植體，對發育不同階段的外植體進行誘導對比，篩選得到最優的未成熟合子胚發育時期，符合研究和實際生產的需要。
[0039]另外，本申請通過大量的實驗，篩選出針對粗枝云杉的體細胞胚胎發生與植株再生的特定條件，有利于提高胚性愈傷組織的誘導頻率；有利于維持胚性愈傷組織的胚性能力，降低了喪失胚性能力的 風險；有利于實現體細胞胚的大量和高同步化的獲得；有利于提高體細胞胚的萌發效率。
[0040]本發明提供的方法，是專門針對粗枝云杉天然結實率低且具有嚴重的“大小年”現象，扦插生根困難，種苗繁殖技術無法滿足大面積植樹造林需要的現狀，尋找一種粗枝云杉優良無性系的體細胞胚胎發生與植株再生的技術。和現有國際上同屬或同類樹種的研究報道相比，胚性愈傷組織誘導率極大提高，體細胞胚的分化能力和萌發能力也極大提高，同時篩選得到胚性愈傷組織的長時間保持和增殖方法，極大降低了喪失胚性的風險。研究處于領先地位，對于實現粗枝云杉體細胞胚的工廠化育苗奠定理論基礎和提供切實可行的方法來說尤為必要；同時，也可以為粗枝云杉的生物技術育種、種質資源保存、快速繁殖、遺傳轉化建立良好的實驗體系。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0041]圖1為粗枝云杉的未成熟合子胚。
[0042]圖2為粗枝云杉的胚性愈傷組織。
[0043]圖3為粗枝云杉的成熟體細胞胚。
[0044]圖4為粗枝云杉的體細胞胚萌發的植株。
【具體實施方式】
[0045]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。[0046]本發明所用植物凝膠gellan gum,采用Sigma品牌。它是一種冷凝膠，跟瓊脂的作用相同，但效果要好很多，具體表現為培養基的凝結速度和透明程度均有提高。本發明所使用的活性炭activated carbon,同樣采用Sigma品牌,和一般市場上所售的活性炭相比,其活性吸附能力更強。也可以使用市場上可以購買得到的常規試劑。
[0047]本發明所使用的水為去離子水，純度為18.2兆歐。本發明所用其他原料和試劑均為從市場上購得的常規試劑。
[0048]本發明所用LM基本培養基的成分為:
[0049]大量元素:1.65g.IZ1NH4NO3, 1.9g.IZ1KNO3, 1.85g.IZ1MgSO4.7H20，0.34g.L^1KH2PO4j0.022g.L-1CaCl2.2H20。
[0050]微量元素:0.0304g.L^1H3BO3j0.043g.L-1ZnSO4.7H20，0.021g.L-1MnSO4.H2O,0.00 126g.L^1Na2MoO4.2H20, 0.00415g.L-1KI, 0.0005g.L-1CuSO4.5H20,0.000125g.L^CoCl^H^o [0051]鐵鹽:0.0278g.L-1FeSO4.7H20，0.0373g.L-1EDTA.2H20 (乙二胺四乙酸)。
[0052]肌醇:0.1g.L-1Myo-1nositol ο
[0053]有機鹽:0.0OOlg.L-1Thiamine-HCl (Vitamin B1), 0.0005g.L^1Niacin acid(Vitamin B3), 0.0OOlg.L-1Pyroxidone-HCl (Vitamin B6)
[0054]本發明出現的1/2LM基本培養基，就是對上述LM基本培養基的成分，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變。本發明出現的1/4LM基本培養基，就是對上述LM基本培養基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減到1/4，其他不變。本發明出現的1/2LM液體培養基，就是對上述LM基本培養基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變，同時培養基中不添加凝膠。本發明出現的1/2LM半固體培養基，就是對上述LM基本培養基，將大量元素、微量元素和鐵鹽減半，其他不變，同時培養基中添加凝膠。
[0055]其中，實際使用時先配制母液，然后稀釋使用。將大量元素和鐵鹽的母液配制成100倍，微量元素配制成1000倍，肌醇和有機鹽配制成500倍。為了避免大量元素中CaCl2.2H20和其他成分結合而形成沉淀，將其單獨配制。
[0056]本發明的內容是2011~2013年間試驗數據的綜合，實驗結果穩定、可靠。所述實驗材料采自甘肅省小隴山林業實驗局林業研究所云杉國家級種質資源庫。
[0057]實施例1
[0058]分離出未成熟合子胚:采集5月I日左右自由授粉產生的未成熟球果，6月初開始進行未成熟球果采集，每隔7~10天采集一次，共采集15次，12個基因型，將采下的球果于4°C條件下低溫放置。用無水乙醇處理球果15min，無菌水沖洗2次。無菌條件下，取出種子并剝去種皮和胚乳，將未成熟合子胚(如圖1所示)進行胚性愈傷組織的誘導。
[0059]實施例2
[0060]胚性愈傷組織誘導階段:將實施例1得到的未成熟合子胚進行胚性愈傷組織誘導，采用1/2LM基本培養基，附加激素濃度分別如下表所示:
[0061]
【權利要求】
1.一種粗枝云杉體細胞胚胎發生與植株再生方法，包括:采集粗枝云杉自由授粉無性系的球果，分離出未成熟合子胚進行體胚發生培養；所述體胚發生培養包括四個階段:胚性愈傷組織誘導階段、胚性愈傷組織增殖階段、體細胞胚成熟階段和體細胞胚萌發階段。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織誘導階段:采用1/2LM培養基，附加2，4-氯化苯氧乙酸5~15 μ M，6-芐基氨基嘌呤2.5~10 μ M ;所述2，4-氯化苯氧乙酸優選10 μ Μ，6-芐基氨基嘌呤優選5 μ Μ。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，胚性愈傷組織誘導階段所用的1/2LM培養基中還包括:濃度為1%的蔗糖，500mg.11的谷氨酰胺，Ig.11的酶解酪蛋白和0.2%的植物凝膠。
4.根據權利要求1~3任意一項所述的方法，其特征在于，所述胚性愈傷組織增殖階段:采用1/2LM培養基，附加3.75~10μ M的2，4-氯化苯氧乙酸和1.25~7.5 μ M的6-芐基氨基嘌呤，優選3.75~5 μ M的2，4-氯化苯氧乙酸和1.25~3.75 μ M的6-芐基氨基嘌呤，更優選5 μ M的2，4-氯化苯氧乙酸和3.75 μ M的6-芐基氨基嘌呤。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM培養基，細胞體積與培養液體積比為1:3~1:15，優選1:5~1:15，更優選1:7。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，胚性愈傷組織增殖階段所用的1/2LM培養基中，添加的蔗糖濃度為0.5~3.0%，優選I~1.5%，更優選1% ； 還包括:500mg.I/1的谷氨酰胺，Ig.11的酶解酪蛋白。
7.根據權利要求1~6任意一項所述的方法，其特征在于，所述體細胞胚成熟階段:采用1/2LM培養基，附加31 ~123 μ M的脫落酸，優選62~123 μ Μ，更優選92~123 μ Μ，最優選100~108 μ Mo
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，體細胞胚成熟階段所用的中1/2LM培養基中，還包括:聚乙二醇4000，濃度為O~7.5%，優選3.5~7.5%，更優選5~7.5%，最優選5% ； 添加I~9%的蔗糖，優選I~4.5%，更優選I~3%，最優選3% ； 添加O~0.5%的活性炭，優選0.1~0.5%，更優選0.1% ； 添加0.2~0.8%的植物凝膠，優選0.2~0.6%，更優選0.4% ； 還包括:500mg.11的谷氨酰胺和Ig.11的水解酪蛋白。
9.根據權利要求1~8任意一項所述的方法，其特征在于，所述體細胞胚萌發階段:采用1/4LM培養基，添加的活性炭濃度為O~0.5%，優選0.1~0.4%，更優選0.2% ； 添加O~15%的聚乙二醇4000，優選O~10%，更優選0% ； 添加I~15%的蔗糖，優選I~7%，更優選I~4%，最優選2% ； 還包括:500mg.I/1的谷氨酰胺，Ig.11的水解酪蛋白和0.4%的植物凝膠。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，體細胞胚萌發階段所用的1/4LM培養基，干化時間為O~21天，優選I~10天，更優選4~10天，最優選4天。
【文檔編號】A01H4/00GK103461119SQ201310364926
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月20日 優先權日:2013年8月20日
【發明者】王軍輝, 張建偉, 張守攻 申請人:中國林業科學研究院林業研究所