一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法
【專利摘要】本發明屬于植物生物【技術領域】，具體地，公開了一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法。所述方法改變了傳統的麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，即在誘導不定芽再生的培養基中不添加激素，而是利用高濃度的苯基噻二唑基脲溶液對各種來源的麻瘋樹外植體進行短期浸泡處理，給予外植體細胞短期但高強度的激素刺激，由此促使部分細胞以更高的效率直接再分化形成更多的不定芽。應用本發明所述方法可以顯著提高麻瘋樹外植體不定芽的再生效率和質量。此外，本方法外植體無需經過常規的愈傷組織形成和不定芽增殖階段，因此可顯著縮短再生培養周期，使麻瘋樹相關生物技術育種的工作效率得到相應的大幅度的提高。
【專利說明】一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物【技術領域】，具體地，涉及一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法。
【背景技術】
[0002]伴隨著全球對化石燃料的需求日益增長，存儲的化石燃料即將耗盡，人們越來越關注可再生的生物柴油。在可產生生物柴油的候選植物中，屬于大戟科的麻瘋樹CZairoAacurcas L.)具有明顯的優勢，它的種子含油量高，種仁含油量可達40%飛0%，同時，麻瘋樹油中含有活性成分多，如毒蛋白、麻瘋酮等有著重要的農藥和醫藥價值。
[0003]然而，大力推廣麻瘋樹的種植卻面臨一系列問題，雖然麻瘋樹種子中含油量高，但種子產量不高；種油中活性成分多，但仍需要改變油的成分才能直接替代化石燃料；麻瘋樹對環境要求較高，耐寒能力弱，分布區域較窄。麻瘋樹屬包括175個種，可以通過種間雜交引入優良性狀，但所需周期長，不能夠獲得特異的外源基因，故主要通過基因轉化改變遺傳背景。高頻率的植株再生體系是基因轉化的基礎。
[0004]麻瘋樹外植體根據來源不同可以分為不同的類型。從成年麻瘋樹植株上直接獲得葉片、葉柄經處理后可以得到成年植株葉片外植體、成年植株葉柄外植體。將麻瘋樹種子進行無菌培養得到的無菌苗，從無菌苗上得到無菌下胚軸、無菌子葉葉片和無菌子葉葉柄，經處理后可以得到無菌下胚軸外植體、無菌子葉葉片外植體和無菌子葉葉柄外植體。將麻瘋樹種子經常規培育、萌發得到的萌發苗，從萌發苗上可以得到下胚軸和真葉葉柄，經處理后可以得到種子苗下胚軸外植體和真葉葉柄外植體。
[0005]現有技術中誘導麻瘋樹外植體再生不定芽時，通常是在麻瘋樹外植體不定芽再生培養基中添加細胞分裂素，而最常用的細胞分裂素為6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)，濃度為2 mg/1 ;6-糠氨基嘌呤(6-KT)，濃度為0.1-1.0 mg/1或苯基噻二唑基脲(TDZ)，濃度為
0.05、.5 mg/1。在這種條件下葉柄外植體的不定芽再生效率很低，芽體的質量也較差。同時，這些再生體系均存在周期長(80 d以上)、再生率不高的問題，嚴重制約了麻瘋樹遺傳轉化研究的開展。

【發明內容】

[0006]本發明為了克服現有技術麻瘋外植體再生不定芽時再生率低、再生芽體質量差、再生周期長的缺陷，提供一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法。所述方法簡便，可以顯著縮短整個培養周期，而且通過所述的方法可以得到數量更多、質量更好的不定芽。
[0007]本發明通過以下技術方案予以實現上述目的:
一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，包括如下步驟:
51.獲得麻瘋樹外植體；
52.將步驟SI中的麻瘋樹外植體用10-60mg/1苯基噻二唑基脲(TDZ)溶液浸泡處理5?40 min ；S3.將步驟S2處理后的麻瘋樹外植體以橫放方式接種至無激素的培養基上培養；
所述橫放方式為將外植體的橫切面與培養基的水平表面相垂直；
所述麻瘋樹外植體為成年植株葉片外植體、無菌下胚軸外植體、無菌子葉葉片外植體、無菌子葉葉柄外植體、種子苗下胚軸外植體或真葉葉柄外植體。
[0008]麻瘋樹外植體根據來源不同可以分為不同的類型。從成年麻瘋樹植株上直接獲得葉片、葉柄經處理后可以得到成年植株葉片外植體、成年植株葉柄外植體。將麻瘋樹種子進行無菌培養得到的無菌苗，從無菌苗上得到無菌下胚軸、無菌子葉葉片和無菌子葉葉柄，經處理后可以得到無菌下胚軸外植體、無菌子葉葉片外植體和無菌子葉葉柄外植體。將麻瘋樹種子經常規培育、萌發得到的萌發苗，從萌發苗上可以得到下胚軸和真葉葉柄，經處理后可以得到種子苗下胚軸外植體和真葉葉柄外植體。
[0009]優選地，所述無菌下胚軸外植體用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理20 min。
[0010]優選地,所述成年植株葉片外植體或無菌子葉葉片外植體用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理40 min。
[0011]優選地，所述無菌子葉葉柄外植體或真葉葉柄外植體用20 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理20 min。
[0012]同時，發明人在前期研究工作中發現:從成年麻瘋樹植株上獲得的成年植株葉柄外植體最適合的處理方式為用3 mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理5 min,不定芽的再生效果最好。本發明同時也發現:而種子苗下胚軸外植體不適宜采用苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理的方法來誘導不定芽再生。由此可以看出:不同類型的麻瘋樹外植體的細胞的分裂能力各異，不同類型的麻瘋樹外植體對TDZ的敏感性也不同，決定了其再生不定芽的難易程度不同，所以，不是所有類型的麻瘋樹外植體都可以采用這種方法來誘導不定芽再生。
[0013]優選地，所述成年植株葉片外植體或無菌子葉葉片外植體在以橫放方式接種至無激素的培養基上培養時，采用葉片下表面朝上的接種放置方式，其不定芽的再生效果比較好。所謂葉片下表面朝上的接種放置方式就是說讓葉片的上表面緊貼培養基表面，葉片下表面朝上。
[0014]步驟S2的TDZ溶液采用一般方法配制成所需即可，具體地，可以采用如下方法配制:稱取一定量的TDZ粉末，用lmol/1 NaOH充分溶解，再用去離子水定容，采用I mol/1HCl溶液調整TDZ處理溶液的pH至5.8飛.0 ;使用前用0.22微米的水系濾膜對已配制好的TDZ處理溶液進行過濾滅菌。
[0015]所述不同類型的麻瘋樹外植體的制備方法可以參考本【技術領域】常規方法得到即可。
[0016]優選地，步驟S3中所述培養的條件為:光照強度為200-2500 lx，光照時間為12-16小時/天，培養溫度為25±1°C。
[0017]本發明的創造點在于先用高濃度的激素短暫處理，再用無激素的培養基培養再生不定芽，無激素培養基的種類對本發明來說不是著重點，只要是不含激素，而且能夠為不定芽的再生提供充足營養成分的培養基都可以實現本發明。優選地，本發明步驟S3中所述無激素的培養基以無激素的MS培 養基為主要成分。另外，所述無激素的培養基還含有25-35g/Ι蔗糖、8(Tl20 mg/1肌醇和6-8 g/Ι瓊脂；培養基pH為5.8-6.0。所述培養基并不限定本發明的保護范圍。[0018]傳統麻瘋樹外植體不定芽再生培養方法之所以存在不定芽再生效率很低，芽體的質量差、周期長的缺陷，首先是因為長時間培養外植體不能夠用高濃度的細胞分裂素，因為長期高濃度激素培養外植體將導致外植體受傷甚至死亡，而低濃度的細胞分裂素的刺激不定芽再生的作用又不夠強。其次是在不定芽形成以后殘存在培養基和外植體組織中的細胞分裂素對不定芽的進一步生長有十分不利的影響。
[0019]本發明對通常的麻瘋樹外植體不定芽再生培養方法進行了創新，即在誘導不定芽再生培養基中都不添加TDZ，取而代之的是利用高濃度的TDZ溶液對麻瘋樹外植體進行短期的浸泡處理，給予外植體具有分化能力的細胞相對于普通添加TDZ的培養基更強的刺激，誘導形成更多的不定芽。同時，由于僅是局部短時的浸泡處理，TDZ在細胞中的濃度隨后很快降低，減少了在培養后期對所形成的不定芽的發育的負面影響，可以達到一次培養操作就可以得到完整植株的高效目的。
[0020]本發明的發明人在前期工作中只研究了高濃度苯基噻二唑基脲短期處理方法促進成年植株葉柄外植體不定芽再生的效果。但是，后來經過大量的創造性試驗發現:不同類型的麻瘋樹外植體的細胞的分裂能力各異，不同類型的麻瘋樹外植體對TDZ的敏感性也不同，決定了其再生不定芽的難易程度不同，所以，不是所有類型的麻瘋樹外植體都可以采用這種方法來誘導不定芽再生。
[0021]本發明的有益效果:
本發明所述麻瘋樹外植體直接再生不定芽的方法簡便，可以顯著縮短整個培養周期，傳統方法的再生周期為80天以上，而本方法只需70天；通過本發明所述的麻瘋樹外植體直接再生不定芽的方法可以得到數量更多、質量更好的不定芽，現有方法的不定芽再生率一般為16.08 9-55.11 %，而采用本發明的方法的不定芽再生率為75.67 9-92.98 %。
[0022]說明書附圖
圖1.不同濃度的TDZ溶液處理無菌下胚軸外植體20分鐘后不定芽再生培養35天的效果；A: 10 mg/1 ；B:20 mg/1 ；C:30 mg/1 ；D:60 mg/1 ；bar =1 cm。
[0023]圖2.無菌下胚軸外植體再生不定芽在伸長培養基上培養15天后的效果；A:再生不定芽在伸長培養基中的生長效果圖；B:將再生不定芽從伸長培養基中取出來的效果圖；bar =1 cm。
[0024]圖3.采用20 mg/1 TDZ溶液浸泡處理2種類型下胚軸外植體20 min后以兩種方式接種至不定芽再生培養基上培養35天后的效果；A:無菌下胚軸外植體橫放方式；B:無菌下胚軸外植體豎插方式；C:種子苗下胚軸外植體橫放方式；D:種子苗下胚軸外植體豎插方式；bar =1 cm。
[0025]圖4.采用20 mg/1的TDZ溶液浸泡處理2種類型葉柄外植體20 min后以兩種方式接種至不定芽再生培養基上培養35天后的效果；A:真葉葉柄外植體橫放方式；B:真葉葉柄外植體豎插方式；C:無菌子葉葉柄外植體橫放方式；D:無菌子葉葉柄外植體豎插方式；bar =1 cm。
[0026]圖5.2種類型葉柄外植體再生不定芽在伸長培養基上培養15天后的效果；A、B:真葉葉柄外植體再生不定芽伸長效果；C、D:無菌子葉葉柄外植體再生不定芽伸長效果；bar =1 cm。
[0027]圖6.采用20 mg/1 TDZ溶液浸泡處理2種類型葉片外植體40 min后以兩種方式接種至不定芽再生培養基上培養35天后的效果；A:成年植株葉片外植體上表面朝上，B:成年植株葉片外植體下表面朝上；C:無菌子葉葉片外植體上表面朝上；D:無菌子葉葉片外植體下表面朝上；bar =1 cm ο
[0028]圖7.無菌子葉葉片外植體再生不定芽在伸長培養基上培養15天后的效果圖；bar=1 cm。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和具體實施例進一步詳細說明本發明。除非特別說明，實施例中采用的試劑和方法為本領域常規使用的試劑和方法。
[0030]實施例1:
S1.對外植體進行短期細胞分裂素溶液處理的容器的準備
選取直徑為9 Cm的有蓋培養皿，置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C，0.1 MPa的條件下滅菌20 min。
[0031]S2.苯基噻二唑基脲(TDZ)處理溶液的配制。
[0032]準確稱取一定量的TDZ粉末，用I mol/1 NaOH溶液充分溶解，再用去離子水定容，配制成0、10、20、30、40、50、60 mg/1的TDZ處理溶液(對照組O mg/1 TDZ溶液為無菌去離子水)。采用I mol/1 HCl溶液調整TDZ處理溶液的pH至5.8飛.0 ;使用前用0.22微米的水系濾膜對已配制好的TDZ處理溶液進行過濾滅菌。
[0033]S3.麻瘋樹無菌下胚軸外植體的獲取 將浸泡了 2天的麻瘋樹種子去殼，經過0.1%升汞溶液滅菌后，在超凈工作臺中用無菌手術刀剝離胚胎，將剝離的胚胎接種至經過高溫蒸汽滅菌的MS培養基(MS配方成分+30 g/I蔗糖+100 mg/1肌醇+6 g/Ι瓊脂；pH5.8-6.0)上，培養12天后，獲取種子苗上的下胚軸，用無菌手術刀將下胚軸切成長度約為0.5 cm的下胚軸切段，即可作為無菌下胚軸外植體。
[0034]S4.細胞分裂素(TDZ)溶液處理麻瘋樹種子苗下胚軸外植體
在超凈工作臺中，把切好的無菌下胚軸外植體分別置于上述步驟Si準備好的滅過菌的培養皿中，向各個培養皿中分別倒入上述步驟S2配置的各個濃度的TDZ處理溶液至浸沒葉柄外植體為止，蓋上培養皿蓋，靜置20 min后，倒掉TDZ溶液，保留無菌下胚軸，用滅過菌的鑷子從培養皿中取出所有的無菌下胚軸外植體，放置在無菌吸水紙上，吸去無菌下胚軸外植體表面多余的水分，每個濃度的TDZ溶液分別有3個平行處理。
[0035]S5.將切好的無菌下胚軸外植體置于細胞分裂素(TDZ)溶液處理的容器中，向該容器的廣口玻璃瓶中倒入不同濃度的TDZ溶液(O、10、20、30、60 mg/1)至浸沒所有的無菌下胚軸外植體為止(對照組O mg/1 TDZ溶液為無菌去離子水),蓋上瓶蓋,靜置20 min后，倒掉TDZ溶液，保留下胚軸，用滅過菌的鑷子從廣口玻璃瓶中取出所有的無菌下胚軸外植體，放置在無菌吸水紙上，吸去下胚軸外植體表面多余的液體，最后把處理后的無菌下胚軸外植體以橫放方式(將下胚軸外植體放置在培養基上，使下胚軸外植體與培養基表面輕輕接觸，并且使下胚軸外植體的橫切面與培養基的水平表面相垂直)接種在無激素MS培養基(MS配方成分+30 g/Ι蔗糖+100 mg/1肌醇+6 g/Ι瓊脂；ρΗ5.8?6.0)上培養35天，所獲得實驗結果如表I和圖1所不。
表I不同濃度的TDZ溶液浸泡處理麻瘋樹無菌下胚軸外植體誘導不定芽直接再生的效果
【權利要求】
1.一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51.獲得麻瘋樹外植體； 52.將步驟SI中的麻瘋樹外植體用10-60mg/1苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理5?40min ； 53.將步驟S2處理后的麻瘋樹外植體以橫放方式接種至無激素的培養基上培養； 所述橫放方式為將外植體的橫切面與培養基的水平表面相垂直； 所述麻瘋樹外植體為成年植株葉片外植體、無菌下胚軸外植體、無菌子葉葉片外植體、無菌子葉葉柄外植體或真葉葉柄外植體。
2.根據權利要求1所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，所述無菌下胚軸外植體用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理20 min。
3.根據權利要求1所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，所述成年植株葉片外植體或無菌子葉葉片外植體用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理40min。
4.根據權利要求1所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，所述無菌子葉葉柄外植體或真葉葉柄外植體用20 mg/?苯基噻二唑基脲溶液浸泡處理20 min。
5.根據權利要求3所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，所述成年植株葉片外植體或無菌子葉葉片外植體在以橫放方式接種至無激素的培養基上培養時，采用葉片下表面朝上的接種放置方式。
6.根據權利要求1所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，S3中所述培養的條件為:光照強度為2000?2500 lx，光照時間為12?16小時/天，培養溫度為25±1°C。
7.根據權利要求1所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，S3中所述無激素的培養基以無激素的MS培養基為主要成分。
8.根據權利要求7所述一種促進麻瘋樹外植體再生不定芽的方法，其特征在于，所述無激素的培養基還含有25?35g/l蔗糖、8(Tl20 mg/1肌醇和6?8g/l瓊脂；培養基pH為·5.8?6.0。
【文檔編號】A01H4/00GK103430841SQ201310333563
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月2日 優先權日:2013年8月2日
【發明者】劉穎, 楊躍生, 劉振蘭, 莊楚雄, 李靜, 童欣, 惠文凱, 陳曉陽 申請人:華南農業大學