專利名稱：一種山茶未成熟胚再生胚狀體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及山茶花組織培養(yǎng)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種山茶未成熟胚再生胚狀體 的方法。
背景技術(shù)：
山茶花(Camdlia)是世界著名的觀賞木本花齊，其栽培歷史悠久。常用的無性繁殖方法是 扦插、分株和嫁接，由于山茶花是一種生長(zhǎng)比較緩慢的植物，特別是一些名貴和優(yōu)良品種， 育性較差，種質(zhì)資源缺乏，扦插時(shí)生根率極低，繁殖系數(shù)低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需要。因此 利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速、大量繁殖山茶花優(yōu)良品種具有重要意義。此外，近年來發(fā)展起來的 植物基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)突飛猛進(jìn)，山茶花的組織培養(yǎng)為該方向的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。在組織培 養(yǎng)中器官發(fā)生途徑成苗較快，但生根較難，且遺傳穩(wěn)定性較差，而胚狀體成苗途徑中胚狀體 具有兩極性結(jié)構(gòu)，利用這一途徑進(jìn)行無性繁殖，繁殖速度快，遺傳穩(wěn)定性高，能克服器官發(fā) 生途徑生根難的問題。另外，誘導(dǎo)胚狀體成苗，通過胚性細(xì)胞克隆，人工種子工廠化生產(chǎn)、 突變體誘導(dǎo)篩選、種質(zhì)資源保存和利用均具有重要意義。國(guó)內(nèi)外在紅山茶、S南山茶花、油 茶等山茶屬植物的體細(xì)胞胚狀體誘導(dǎo)有過報(bào)道，但再生率都較低，阻礙了下一歩工作進(jìn)展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)山茶花組織培養(yǎng)再生植株困難的技術(shù)瓶頸，提供一種山茶未成熟胚 再生胚狀體的方法。
本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)這種山茶未成熟胚再生胚狀體的方法，該方法按 以下歩驟進(jìn)行
(1) 將山茶花未成熟果子用自來水沖洗干凈，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水沖洗；然后
轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺(tái)卜.去除果皮后，用體積比為75%乙醇表面消毒30秒，無菌水沖洗2遍， 用重量比為0.1%的IIgCl2中浸泡15——20分鐘，無菌水沖洗5——6遍；
(2) 將種子剝?nèi)?nèi)外種皮，去除胚根和胚芽，將子葉切成薄片，接種在胚狀休誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)溫度為25±2°C,光照光強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為12h7d，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為 MS+ 1.0 mg-L"6-BA+0.2 mg丄"NAA;
(3) 將誘導(dǎo)的子葉形胚狀體從母體上分離下來，接種在胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，胚狀體生長(zhǎng)培 養(yǎng)基為MS+0.16-BA mg.L—'+0.01NAA mg'L"+ 40g.L_1 sugar,在苗高1—2厘米時(shí)移至1/2MS
培養(yǎng)基上。
3本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，操作工藝簡(jiǎn)便，培養(yǎng)時(shí)間短，再生頻率 高，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)山茶及實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化。
具體實(shí)施例方式
通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。 實(shí)施例這種山茶未成熟胚再生胚狀體的方法，材料為浙江紅山茶8月未成熟果實(shí)。將 采集的果實(shí)用自來水沖洗干凈，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水沖洗。然后轉(zhuǎn)移到無菌超凈
臺(tái)上去除果皮后，用體積比為75%乙醇表面消毒30秒，無菌水沖洗2遍，用重量比為0.1% 的HgCl2中浸泡15——20分鐘，無菌水沖洗5——6遍。無菌條件下剝?nèi)シN子外層種殼及內(nèi) 層種皮，取出具有兩旁肥厚子葉的成熟種胚，子葉切成薄片，接種在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg丄"6-BA+0.2 mg七"NAA+40 g'L"sugar。培養(yǎng)溫度為25士2",光照光 強(qiáng)為2500 3000 Lx，光照時(shí)間為12h/d。切成薄片的子葉在培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后， 一些子葉 開始變綠， 一周后子葉表面凹凸不平，3-4周后表面形成乳黃色的顆粒狀突起，在光照條件下 慢慢變綠，40天以后小顆粒長(zhǎng)成具有2片子葉狀的胚狀體。其再生頻率達(dá)55%以上。
將胚狀體從母體上分離下來，接種在胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基為MS+0.16-BA mg'L"+0.01NAAmg丄"+40g'L-'sugar。在其上生長(zhǎng)一周后，胚狀體開始兩極生長(zhǎng)，兩片葉子 慢慢張大，根向下鉆入培養(yǎng)基，并有很多須根長(zhǎng)出。生長(zhǎng)1周后苗高1一2厘米，移至1/2MS 培養(yǎng)基上，苗可健壯生長(zhǎng)，半月后小植株長(zhǎng)至3 — 5厘米高，已有多片葉子，溫室條件下鍛煉 一周左右，移栽入土。
除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技 術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1、一種山茶未成熟胚再生胚狀體的方法，其特征在于該方法按以下步驟進(jìn)行(1)將山茶花未成熟果子用自來水沖洗干凈，再用洗衣粉浸泡10分鐘，自來水沖洗；然后轉(zhuǎn)移到無菌超凈臺(tái)上去除果皮后，用體積比為75％乙醇表面消毒30秒，無菌水沖洗2遍，用重量比為0.1％的HgCl2中浸泡15——20分鐘，無菌水沖洗5——6遍；(2)將種子剝?nèi)?nèi)外種皮，去除胚根和胚芽，將子葉切成薄片，接種在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照光強(qiáng)為2500～3000Lx，光照時(shí)間為12h/d，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA；(3)將誘導(dǎo)的子葉形胚狀體從母體上分離下來，接種在胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+0.16-BA mg·L-1+0.01NAA mg·L-1+40g·L-1 sugar，在苗高1-2厘米時(shí)移至1/2MS培養(yǎng)基上。
全文摘要
本發(fā)明主要涉及一種山茶未成熟胚再生胚狀體的方法，按以下步驟進(jìn)行將種子剝?nèi)?nèi)外種皮，去除胚根和胚芽，將子葉切成薄片，接種在胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照光強(qiáng)為2500～3000Lx，光照時(shí)間為12h/d，胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg·L^-16-BA+0.2mg·L^-1NAA；將誘導(dǎo)的子葉形胚狀體從母體上分離下來，接種在胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基上，胚狀體生長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+0.16-BA mg·L^-1+0.01NAA mg·L^-1+40g·L^-1sugar，在苗高1-2厘米時(shí)移至1/2MS培養(yǎng)基上。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，操作工藝簡(jiǎn)便，培養(yǎng)時(shí)間短，再生頻率高，成本低，有利于大規(guī)模生產(chǎn)山茶及實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化。
文檔編號(hào)A01H4/00GK101558743SQ200910098400
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者李紀(jì)元, 李辛雷, 敏 田, 范正琪 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所