藻青素二肽的生物技術制備方法
【專利摘要】本發明涉及通過用CGP酶降解聚合物制劑從藻青素（CGP）或CGP樣聚合物制劑酶法制備二肽組合物的方法，特別適于所述方法的CGP酶，以及藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段、尤其是通過如上所定義的方法獲得的二肽組合物作為藥物組合物、藥物或作為食品或飼料替代品的應用。
【專利說明】藻青素二肽的生物技術制備
【技術領域】
[0001]本發明涉及通過用CGP酶降解聚合物制劑從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物制劑酶法制備二肽組合物的方法，特別適于所述方法的CGP酶，以及藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段、尤其是通過如上所定義的方法獲得的二肽組合物作為藥物組合物、藥物或作為食品或飼料替代品的應用。
【背景技術】
[0002]已知天然存在三種不同的聚(氨基酸):聚(ε -L-賴氨酸)(ε _PL)、聚(Y_谷氨酸)(Y-PGA)和藻青素(CGP)。聚(氨基酸)存在于許多環境中，并且為生產性生物體實現不同的功能(0bst，M.等，Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。例如，藻青素(多-L-精氨酰-聚-[L-天冬氨酸])，作為藻青素顆粒性多肽(CGP)被熟知，在100多年前在藍細菌中發現(Borzi，A.，Malpighial:28-74 (1887))，其為該生物體提供氮、碳和能量。它在每個結構單元中含有5個氮原子并且因此形成理想的細胞內氮儲庫(Mackerras, A.H.等，J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990))。聚(氨基酸)的生物相容性和徹底的生物可降解性使它們成為生物醫藥、農業、農業化學、個人護理和藥學領域中人類生活的許多應用的理想候選物(Obst, M.等，Biomacromolecules5:1166-1176 (2004))。
[0003]包括藍綠藻螺旋藻(Spirulina)的藍細菌的幾個種已經被制成為人和動物的營養來源(Kihlberg, R.，A.Rev.Microbiol.26:427-466 (1972))。CGP 本身于 1887 年在藍細菌中發現。藍細菌的大多數屬帶有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合成CGP (Mackerras, A.H.等，J.Gen.Microbiol.136:2057-2065 (1990))。編碼 CphA 的基因也在異氧細菌中被鑒定(Krehenbrink, M.等，Arch.Microbiol.177:371-380 (2002) ; Fuser, G.等，Macromol.Biosc1.7:278-296(2007))。支化聚合物作為不溶的細胞內無膜顆粒出現在細胞質中(Allen, Μ.Μ.等，J.Bacteriol.154:1480-1484 (1983))。其由等摩爾量的精氨酸和天冬氨酸以聚(天冬氨酸)(PAA)主鏈形式排列組成，一部分精氨酸通過其ct -氨基與每個天冬氨酸的β-羧基連接(Simon, R.D.等，Biochim.Biophys.Acta420:165-176 (1976))。對于大規模生產，藍細菌cphA基因異源地克隆進大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)和惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。來自重組細菌的CGP含有很少的賴氨酸(Voss, 1.等，Metabol.Eng.8:66-78 (2006)) ? CGP廣泛地分布在不同的自然生活環境中，并且被細胞內或細胞外的CGP酶降解(分別為CphB、CphE)。具有CphE的細菌見于多個生活環境中；CphEpJP CphEan分別從病鱔假單胞菌BI (P.angulliseptica BI)和巨大芽孢桿菌BAC19 (B.megaterium BAC19)分離和表征(Obst, M.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105 (2002) ; Obst,M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004))。CGP降解還發生在缺氧的生活環境中，分別由諸如香港互營單胞菌KI (Sedimentibacterhongkongensis KI)或產堿假單胞菌DIPl (P.alcaligenes DIP1)的專性厭氧菌或兼性厭氧菌進行(Obst, M.等,Appl.Environ.Microbi
ol.71:3642-3652 (2005) ; Sallam, A.等，已投稿待發表(2008))。所有已知的 CGP 酶從 CGP產生水溶性β_ 二肽，然后其被轉運至細胞中進一步被分解代謝(Sallam，A.等，已投稿待發表(2008))。
[0004] 蛋白消化和轉運對生命是至關重要的。例如在反芻動物中，飲食蛋白質的主要部分被瘤胃菌叢(rumen flora)降解成氨基酸和肽。氨基酸結合至微生物蛋白中或傳送至消化道的下一部位或經過瘤胃壁直接吸收至血液中(Faix，S..等，Acta Vet.Brn0.70:243-246(2001))。然而，三肽和二肽比游離氨基酸更有效地被利用，具有較高的營養價值，被更好地吸收(至多達游離氨基酸的185%) (Adibi，S.A.，J.Clin.1nvest.50:2266-2275 (1971))并且比完整蛋白保留更多的氮，從而促進體重增長的增加(Dock, D.B.等，BiOCell28:143-150(2004))。在其某些氨基酸的轉運遺傳性受損的患者中的吸收研究顯示，如果作為二肽施用則這些氨基酸的吸收正常。這表明存在二肽的專用和有效的轉運系統(Adibi, S.A.，Gastroenterologyl 13:332-340 (1997))
。因此，水解蛋白飲食經常用作飼料補充劑以使營養不良的病例痊愈(Dock，D.B.等，Biocell28:143-150(2004))。
[0005]半必需氨基酸精氨酸在細胞生理學中具有多個關鍵的作用，并且因此被應用于許多心血管、生殖泌尿、胃腸、或免疫疾病的治療方案中(其綜述參見(Appleton，J.，Al tern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。必需氨基酸賴氨酸已知作為用于人和動物的食品添加劑，具有抗單純皰疹病毒的活性，并且改善小腸中的鈣吸收，因此起對抗骨質疏松癥的作用(Cynober, L.A., Metabolic and therapeutic aspects of amino acids in clinicalnutrition.(在臨床營養中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC, BocaRaton，USA(2003))。非必需氨基酸中的天冬氨酸充當L-精氨酸的前體，用于能量代謝(Voet, D.等，Biochemistry (生物化學).第三版，John Wiley and Sons Inc., NewYork(2004)),并且用于陽離子或其它氨基酸的藥物遞送(Cynober, L.A.，Metabolic andtherapeutic aspects of amino acids in clinical nutrition.(在臨床營養中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC Press LLC, Boca Raton, USA(2003))。由于二肽形式的氨基酸具有較高的生物利用度，因此它們作為二肽的施用在臨床上得到批準并可在市場上作為產品獲得(Duruy, A.等，Vie.Med.1nt.9:1589 (1965) ; Duruy, A., Med.1nt.1: 203 (1966) ;Sellier, J., Rev.Med.Toulouse5:879(1979) ; De-Aloysio, D.等，Acta Eur.Fertil.13: 133-167 (1982) ; Rohdewald, P., Int.J.Cl in.Pharmacol.Ther.40:158-168(2002) ;Lamm, S.等，Eur.Bull.Drug Res.11:29-37(2003))。
[0006]迄今，對于CGP本身還未知有直接的應用。以前對CGP的研究受到CGP作為生物可降解PAA的潛在來源的啟發(Mooibroek, H.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:257-267(2007))。后者具有許多潛在的應用(Obst, M.等，Biomacromolecules5:1166-1176(2004))，例如作為透析膜、人工皮膚和整形外科植入體中的成分或作為藥物載體。PAA還可以替代非生物可降解的具有多種技術應用的聚丙烯酸酯。這是關于哺乳動物、禽類和魚類腸道菌叢生物降解CGP，和隨之CGP和其二肽作為營養和/或治療添加劑的潛在應用的最初研究。
[0007]對哺乳動物、禽類和魚類腸道菌叢的幾個樣品研究藻青素降解。所有樣品在37°C中12~48h的孵育期內實現了徹底的厭氧降解CGP。在所有樣品中發現了 CGP降解細菌，并且其高度地集中在來自兔和綿羊的盲腸菌叢和來自鯉魚的消化道菌叢中。總計62株未被污染的培養物被分離并且需氧地降解CGP，其中46株還在24h~7天的孵育期內厭氧地降解CGP。HPLC分析表明所有分離株菌將CGP降解成其組成性的二肽。8株通過16S rDNA測序鑒定，并且隸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和小單抱菌屬(Micromonospora)。CGP 可以見于三種不同的鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)市售產品中，這些產品中含有0.06~0.15%(wt/wt)CGP。現在發現CGP可以在細胞外被降解，以及關于消化道中CGP生物可降解性的最初證據，和隨后，CGP及其二肽在營養和治療中作為精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和可能其它的氨基酸的可高度生物利用的來源的潛在應用。
[0008]CGP在從指數生長期至靜止生長期的過渡期間在藍細菌中積累(Mackerras, A.H.等，J.Gen.Microbiol.136: 2057-2065 (1990) ; Sherman, D.M.等，J.Phycol.36:932-941 (2000))。藍細菌的大多數屬帶有功能性藻青素合成酶基因(cphA)并合成 CGP(Simon, R.D.1987.1nclusion bodies in the cyanobacteria:cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies (藍細菌中的包涵體:藻青素、聚磷酸酯(鹽)、多面體)，199-225 頁。見 P.Fay 和 C.van Baalen(編輯)，The cyanobacteria (藍細菌)，Elsevier,Amsterdam, The Netherlands;Allen, Μ.M.等，Methods Enzymol.167:207-213(1988) ; Mackerras, A.H.等，J.Gen.Microbiol.136:2057-2065(1990) ; Liotenberg, S.等，Microbiology 142:611-622 (1996) ; Wingard, L.L 等，Appl.Environ.Microbiol.68:1772-1777 (2002))。cphA 基因還在異氧細菌中被鑒定(Krehenbrink, Μ.等，Arch.Microbiol.177:371-380(2002);Ziegler, K.等，Naturforsch.57c:522-529 (2002))。聚合物作為無膜顆粒出現在細胞質中并且在中性pH下以及生理學離子強度中是不溶的(Allen, Μ.Μ.等，J.Bacteriol.141:687-693 (1980))。CGP 在限制條件下積累，所述條件包括低溫、低光強度、磷或硫限制(Stephan等,Z.Naturforsch.55:927-942 (2000))。在藍細菌中，聚合物鏈的分子質量范圍為25~IOOkDa (Simon, R.D., Biochim.Biophys.Acta422:407-418 (1976))，而來自重組菌株的聚合物鏈則顯示較低的范圍(25~30kDa)和多分散性。 此外，發現來自重組菌株的聚合物含有賴氨酸作為另外的氨基酸組分(Ziegler, K.等，Eur.J.Biochem.254:154-159(1998);Aboulmagd, Ε.等，Biomacromolecules2:1338-1342 (2001))。CGP的作用是臨時性的氮、能量和可能的碳的儲庫(Li, H.等，Arch.Microbiol.176:9-18(2001);Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005))。由于CGP在每個結構單元中含有5個氮原子，因此其滿足完善的細胞內氮儲庫的標準(Simon, R.D.1987.1nclusion bodies in the cyanobacteria:cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies (藍細菌中的包涵體:藻青素、聚憐酸酯(鹽)、多面體)，199-225 頁。見 P.Fay 和 C.van Baalen (編輯)，The cyanobacteria(藍細菌),Elsevier, Amsterdam, The Netherlands)。
[0009]CGP的細胞內降解由在細胞質內出現的高度特異性的藻青素酶(CphB)催化并且經α -裂解機制進行，結果形成β - 二肽(Richter，R.等，Eur.J.Biochem.263:163-169 (1999))。CGP作為還用于不能夠積累CGP的細菌的有價值底物(Obst,M.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005) ;Sallam, A.和A.Steinbuchel.2007a)。從池塘沉積物中分離的一種新的嗜溫性蛋白水解細菌,硫酸鹽還原梭菌(Clostridiumsulfatireducens sp.nov.)能夠還原硫代硫酸鹽、硫磺以及短暫地還原硫酸鹽，這些細菌中的許多顯示具有細胞外藻青素酶，該酶將CGP降解成其可利用的二肽，二肽可以被轉運至細胞中并進一步被利用(Sallam，A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacteriumPseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other three co—isolates in themixed bacterial consortium.(反硝化細菌產堿假單胞菌DIPl株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)。已投稿待發表)。這些酶的幾種實例被分離和表征，諸如來自革蘭氏陰性細菌病鱔假單胞菌(Pseudomonas angulliseptica)BI株的CphEPa。此細胞外酶顯示類似于CphB的用于CGP降解的α-裂解機制(Obst，Μ.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105 (2002))。
[0010]當從巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)BAC19株中分離細胞外CphEBm時發現革蘭氏陽性細菌也分泌CGP酶(Obst, M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004)), CphEan均鑒定為絲氨酸型水解酶。最近的研究揭示了細胞外CGP降解也可由分別來自專性以及兼性厭氧菌，諸如香港互營單胞菌KI株(0bst，M.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005))和產堿假單胞菌 DIPl 株(Sallam, A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by thedenitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other threeco-1solates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細菌產喊假單胞菌 DIPl 株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)。已投稿待發表)的CGP酶催化。所有研究的CGP酶產生β-Asp-Arg 二肽作為裂解產物，然而，在CphEem時另外檢測到(Asp-Arg)2 四肽(Obst, M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004))。直到最近，已知對于CGP本身或其二肽沒有實際的應用。相反，對于聚(天冬氨酸)(PAA)已經確立了作為非生物 可降解的聚丙烯酸酯的替代品的經濟上重要的應用，所述PAA是CGP 的結構兀件(聚合物主鏈)(Schwamborn, M., Polym.Degrad.Stab.59:39-45(1998))。PAA還可以用于許多領域包括造紙、涂料和油工業(其綜述見Joentgen, W.等人,2003.Polyaspartic acids(聚天冬氨酸)，175-199 頁，見；S.R.Fahnestock 和 A.Steinbuchel (編輯)，Biopolymers, vol7.Wiley, ffeinheim)。對于 PAA 也描述了生物醫學應用(Leopold, C.S.等，J.Pharmacokinet.Biopharm.4: 397-406 (1995) ; Yokoyama, M.等，CancerRes.6:1693-1700 (1990)) ο僅在最近，出現對于CGP- 二肽和可能對于CGP本身的生物醫學應用，這些應用首先取決于CGP降解細菌在大量研究的哺乳動物、禽類和魚類群落中的令人驚奇的廣泛分布，這表明CGP可能在各自的消化道中是可降解的。另一方面，如果以二肽或三肽形式施用氨基酸的生物利用度提高是熟知的理論并且有效地應用于一些治療領域中。因此，CGP和/或其β_ 二肽可以被認為是不久將來的潛在的天然食品和/或治療用添加劑(Sal lam, A.和 A.Steinbuchel.2007c.Potential of cyanophycin anditsβ-dipeptides as possible additives in therapy, food and feed industries (藻青素和其β - 二肽作為治療、食品和飼料工業中的可能添加劑的潛力))。
[0011]僅在最近幾年期間建立了對CGP的半工藝量生產和有效分離。應用大腸桿菌、富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)和鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi)ADPl 株，后者顯不約 46% 的最大 CGP 收率(wt/wt) (Obst, Μ.等，167-194 頁。見 J.Μ.Shively (編輯)，Inclusions in Prokaryotes (原核生物中的包涵體)，vol.1.Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg (2006))。然而，要求的底物和培養條件也是選擇經濟適當的CGP-生產源的決定性因素。
[0012]現在發現純CGP- 二肽可以在經濟的大規模工藝中制備，該工藝從含有CGP的生物量開始并以純CGP-二肽結束。由于產堿假單胞菌DIPl株可以顯示在簡單生長要求基礎上的高酶生產率，發現此菌株對于這樣的工藝方法是理想的。
[0013]藻青素在每個結構單元中含有5個碳原子，并且因此確實達到了完善的動態細胞內氮儲庫的標準((Simon, R.D.1987.1nclusion bodies in the cyanobacteria: cyanophycin, polyphosphate, polyhedral bodies (藍細菌中的包涵體:藻青素、聚磷酸酯(鹽)、多面體),199-225 頁。JAL P.Fay 和 C.van Baalen (編輯)，The cyanobacteria (藍細菌)，Elsevier, Amsterdam, The Netherlands);其量根據細胞的需要而波動(Carr, N.G.1988.Nitrogen reserves and dynamic reservoirs in cyanobacteria (藍細菌中的氮儲庫和動態儲庫)，13-21 頁。見 L.J.Rogers 和 J.R.Gallon (編輯)，Biochemistry ofthe algae and cyanobacteria (藻類和藍細菌的生物化學)，Annual Proceedings ofthe Phytochemical Society of Europe, Clarendon, Oxford.)。當蛋白合成減少時聚合物在藍細菌積累，所述蛋白合成減少是從指數生長期至靜止生長期的過渡期間天然引起的(Simon, R.D.，Arch.Microbiol.92:115-122 (1973a))或是通過添加蛋白生物合成的抑制劑(例如，氯霉素)導致的(Ingram, L.0.等，Arch.Microbiol.81:1-12 (1972) ; Simon, R.D., J.Bacteriol.114:1213-1216 (1973b))并且當繼續平衡生長時該聚合物消失(Mackerras, A.H.等，J.Gen.Microbiol.136:2057-2065 (1990))。CGP 積累也受磷限制(Stephan 等，Z.Naturforsch.55:927-942 (2000))、硫限制(Ariho, X.等，Arch.Microbiol.163:447-453(1995))、低溫、低光強度或這些因素的組合(Obst, M.等，Biomacromolecules5:1166-1176(2004))促進。
[0014]不同的方法被開發用于確定和定量純化的CGP或其在細胞中的含量。通過Sakagushi試劑在水解 或在未水解的聚合物中以比色法定量CGP的精氨酸含量(Simon, R.D., J.Bacteriol.114:1213-1216 (1973b))。純化的藻青素的氨基酸組分可以通過HPLC測定(Aboulmagd, E.等，Arch.Microbiol.174:297-306 (2000))。對于藻青素的快速和靈敏的測定，開發了基于1H核磁共振(NMR)的方法(Erickson, N.A.等，Biochim.Biophys.Acta.1536:5-9(2001)) ο
[0015]CGP降解(細胞內或細胞外)主要引起其可利用的二肽的釋放，然后這些二肽在細胞內裂解成其組成性的氨基酸以進入細胞代謝中。藻青素的細胞內降解由藻青素酶(CphB)催化。Gupta, Μ.等，J.Gen.Microbiol.125:17-23 (1981)描述了在柱胞魚渥藻(Anabaenacylindrica)的異形胞和營養細胞中的第一種藻青素酶。該酶是一種單體為29.4kDa、絲氨酸型和藻青素特異性的外肽酶，其主要降解產物是經α -裂解機制的天冬氨酸-精氨酸二肽(Richter, R.等，Eur.J.Biochem.263:163-169 (1999))。在近幾年中，分離了能夠通過細胞外藻青素酶(CphE)降解藻青素的需氧和厭氧細菌(0bst，M.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002)) ; Obst1M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004) ; Obst, Μ.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652(2005);Sallam, A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobicand aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonasalcaligenes strainDIPl—Role of other three co—isolates in the mixed bacterialconsortium.(反硝化細菌產堿假單胞菌DIPl株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發表)。類似于CphB，以前表征的分別來自病鱔假單胞菌(Pseudomonas anguiIIiseptica)BI 株和巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)BAC19株的細胞外CGP酶；CphEPa和CphEail被鑒定為絲氨酸型藻青素特異性酶并且產生CGP-二肽作為降解產物，然而，在CphEan時另外檢測到(Asp-Arg)2四肽。CphEpJ^SEW究顯示該酶在羧基末端處水解CGP并且從降解的聚合物鏈端連續地釋放β -Asp-Arg 二肽(其綜述參見 Obst, Μ.等，Biomacromolecules5:1166-1176 (2004))。此外，來自產喊假單胞菌DIPl的第三種細胞外藻青素酶(CphEal)最近以粗制形式應用于CGP-二肽的工藝生產中(Sallam, A.，和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technicalproduction of β -dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產 β - 二妝的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))。
[0016]僅在近幾年期間建立了半工藝量的CGP的生產和有效分離。成功了應用了幾種細菌菌株:大腸桿菌、富養羅爾斯通氏菌和鮑氏不動桿菌(0bst，M.等，Biomacromolecules5:1166-1176(2004))。然而，CGP的生物工藝相關性在理論上基于其是聚(天冬氨酸)的來源，后者在工業應用中具有很高的潛力[例如，用于水處理；造紙和皮革工業，作為分散劑(Roweton, S.等，J.Environ.Polym.Degrad.5:175-181 (1997) ;Mooibroek, H.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.77:257-267(2007))或作為用于聚丙烯酸酯的生物可降解替代品(Schwamborn, Μ.，Polym.Degrad.Stab.59:39-45 (1998))。PAA 還具有潛在的生物醫學應用作為透析膜、人工皮膚、整形外科植入體中的成分和作為藥物載體(Leopold，C.S.等，J.Pharmacokinet.Biopharm.4:397-406 (1995))。
[0017]如上所述，揭示了 CGP-二肽和可能CGP本身的生物醫學應用，這表明CGP在哺乳動物和魚類消化道內可能是可降解的；這顯示在不久的將來該聚合物和其二肽作為天然食品和/或治療用添加劑的可能性。因此，最近構建了用于使用來自產堿假單胞菌DIPl株的粗制CphEal從CGP生產二肽的大規模工藝。此初步工藝包括三個階段；階段1:CGP的大規模提取和純化，階段I1:粗制CphEal粉末的大規模生產，階段II1:如上所述建立CGP至其二肽的降解。現在發現，該初步工藝的后兩個階段可以為未來的應用被大大地優化。此外，CphEal從粗制粉末中工藝純化，并且揭示了其生物化學特征。

【發明內容】

[0018]本發明在于提供:
[0019](1) 一種從藻青素(CGP)或CGP樣聚合物制劑中酶法制備二肽組合物的方法，所述方法包括以CGP酶降解所述聚合物制劑；
[0020](2)上面⑴所述的方法的優選實施方式，其中所述CGP酶:
[0021](i)其分子量為45kDa，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7~8.5并且將CGP降解為β -Asp-Arg ;和/或
[0022](ii)其是能夠將CGP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作為DSM21533保藏的產堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或片段；
[0023](3)如上面⑵中所述的CGP酶；和
[0024](4) 一種組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補充劑，其含有藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段；
[0025](5)藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段在制備用于營養治療的藥物，或作為食品或飼料補充劑中的應用；
[0026](6) 一種用于需要營養治療的患者的營養治療的方法，所述方法包括向所述患者施用合適量的含有藻青素(CGP)或CGP樣聚合物或其片段的組合物；
[0027](7)上面(4)~(6)的優選實施方式，其中所述組合物、藥物組合物、藥物、食品或飼料補充劑含有通過酶法蛋白水解從CGP或CGP樣聚合物得到的二肽或二肽混合物，優選所述二肽混合物由天冬氨酸-精氨酸和天冬氨酸-賴氨酸構成和/或可由上面
(I)或⑵所述的方法獲得。
【專利附圖】

【附圖說明】[0028]圖1:基于16S rDNA序列的相鄰連接樹(Neighbour-joining tree)顯示以前以及本研究期間分離的CGP降解細菌的評估親緣關系。粗體的菌株是本研究期間分離的菌株。下劃線的菌株是以前用于CGP降解的研究的菌株(0bst，M.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002) ; Obst, Μ.等，Biomacro-molecules5:153-161 (2004) ; Obst, Μ.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005) ; Sallam, A.等，已投稿待發表(2008))。大腸桿菌K12用作外類群。登錄號在括號中給出。步長值顯示為100次重復的百分比。Bar:2%序列趨異。
[0029]圖2:由來自產堿假單胞菌DIPl株的細胞外CGP酶在CGP覆層瓊脂板上引起的降解暈；CphE:降解階段(階段III)之前的粗制粉末，CphE R:降解階段后回收的粉末。
[0030]圖3:產堿假單胞菌DIPl株在不同底物上的生長。培養在100ml帶有擋板的Klett培養瓶中進行；每個培養瓶含有IOml SM培養基和Igr1的測試底物。試驗進行兩次，其接種以在相同測試條件下生長的預培養物。在30°C中的24h孵育期后通過OD578nm的增加監測生長。
[0031]圖4:在不同濃度(I~10g/l)的粗制CphE的催化作用下完全降解不同濃度(10~50g/l)的CGP需要的孵育時間。反應試管在30°C中在轉速為3rpm的試管旋轉器中孵育。最高測試濃度的CGP(50g/l)在2g/l粗制CphE粉末的存在下可以在IOh內降解。
[0032]圖5:產堿假單胞菌DIPl在Biostat D650攪拌釜式反應器中的分批發酵，所述反應器含有具有g/Ι檸檬酸鈉的4201 SM培養基并接種以4%(V01/V01)預培養物。預培養物培養在含有11相同培養基的21帶有擋板的培養瓶中并在30°C中孵育12h。Biostat D650反應器中的發酵參數和培養條件為；pH為6.9~7.5，溫度為30°C，并以0.2vvm通風。p02設置為40%的最小值，并且通過攪拌自動地調整，否則攪拌保持為lOOrpm。箭頭指示誘導時間。*600nm處的光密度(OD600), ? )*pH,丄).*攪拌器速度(rpm), Α)? *p02(%飽和度)，—)。* 通氣量(I min—1)，.)。
[0033]圖6:用于在產堿假單胞菌DIPl株的發酵上清液中收集、濃縮和脫鹽蛋白的連續系統(階段II)。為了收集，CEPA Z41連續離心機用來分離細胞，上清液收集在中央的1001槽中。為了濃縮，具有30kDa盒的錯流裝置連接到中央槽；濃縮的滲余物重新泵入槽中，同時直接棄去滲透物。調節錯流的流速以保持槽中僅501。最后濃縮的51用5柱床體積的H2O脫鹽，在_30°C中冷凍并凍干。[0034]圖7:用于制備的CGP- 二肽的質量控制的TLC板。1:標準氨基酸和在測試的過濾系統后獲取的直接二肽樣品；1:30kDa。-COP.錯流盒(cross flow cassette)。2:濾膜(lOkDa.-COP)。3:濾膜(5kDa.-COP)。4:濾膜(lkDa.-COP)。5:濾膜(0.5kDa.-COP)。6:CGP- 二肽(錯流和凍干后的最終裝料)。I1:標準氨基酸和下列的水解樣品；a:CGP- 二肽(錯流和凍干后的最終裝料)。b:Asp-Arg 二肽。c:Asp-Lys 二肽。(b, c; Sigma Aldrich,Deisenhofen, Deutschland)。僅一個斑點指示所有直接樣品(I)而水解樣品顯示標準氨基酸天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸的典型斑點(II)。
[0035]圖8:大腸桿菌 DHl (pMa/c5-914:: CphApcc6803)在 Biostat D650 攪拌釜式反應器中的分批發酵，所述反應器含有具有IOOmg 1 -1氨節西林的40017%(vol/vol)protamylase培養基。預培養物(4%，vol/vol)在21培養瓶中制備，每個培養瓶含有11與發酵相同的培養基并在30°C中孵育20h。Biostat D650反應器中的發酵參數和培養條件為:pH為7.5，以
0.17vvm通風，p02恒定地保持在20%并且通過攪拌自動地調節。發酵進行15h，首先在30°C中6h，然后在37°C中以誘導CGP-合成酶的表達。濁度(OD85tl) ( ? )，p02 (%飽和度)(▼)，通風(Ι/min) ( ▲)，攪拌(rpm) (.)，溫度(°C ) ( )。
[0036]圖9:在Biostat D650反應器中在7%(vol/vol)protamylasse培養基上發酵第15h時大腸桿菌DHl (pMA/c5.914:: cphAPCC6803)細胞的相差顯微照片。CGP色素粒作為細胞中的反光積聚物出現。Bar:10ym。
[0037]圖10:經對CGP的特異性結合來自產堿假單胞菌DIPl株的CphEal的純化步驟的SDS-PAGE0凝膠A:通過硝酸銀法染色的SDS-PAGE ；M:分子量標準蛋白，C:粗制CphEal的對照，S1:在將CGP和粗制CphEal混合在一起后即刻獲得的上清液樣品，S2:6min結合時間后的上清液樣品，S2’:10倍濃縮后的與SI相同的樣品，ffl, W2:兩次洗滌步驟后的上清液樣品。凝膠B:使用如A中三倍體積的純化CphEal并用硝酸銀染色較長時間的SDS-PAGE。除了在45kDa處CphEal的條帶以外可以觀察到很少其它的低-濃縮蛋白條帶。
【具體實施方式】
[0038]在本發明的方面(I)的方法中，二肽組合物可以由單個二肽或二肽混合物構成。然而優選所述二肽含有選自天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和存在于CGP樣聚合物的其它氨基酸殘基的氨基酸殘基。特別優選的是所述二肽選自天冬氨酸-精氨酸和天冬氨酸-賴氨酸。
[0039]根據本發明的“CGP”和“CGP樣聚合物”是主要由一個或多個二肽單元構成的肽結構，優選所述二肽單元由下列氨基酸殘基的兩種構成:天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、谷氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸等。
[0040]本領域中已知的大量CGP酶可以用于CGP降解(參見表2和4)。然而，優選CGP酶是來自產堿假單胞菌的CGP酶，特別優選來自產堿假單胞菌DIPl株。根據本發明的方面
(2)，CGP酶⑴其具有45kDa的分子量，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7~8.5并且將CGP降解為β -Asp-Arg ;和/或(ii)其是能夠將CGP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作為DSM21533保藏的產堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或片段。上述天然CGP酶的突變體、衍生物或片段包括片段(具有至少50個天然序列的連續氨基酸殘基，優選N-和/或C-末端截短產物，其中至多50，至多30，或至多10個末端氨基酸殘基被去除)，衍生物(特別是具有功能蛋白和肽諸如分泌肽、前導序列等的融合產物，和具有化學結構部分諸如PEG、醇類、胺類等的反應產物)和突變體(特別是添加、置換、倒位和/或缺失的變異體，基于氨基酸與天然酶具有至少80%、優選至少90%、最優選至少95%序列同一性，或其中I~20，優選I~10個連續或分離的氨基酸被添加、置換、倒位和缺失；對于置換突變體，特別優選保守置換)，然而，條件是所述修飾的CGP酶具有天然CGP酶的酶活性。
[0041]本發明的方面⑴和⑵所述的方法可以進一步包括通過培養原核或真核生物生產細胞系來制備CGP或CGP樣聚合物制劑。所述生產細胞系可以是能夠產生CGP或CGP樣聚合物的任何細胞系。優選所述生產細胞系選自大腸桿菌、富養羅爾斯通氏菌(Ralstonia eutropha)、鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baylyi )、谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)、酵母菌株和植物生物質。特別優選的生產細胞系是富養羅爾斯通氏菌H16-PHB-4-Aeda (pBBRlMCS-2::cphA6308/edaH16)和大腸桿菌 DHl (pMa/c5_914:: cphAPCC6803)。
[0042]上述方法可以進一步包括分離、純化和/或化學修飾通過培養所述生產細胞系獲得的所述CGP產物的步驟。這樣的分離、純化和化學修飾分離可以通過本領域中充分確立的方法來實現。
[0043]然而對于方面(I)和(2)所述的方法優選通過培養所述生產細胞系獲得的CGP產物直接用所述CGP酶進行降解，即，無需分離或純化。
[0044]在另一優選實施方式中，方面(I)和(2)所述的方法進一步包括純化或分離降解產物和/或化學修飾降解產物。同樣，這樣的純化、分離或化學修飾可以通過本領域中充分確立的方法來實現。
[0045]本發明的方 面(3)涉及一種CGP酶，
[0046](i)其分子量為45kDa，最適溫度為50°C，且最適pH范圍為7~8.5并且將CGP降解為β -Asp-Arg ;和/或
[0047](ii)其是能夠將CGP或CGP樣聚合物裂解成二肽的已在DSMZ作為DSM21533保藏的產堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal,或是其突變體、衍生物或片段。對于突變體、衍生物和片段，其指上面給出的定義。
[0048]根據本發明的方面(4)、(5)和(6)的藥物組合物、藥物、食品或飼料補充劑可以進一步含有藥學或飲食可接受的合適載體、粘合劑等。它們可以進一步含有用于各種藥用目的的其它活性化合物。該藥物組合物特別適合于營養治療。營養治療的類型當然取決于組合物/藥物內存在的氨基酸，如下所述將變得顯而易見:
[0049]近年來在病危患者的營養治療中的進展更好地揭示了某些氨基酸對在疾病過程中維持組織蛋白內穩態的必要性(Witte, Μ.B.和Barbul A., Wound Rep.Reg.11:419-423(2003)) o以前，氨基酸被分類為非必需氨基酸(非必要的)或必需氨基酸(必要的)。然而，隨著對涉及氨基酸的體內生理學的更好理解，提出了可替代的分類法，該分類將某些氨基酸的必要性重新定義為是有條件地非必要的(Laidlaw，S.A.和Kopple，J.D., Am.J.Clin.Nutr.46:593-605 (1987))。這使得這些氨基酸單獨作為完備的營養方案或作為營養方案的一部分以改善營養結局、免疫應答、和組織痊愈的應用變得有吸引力。在下面的章節中，討論關于構成CGP的這三種氨基酸的生理學和作用機制的發現。這些氨基酸為:非必需的L-天冬氨酸、半必需的L-精氨酸和必需氨基酸L-賴氨酸。由于精氨酸具有大量的生理效應，對精氨酸給予了特別的關注。
[0050]L-天冬氨酸:非必需的L-天冬氨酸的分子質量為133.10g/mol，并且是二羧基氨基酸。大多數L-天冬氨酸可以在蛋白質中發現，而在體液和在植物中也發現小量的其游離形式(Barrett, G.C.和 Elmore D.T.Amino Acids and Peptides.(氨基酸和妝)CambridgeUniversity Press, Cambridge, UK (1998))。L-天冬氨酸是天然生物聚合物CGP和合成甜味劑阿斯巴甜(Aspartame)的組成成分。天冬氨酸在水中微溶，并且其鹽形式水溶性較高。飲食的天冬氨酸從小腸通過主動轉運被吸收以進入門靜脈循環，然后被轉運至肝臟，在此其許多被代謝為蛋白、嘌呤類、嘧唳類物質(Barrett, G.C.和Elmore D.T.Amino Acidsand Peptides (氨基酸和妝).Cambridge University Press, Cambridge, UK (1998)) ? L_ 天冬氨酸還可以充當檸檬酸循環中的能量來源，并且因此被認為有效地對抗疲勞(還參見下面=Asp-Arg)。天冬氨酸用于陽離子如Mg2+、K+、Ca2+、Zn2+，或其它氨基酸的藥物遞送中以增加其生物利用度(Cynober, L.A.，Metabolic and therapeutic aspects of amino acidsin clinical nutrition.(在臨床營養中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRC PressLLC, Boca Raton, USA(2003))。
[0051]L-精氨酸:L_精氨酸是分子質量為174.2g/mol的強堿性氨基酸并且見于大多數蛋白中。其每分子含有4個氮原子，并且因此是人和動物中氮豐度最高的載體(Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。精氨酸對于魚類必不可少的(Ahmed, 1.和 Khan, M.A., Aquacult.Nutr.10:217-225 (2004)),而在哺乳動物中，由于其可以經營養攝取或經重新合成(內源性的)來補償，其被認為是半必需的。在腎臟中，大多數內源性精氨酸來源于瓜氨酸，后者是腸道或肝臟中谷氨酰胺代謝的副產物。然而，由于精氨酸生物合成不能增加以補償耗竭或供應不足，因此飲食攝取(對人平均為大約 5 ~6g/天，Witte, M.B.和 Barbul.A.，Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003))仍然是血漿精氨酸水平的基本決定因素。約50%攝入的精氨酸在小腸中直接利用，而剩余的釋放至門靜脈循環中。通常，攝入的精氨酸的約一半主要通過精氨酸酶迅速地轉變為鳥氨酸(Modolell, M.等，Eur.J.1mmunol.25:1101-1104(1995) ; Witte, M.B.和 Barbu 1.A.，WoundRep.Reg.11:419-423(2003))。鳥氨酸，依次地，可被代謝為谷氨酸和脯氨酸，或通過酶鳥氨酸脫羧酶轉變為聚胺(Boutard, V.等，J.1mmunol.155:2077-2084 (1995))。剩余的精氨酸被四種其它酶之一加工:一氧化氮合成酶(以變為一氧化氮)，精氨酸:甘氨酸脒基轉移酶(以變成肌氨酸)，精氨酸脫羧酶(以變成胍丁胺)，或精氨酰-tRNA合成酶(以變成精氨酰-tRNA，一種蛋白合成的前體)(Vodovotz，Y.等，J.Exp.Med.178:605-613(1993))。
[0052]精氨酸對人和動物的內分泌功能具有顯著的效應，特別是對腎上腺和垂體分泌功能。然而，關于精氨酸發揮這些效應的確切機制了解很少。精氨酸是一氧化氮(NO)的生物前體，一氧化氮是參與心血管系統中多種內皮依賴性生理效應的內源性信使分子(Witte1M.B.和 Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003)) ? 因此，精氨酸的許多臨床作用被認為是通過其對內皮源性舒張因子的作用來介導的。NO-合成酶具有兩種變異體(Rohdewald, P.和Ferrari V.,專利申請US2004137081 (2004));具有其亞型的組成型變異體(cNOS) ;eN0S(在血管內皮細胞襯里)和nNOS(在神經元中)，和在巨噬細胞、白細胞、成纖維細胞、內皮細胞和角質形成細胞中發現的誘導型變異體(iNOS)。NO的功能可以隨著其細胞來源的不同而不同；成纖維細胞NO支持膠原合成，而內皮細胞NO影響血管發生，和巨噬細胞 NO 抑制細菌生長(Rohdewald, P.和 Ferrari V.，專利申請 US2004137081 (2004))。另一方面，精氨酸酶共用并競爭NOS的天然底物，即L-精氨酸。L-羥基精氨酸和亞硝酸鹽，分別是NO途徑的中間體和終產物，它們均為強的精氨酸酶抑制劑(Hrabak，A.等，FEBSLett.390:203-206(1996))。相反，精氨酸酶活性的終產物尿素抑制NO形成和NO依賴性過程(Witte, Μ.B.和 Barbul.A.，Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003))。
[0053]精氨酸在心血管病癥中:在眾多的臨床試驗中，證明若施用于患有心血管病癥的患者中，精氨酸是有益的(? Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002)綜述)。例如，口服補充精氨酸極大地改善了心絞痛患者的運動能力和耐力(Bednarz，B.等，Int.J.Car di ο 1.75:205-210 (2000))，并且顯著改善充血性心力衰竭(CHF)病例的血流量、動脈順應性和腎功能(ffatanabe, G.H.等，J.Hypertens.18:229-234(2000))。動物研究表明補充精氨酸的抗動脈粥樣硬化作用，包括血膽固醇過多的成人中改善的血管擴張，抑制斑塊形成，減少主動脈內膜的增厚，和血小板凝集的正常化(Nakaki，T.和Kato R.，JpnJ.Pharmacol.66:167-171 (1994))。此外，早期提供精氨酸在大鼠和人中改善高血壓，預防腎衰竭(Sanders, P.W.，Am.J.Kidney Dis.28:775-782 (1996))，和提高高血壓患者對諸如依那普利的藥物的反應(Pezza, V.等，Am.J.Hypertens.11:1267-1270(1998))。另外,精氨酸顯著地改善間歇性跛行(Boger, R.H.等，J.Am.Coll.Cardiol.32:1336-1344 (1998))，和先兆子癇(Roberts, J.Μ., Am.J.Kidney Dis.33:992-997 (1999))的癥狀。
[0054]精氨酸在生長激素(GH)分泌和運動表現中:生長激素負責增加肌肉生長，燃燒脂肪和維護免疫系統，然而，在人體中到30歲時其分泌開始下降(由Dean，W.和Pryor,K., Growth hormone: amino acids as GH secretagogues-a review of theliterature.(生長激素:作為GH促分泌物質的氨基酸一文獻綜述)Vit.Res.News;可在www.vrp.com處獲得(2001)綜述)。盡管機制未完全闡明，但已知精氨酸能增加GH分泌。此外，臨床醫生常規地在人中使用精氨酸輸注試驗來確定垂體對釋放GH的反應性(Penny, R.等，J.Clin.Endocrinol.29:1499-1501 (1969))。精氨酸的低劑量靜脈內(IV)攝入引起血清精氨酸的52%升高和血清GH水平的顯著增加。另一方面，口服精氨酸，不像IV精氨酸，被認為對于增加GH分泌是無效的(Marcell,T.J.等，J.Gerontol.54:395-399 (1999))，而口服高劑量的精氨酸天冬氨酸被認為僅在晚上充當生長激素促分泌物(Besset，A.等，ActaEndocrinol.99:18-23 (1982))。在魚類中，精氨酸是必需氨基酸，因此，飲食精氨酸對于最適生長和有效的飼料利用是必不可少的，并且其缺乏導致生長速率減慢，免疫應答低下和死亡率增加(Ahmed, 1.和 Khan, M.A.，Aquacult.Nutr.10:217-225 (2004))。
[0055]精氨酸在創傷、燒傷、危重創傷和老年性癡呆中:由于精氨酸通過產生一氧化氮密切地參與細胞信號傳導中，和通過其代謝為鳥氨酸和其它聚胺而與細胞增殖相關，因此大量的研究顯示其補充對于愈合是必不可少的。此作用不依賴于給藥途徑，并且推測與膠原、NO、鳥氨酸和聚胺的合成途徑相關(Witte1M.B.和Barbul.A.，Wound Rep.Reg.11:419-423(2003))。 [0056]膠原合成對于瘢痕形成是必不可少的，而瘢痕形成是大多數哺乳動物愈合的基礎。飼以無精氨酸飲食的大鼠顯示傷口愈合不良而飼以富精氨酸飲食的人和動物具有改善的膠原沉積和傷口斷裂強度(Barbul，A.等，Surgeryl08:331-336 (1990))。由于iNOS抑制劑減少膠原沉積并且延緩切開傷口的愈合，而在補充精氨酸后在傷口液體中發現較高水平的NO代謝物，推測精氨酸對膠原合成的作用部分地經由NO合成介導，(Murrell,G.A.C.等，Inflamm.Res.46:19-27 (1997) ; Schaffer, M.R.等，Eur.J.Surg.165: 262-267 (1999))。NO對傷口愈合的作用甚至被認為是全身性介導的(Witte, Μ.B.和Barbu1.A.，WoundRep.Reg.11:419-423(2003))，這是由于:1)無精氨酸營養不僅在傷口部位而且在幾個器官中抑制誘導的NO合成；2)NO介導炎癥誘導的水腫并抑制細胞浸潤至肉芽腫中；3)由于eNOS敲除小鼠也顯示愈合不良，NO對傷口愈合的作用不僅是iNOS-介導的；和4) iNOS抑制劑在高濃度下具有高致死率。另外，傷口收縮很大程度上歸因于開放性傷口的閉合，而iNOS抑制延緩切開傷口的閉合(Stallmeyer, B.等，J.1nvest.Dermatol.113:1090-1098(1999))并且iNOS敲除小鼠顯示切開傷口的閉合延緩，其可通過用 iNOS-cDNA 轉染來逆轉(Yamasaki, K.等，J.Clin.Invest.101:967-971(1998))。所有這些數據使人相信精氨酸經NOS的代謝是精氨酸對愈合的積極作用所必不可少的(Shi，H.P.等，Surgeryl28:374-378 (2000))。
[0057]精氨酸酶的誘導或過度表達，其是聚胺生物合成的第一個步驟，增強內皮細胞增殖(Wei, L.H.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:9260-9264 (2001) ; Witte, Μ.B.和Barbu1.A., Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003)) ?精氨酸還已知通過刺激宿主和傷口 T細胞應答，然后T細胞應答增加成纖維細胞反應，從而增強傷口愈合(Barbui，A.等，Surgeryl08: 331-336 (1990))。在健康人體中，精氨酸增強外周血淋巴細胞的有絲分裂活性并且極大地減少淋巴細胞轉化的創傷后損害(Daly，J.M.等，Ann.Surg.208:512-23(1988))。精氨酸已經顯示對于骨髓淋巴細胞分化是必不可少的。由于T淋巴細胞對于正常傷口愈合是必不可少的，因此清除T細胞的小鼠和大鼠具有顯著的傷口愈合不良。其它研究顯示補充精氨酸對傷口愈合的有益作用類似于向創傷的動物或燒傷的兒童施用 GH 的作用(Jorgensen, P.H 和 Andreassen, T.T., ActaChir.Scand.154:623-626(1988) ; Herndon, D.N.等，Ann.Surg.212:424-9 (1990))，這是因為精氨酸對垂體和胰腺的熟知的高促分泌活性。這通過對切除垂體的動物的試驗來證實，在該試驗中精氨酸不影響傷口愈合(Wei, L.H.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA98:9260-9264 (2001) ; Witte, Μ.B.和Barbu1.A., Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003))。
[0058]Seifter, E.等，Surgery84:224-230 (1978)顯示精氨酸在創傷后的情形中變得很重要；接受較小創傷的精氨酸缺陷大鼠顯示顯著較多的體重減輕和死亡率。燒傷損傷也顯著地增加精氨酸氧化和其儲備的波動。經常使用的全胃腸外營養(TPN)增加精氨酸至鳥氨酸的轉化并成正比地增加不可逆的精氨酸氧化。增加的精氨酸氧化，結合以有限的重新合成，使精氨酸在接受TPN的嚴重燒傷患者中條件性必需的(Yu，Y.M.等，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.280:E509_E517 (2001))。幾個其它研究證明精氨酸縮短住院期，減少獲得性感染，減少燒傷和創傷患者中的免疫損害(Appleton, J.，Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))，以及減少患有老年癡呆癥的老年患者中的脂質過氧化(Ohtsuka, Y.和 NakayaJ., Am. J.Med.1:108-439 (2000))。這些大量的觀察結果，結合相對的安全性，使得精氨酸在創傷、燒傷或危重患者的護理中的應用中變得非常有吸引力(Witte, Μ.B.和 Barbu1.A.，Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003))。
[0059]精氨酸在免疫調節和癌癥中:精氨酸是有效的免疫調節劑，并且顯示在分解代謝狀態下諸如膿毒癥和術后應激中具有有益的作用(Evoy，D.等Nutritionl4:611-617(1998) ; Appleton, J.,Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。精氨酸還在患有 HIV/AIDS 的個體中是有益的。谷氨酰胺、精氨酸和HMB(丁酸羥甲酯)的組合預防患有AIDS的個體中的瘦體質體重減輕(Swanson, B., Nutritionl8:688-690 (2002))。動物和人體試驗顯示大劑量的精氨酸可以干擾腫瘤誘發并且短期補充大劑量精氨酸有助于維持化療期間的免疫功能(Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。
[0060] 精氨酸在糖尿病和胰島素抵抗中:在患有糖尿病(DM)的人和動物中觀察到降低的血漿精氨酸水平和內皮依賴性舒張受損。推測其原因可能是內皮NO缺乏。因此，補充精氨酸被認為能改善這些狀況；在I型DM患者中IV精氨酸降低血壓和減少血小板聚集(Giugliano, D.等，Am.J.Physiol.273:E606_E612 (1997))，而在肥胖癥和 2 型 DM 患者以及健康受試者中低劑量IV精氨酸改善胰島素敏感性(Wascher，T.C.等，Eur.J.Clin.1nvest.27:690-695 (1997))。精氨酸還可以抵抗脂質過氧化，并且因此減少DM的微血管長期并發癥。此外，雙盲試驗顯示口服補充精氨酸顯著地改善2型DM患者中外周和肝臟的胰島素敏感性(Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。
[0061]精氨酸在胃腸病癥中:在初步研究中，精氨酸對NO、胃泌素和聚胺的作用與加速潰瘍愈合有關，該作用發揮其充血、血管生成和促生長效應(Brzozowski，T.，J.Gastroenterol.32:442-452 (1997))。另外，NO在胃腸運動的調節中具有重要作用。口服補充精氨酸顯著地降低食管動力障礙患者中胸痛發作的頻率和強度(Appleton，J., Altern.Med.Rev.7:512-522(2002)) 0同樣，L-精氨酸-NO途徑參與膽囊運動和攝入L-精氨酸增加的飲食節制和殘余膽囊體積的調節(Luiking, Y.C.等，Am.J.Physiol.274:984-991 (1998))。
[0062]精氨酸在生殖泌尿病癥中:在美國進行的觀察(1999)指出年齡為18~59歲的31%男性和43%女性具有不同程度的性功能障礙(Christianson, D.ff., Ace.Chem.Res.38:191-201(2005))。此問題可以具有生理原因或心理原因，或兩者皆有。在男性中，性功能障礙被簡單地描述為勃起功能障礙(陽痿或ED)，而在女性，性功能障礙分為4種主要類別:性欲減退，性高潮障礙，性交疼痛障礙和性喚起障礙(Basson，R.等，J.Urol.163:888-893 (2000))。后者被定義為不能達到或維持充分的性沖動包括陰蒂勃起和生殖器充血，其類似于男性ED，由生殖器血液循環不足所導致。這可以導致兩種性別發生支配進出海綿體的血流量的酶促反應中的生理性缺陷，海綿體是在勃起的陰莖或陰蒂中變得充血的可擴張組織的肌化腔室(Christianson, D.W., Ace.Chem.Res.38:191-201(2005))ο
[0063]特別地，陰莖勃起是涉及在中樞或外周性刺激后增加的動脈流入和限制性的靜脈流出的血液動力學過程(Musicki1B.等，Biol.R印rod.70:282-289 (2004))。由作為陰莖勃起的主要介質的內皮細胞NO合成酶(eNOS)和神經元陰莖NO合成酶(PnNOS)兩者產生的NO的參與也有大量的文獻記載。NO擴散至鄰近的靶平滑肌組織，刺激鳥苷酸環化酶產生環鳥甘酸(cGMP)導致海綿體的舒張(Ferrini1M.等，Biol.R印rod.64:974-982 (2001))。相反，當cGMP特異性磷酸二酯酶(PDEs)將cGMP水解為5’ -GMP導致平滑肌收縮時勃起結束(Firoozi, F.等，Br.J.Urol.1nt.96:164-168 (2005)) ? 因此，L-精氨酸和作用于 L-精氨酸-NO途徑的藥物作為ED治療劑是有吸引力的。此外，PDE的選擇性抑制劑如西地那非枸櫞酸鹽(f}i岢《Viagra)?)被廣泛地應用,其抑制cGMP降解并因此延長勃起。然而，西地那
非具有全身性血管舒張和降血壓作用，導致從疼痛開始的大范圍的副作用，并且可以甚至導致死亡(Cohen, J.S., Ann.Pharmac0.Ther.35:337-342 (2001))。
[0064]L-精氨酸“營養物質”經常被開發為用于男性和女性性喚起的藥物。例如，長期或補充以超生理劑量的飲食L-精氨酸分別增加大鼠(Moody等1997)和男性的海綿體內壓和勃起功能。長期補充L-精氨酸改善具有異常一氧化氮代謝的男性的ED (Zorgniotti和Lizzal994)，而在另一個對女性的研究，73.5%的測試受試者中L-精氨酸營養補充使整體性生活滿意度得到改善(Ito, T.Y.等，J.Sex Marital Ther.27:541-549 (2001))。另一方面，NOS并不是唯一影響陰莖勃起的酶，精氨酸酶共用其唯一底物精氨酸并且與NOS在男性和女性生殖器中的平滑肌組織中共表達。因此，精氨酸酶抑制可以增強性喚起所需的NO依賴性生理過程。由于許多精氨酸酶抑制劑對全身動脈血壓沒有明顯的影響，因此其成為治療性功能障礙的另一潛在靶標(Christianson, D.ff.，Acc.Chem.Res.38:191-201 (2005))。
[0065]精氨酸在不育和妊娠中:精氨酸是男性正常精子發生所必需的(Appleton, J.，Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。在 50 年前，研究者發現食以缺乏精氨酸的飲食9天的成年男性的精子計數減少90%并且不運動精子的百分比增加大約10倍(Holt, L.E.Jr.和 Albanese, A.A., Trans.Assoc.Am.Physicians58:143-156 (1944))。不育男性每天口服施用0.5g精氨酸-HCl幾周顯著地增加大多數測試患者中的精子計數和運動，并且引起成功的妊娠(Tanimura, J., Bull.0saka Med.School 13:84-89 (1967))。在其它初步試驗中已經報道了對少精液癥和受孕率的類似作用(Tanimura, J.，Bull.0sakaMed.Schooll3:84-89(1967) ;De-Aloysio, D.等，Acta Eur.Ferti1.13:133-167(1982))以及改善的生育力。然而，當基數精子計數小于1000萬個/ml時，補充精氨酸可能沒有幫助(Mroueh, A., Fertil.Steril.21:217-219(1970);Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
[0066]在一個研究 中對體外受精反應差的女性口服補充精氨酸改善卵巢反應、子宮內膜容受性和妊娠率 Battaglia, C.等，Hum.R 印 rod.14:1690-1697 (1999))。另外，在早產宮縮的女性中靜脈內精氨酸輸注(30g，在30min內)暫時性地減少子宮收縮性(Facchinetti, F.等，J.Perinat.Med.24:283-285 (1996))。來自人和動物研究的更多證據表明一氧化氮抑制妊娠期間的子宮收縮性并且可能有助于和由此拮抗早產陣痛和分娩(Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。
[0067]在間質性膀胱炎患者(IC)中，在6個月內口服精氨酸顯著地減少排尿不適、腹痛和/或陰道/尿道疼痛。晝夜尿頻也顯著減少(Smith, S.D.等，J.Urol.158:703-708(1997) ; Appleton, J., Altern.Med.Rev.7:512-522 (2002))。
[0068]L-賴氨酸:L_賴氨酸是必需的基礎氨基酸，其分子量為146.19g/mol，并且在生理PH下攜帶正電荷。盡管賴氨酸的D-立體異構體沒有生物活性，但L-賴氨酸是已知的用于人和動物的食品添加劑(Cynober, L.A., Metabolic and therapeutic aspects of aminoacids in clinical nutrition.(在臨床營養中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRCPress LLC, Boca Raton, USA (2003) ) 0攝入的L-賴氨酸通過主動轉運從小腸腔吸收至腸細胞。其一部分在腸細胞內代謝，剩余的經門靜脈循環轉運至肝臟參與蛋白生物合成或代謝為L-a-氨基己二酸半醛，后者進一步代謝為乙酰乙酰CoA。在肝臟中不代謝的L-賴氨酸被轉運至機體的各個組織(Cynober, L.A.，Metabolic and therapeutic aspects of aminoacids in clinical nutrition.(在臨床營養中氨基酸的代謝和治療狀況)，第二版，CRCPress LLC, Boca Raton, USA(2003))。
[0069]賴氨酸具有許多功能。它作為糖原、葡萄糖和脂質的前體起作用，或其直接用于產生能量。它在肌肉中濃集，促進骨生長并且增加膠原的形成(Voet，D.和Voet，J.G., Biochemistry.(生物化學)，第三版，JohnWiley and Sons Inc., New York(2004))。膠原是結締組織(見前)、皮膚、軟骨和骨的基礎基質。賴氨酸缺乏可能促進生長減緩和免疫力下降，精子健康受損，以及尿鈣增加。后一事實表明充足的賴氨酸可以有助于通過鈣的更好吸收和沉積來預防骨質疏松癥(Flodin, N.ff.，J.Am.Coll.Nutr.16:7-21 (1997))。當一些研究顯示L-賴氨酸可以降低單純皰疹感染的復發率和刺激生長激素分泌時，它作為一種營養補充劑得到普及(見下)。
[0070]推薦的劑量、副作用和禁忌癥:上面討論的氨基酸的補充劑量變化很大，取決于待治療的病癥。然而，對于普通人必需氨基酸賴氨酸的正常飲食需求估計為每天0.75~Ig,以避免缺乏的問題。在臨床研究中使用的精氨酸劑量變化相當大，從用于少精液癥的少至每天0.5g至用于癌癥、先兆子癇和早產宮縮的多至每天30g。對于本文各處中討論的氨基酸的補充尚未報道有顯著的不良反應。然而，提及的臨床應用中的許多需要更多的對照以及長期研究來證實。本文僅概述了對這些氨基酸的作用的肯定報道，而也存在相反的報道，其中這些作用中的許多可能沒有被證實(對于完全的綜述參見Flodin，N.ff.，J.Am.Coll.Nutr.16:7-21(1997) ; Appleton, J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002);以及Dean, ff.和 Pryor, K.，Growth hormone: amino acids as GH secretagogues-a review ofthe literature.(生長激素:作為GH促分泌物質的氨基酸一文獻綜述)Vit.Res.News;可在 www.vrp.com 處獲得(2001))。
[0071]二肽和天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸在臨床治療中:天冬氨酸和精氨酸有利地作為二肽或以混合物一起施用以對兩種氨基酸提供更高的生物利用度，并且因此以較低的劑量增加它們的功效。在幾個對不同生理功能障礙的治療的研究中研究了兩種氨基酸的給藥。通常，對于上述用于游離氨基酸的所有應用，兩種氨基酸均可以以二肽形式施用。盡管下面的章節進行了概述，但報道的研究結果專門針對聯合的給藥形式。這些報道來源于關于傷口愈合、關于內分泌病癥如GH分泌障礙和提高運動能力，或關于生殖泌尿系病癥包括勃起功能障礙以及男性和女性不育的研究。
[0072]精氨酸-天冬氨酸于1965年第一次針對身體虛弱和神經衰弱進行了臨床試驗(Duruy, A.Baujat, J.P., Vie.Med.1nt.9:1589(1965))并且后來證實了積極作用(Duruy, A.，Med.1nt.1:203(1966))。其它研究顯示精氨酸-天冬氨酸的長期給藥改善需氧能量代謝和能力(Sellier, J., Rev.Med.Toulouse5:879 (1979) ; Schmid, P.等，LeistungssportlO:486-495 (1980))。精氨酸_天冬氨酸補充增強傷P愈合和T細胞的免疫功能(Barbui, A.等，Surgeryl08:331-336 (1990))。關于運動能力也報道了其它積極作用；例如關于脂質代謝，其中精氨酸攝入僅2周就引起總膽固醇濃度下降(Hurson, M.等，J.Parenter.Enteral Nutr.19:227-230 (1995))。因此，L-精氨酸-L-天
冬氨酸(Sargenor?)廣泛地被運動員和患者使用以增加訓練效果以及運動耐量。在此
領域已經報道了對耐力表現的令人驚奇的效果，在延長攝入L-精氨酸-L-天冬氨酸后導致亞極量運動期間的降低的血乳酸鹽濃度和心率以及隨著工作負荷量增加而增加的耗氧量(Schmid, P.等，LeistungssportlO:486-495 (1980);Sellier, J.，Rev.Med.Toulouse5:879 (1979) ; Burtscher, Μ.等，J.Sports.Sc1.Med.4:314-322 (2005))。
[0073]健康的老年人志愿者飲食補充30g/d精氨酸天冬氨酸2周顯著地增加了傷口膠原積累(ffitte,M.B.和 Barbul.A.,Wound Rep.Reg.11:419-423 (2003)) ? 當向 5 名年齡為20~35歲的健康受試者口服施用250mg/kg/天精氨酸天冬氨酸7天，在慢波睡眠期間出現 GH 增加 60%(Besset, A.等，Acta Endocrinol.99:18-23 (1982))。另一組研究人員在米用一次大劑量(37.5g) 口服精氨酸天冬氨酸治療12名正常成人后獲得了有效的結果，該治療引起小但顯著的血清hGH的釋放(Elsairl987)。這使得健身者對精氨酸天冬氨酸產生興趣，希望能夠利用 hGH 的合成代謝特性(Macintyre, J.G., Sports Med.4:129-142 (1987))。
[0074]還報道了在一些類型癌癥的治療中口服施用L-精氨酸-L-天冬氨酸誘導了積極作用。例如，其在小鼠中誘導對涎腺腺樣囊性癌的抗轉移作用，伴有肺轉移灶形成受抑制和存活延長。此外體外和體內試驗證實了這些結果(Li, F.等，Chin.J.Stomatol.36:464-466(2001) ;Li,F.等，Chin.J.Stomatol.37:87-89 (2002) ; Appleton, J.,Altern.Med.Rev.7:512-522(2002))。
[0075]在牙齒健康領域，牙菌斑，其為牙齒表面上緊密附著的海綿狀有機物質，發現在其基質內接納一定尺寸 和形狀的肽類。此外，2~4個單元的肽類，其中一個或多個是精氨酸，顯示保存在牙菌斑內避免被稀釋并且有效地將口 PH恢復至無齲水平(6.1或更高)。還顯示這些寡聚體甚至當與碳水化合物同時提供時仍然有效。這表明這樣的肽可以包含在常見的牙用產品諸如牙膏和口香糖中(Kleinberg，1.，美國專利申請4225579 (1980))。
[0076]L-精氨酸-L-天冬氨酸也應用治療生殖泌尿系功能障礙。ED常見于年齡為45~70歲的男性中，25%患有中度勃起功能障礙，且10%患有嚴重勃起功能障礙(Kernohan，A.F.B.等，Br.J.Clin.Pharmacol.59:85-93 (2004)) ? 近年來，“L_ 精氨酰天冬氨酸”用作用于治療男性ED的幾種藥物的成分，這些藥物諸如Prelox? (Lamm, S.等，Eur.Bull.DrugRes.11:29-37(2003))。關于Prelox--的成分的臨床研究顯示在患有ED的40名男性中在接受3次劑量的單獨lg “L-精氨酰天冬氨酸”(Sargenor?)(每天1.7g精氨酸)，或
與Pycnogenoi'於(刺激NOS分泌)一起使用，分別在5%和92%的上述男性中改善了勃起功能(Stanislavov, R.和 Nikolova, V.，J.Sex Marit.Ther.29:207-213 (2003))。在長期研究中，年齡在45和60歲之間的50名患有ED、精液量較低、精子運動減少和精子形態學異常的男性首先用Sargenor?單獨治療I個月。這些男性中的10%體驗到正常
勃起。在治療中加入Pycnogenol?持續第二個月后，具有正常勃起的男性的百分比增
加至80%。該治療持續I年的時間，期間精子質量顯著改善，并且42%的夫婦實現了妊娠(Stanislavov, R.和 Nikolova, V., Int.J.1mpot.Res.14(4): S65 (2002) ; Lamm, S.等，Eur.Bull.Drug Res.11:29-37 (2003))。后一觀察結果證實了先前對精氨酸-天冬氨酸的應用的研究，其中補充幾個月增加了精子計數和質量(Tanimura, J.，Bull.0saka Med.School13:84-89(1967);Schellen, T.M.和 Declerq, J.A., Dermatol.Monatsschr.164:578-80(1978) ;De-Aloysio, D.等，Acta Eur.Fertil.13:133-167(1982))和改善的生育力(Schacter, A.等，J.Urol.110:311-13 (1973) ; Schacter, Α.等，Int.J.Gynaecol.0bstet.11:206-209(1973))。
[0077]由于此二肽不能大量獲得，關于由天冬氨酸和賴氨酸組成的二肽的臨床報道幾乎不存在。然而，賴氨酸的此二肽形式可以在已知用于游離賴氨酸或其鹽的應用領域中(見前)，在具有賴氨酸轉運蛋白遺傳缺陷的人中，或簡單地作為食品添加劑是有效的，對于人和動物其具有比游離賴氨酸更高的生物利用度。
[0078]精氨酸和賴氨酸協同地作用以釋放生長激素(GH) (Suminski，R.R.等，Int.J.Sport Nutr.7:48-60(1997))并且它們的濃度在人和動物營養中非常重要(Ahmed, 1.和 Khan, Μ.A.,Aquacult.Nutr.10:217-225(2004))。低賴氨酸:精氨酸比具有降低膽固醇的作用(Sanchez, A.等，Nutr.38:229-238 (1998))，并且因此，提出了用于心血管疾病患者的Arg: Lys比為至少5.5: I的蛋白混合物的專利(Radha, C.等，專利申請7091001 (2006)) ο相反，由于單純皰疹病毒的蛋白富含L-精氨酸，因此飲食中的高賴氨酸/精氨酸比已知有助于減少病毒復制，減少愈合時間，和爆發流行期間的致細胞病變性(Griffith, R.S.等，Dermatological56 (5): 257-267 (1978))。因此，在皰疹預防和治療中，避免富含精氨酸的食物和使用更多富含賴氨酸的食物認為是有幫助的。
[0079]最近的研究已經提出在刺激hGH時共同使用L-賴氨酸和L-精氨酸的治療是有用的并且可能甚至好于精氨酸/鳥氨酸組合，并且因此改善肌肉增長、體重增加和免疫支持。在年齡為15~20歲的15名健康男性受試者中，1.2g精氨酸焦谷氨酸結合L-賴氨酸鹽酸鹽在消耗該氨基酸混合物后使H水平顯著地升高2~8倍(Isidori，A.等，Curr.Med.Res.0pin.7:475-481(1981))。另一研究指出在休息狀態下攝入1.5g精氨酸和1.5g賴氨酸引起 GH 分泌的急劇增加(Suminski, R.R.等，Int.J.Sport Nutr.7:48-60 (1997))。
[0080]為了模擬消化道內的自然條件，制備的腸“液”用作含有CGP的厭氧Hungate試管中的培養液并用作營養補充物。在所有試管中CGP的完全降解指示CGP可以容易地在這樣的類似于消化道的厭氧環境中被降解。這還通過短降解期來證實，該短降解期類似于以前對于專性和兼性厭氧CGP降解細菌所觀察到的現象(0bst，M.等，Appl.Environ.Microbio`1.71:3642-3652 (2005) ; Sallam, A.等，已投稿待發表(2008))。
[0081]在此研究中，并且第一次證明了 CGP降解細菌在動物、禽類和魚類消化道中的廣泛分布(表1，2)。先前關于環境樣品的研究還顯示了在純化步驟期間觀察到的CGP降解集落之間和后來所得的純性培養物之間的形態學多樣性，這顯示了 CGP降解者在原核動物中的廣泛分布(表2)。另一方面，降解CGP的能力似乎更多地分布在特定屬的種間；迄今關于細胞外CGP降解的研究顯示CGP降解者在假單胞菌屬和芽孢桿菌屬間廣泛分布(Obst，Μ.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105 (2002) ; Obst, Μ.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004) ; Sallam, A.等，已投稿待發表(2008)，本研究)。然而，這可能與應用的實驗室條件有關，這些條件可能已經有利于這些細菌，或簡單地因為這些細菌屬在自然界中的超優勢度。另外，許多CGP降解細菌，不像假單胞菌屬和芽孢桿菌屬的菌株，在不喪失降解CGP的能力的條件下非常難以得到無污染的培養物(0bst，M.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005);Krug, A., Diplom thesis,Institut fur Molekulare Mikrobiologie undBiotechnologie, Westfalische ffilhelms-Universitat, Munster, Germany (2001))并且通常被忽視。[0082]在厭氧條件下對于純性培養物僅觀察到部分CGP降解，并且46個菌株中僅8株厭氧性地降解CGP。對此似乎合理的原因是在這些菌株和其它菌株之間缺少如在它們的天然環境中那樣的天然相互作用，這分別經常導致限制性的或必需物質的積累或消耗。這與以前對專性厭氧內生孢子生產株香港互營單胞菌KI株的觀察結果相吻合，在其共分離物無丙二酸檸檬酸桿菌(Citrobacter amalonaticus) G株的存在下該菌株的生長和CGP利用極大地提高(Obst, M.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005))。
[0083]在8種已鑒定的分離物中，7個菌株顯示厭氧性降解CGP的能力，盡管它們術語已知為需氧的屬如芽孢桿菌屬或假單胞菌屬。然而，枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的菌株已知厭氧地生長，并且一些已知還原硝酸鹽(Glaser, P.等，J.Bacteriol.177:1112-1115(1995))。同樣，假單胞菌屬成員的厭氧生長和硝酸鹽還原作用被充分地研究(Sallam，A.等，已投稿待發表(2008))。小單孢菌屬、鏈霉菌數和短芽孢桿菌屬的種還已知是兼性厭氧的(Cochrane, V.ff., Annu.Rev.Microbiol.15:1-26 (1961);Borodina, 1.等，Genome Res.15: 820-829 (2005) ; Baek, S.H.等，Int.J.Syst.Evol.Microbiol.56:2665-2669(2006))。通常，近年來對CGP降解的研究針對CGP降解細菌在兼性厭氧菌間的廣泛分布。 [0084]盡管CGP和其二肽是天然來源的簡單的蛋白物質，但需要臨床研究來將這些物質推向市場。CGP降解細菌在本研究中測試的哺乳動物、禽類或魚類的腸道菌叢中的廣泛分布提供了第一個證據，即，口服使用CGP將是快速的，并且至少容易被微生物降解。這些細菌從不同動物和鳥類的下消化道中的分離(表1)顯示，如果CGP的消化在上消化道中沒有完成，則其可能在下消化道中繼續進行。
[0085]HPLC分析揭示了二肽是所有62株分離物的CGP降解產物。從CGP沒有產生更高級的二肽寡聚體如(β-Asp-Arg)2四肽。這與來自病鱔假單胞菌BI株(Obst, Μ.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105(2002)、香港互營單胞菌 KI 株(Obst, M.等，Appl.Environ.Microbiol.71:3642-3652 (2005))和產堿假單胞菌DIPl株(Sallam, A.等，已投稿待發表(2008))的CGP酶的作用相吻合。螺旋藻的營養和治療作用已經已知了幾個世紀，并且迄今其在許多國家中作為食品消費。螺旋藻的蛋白含量已知達到60%以上(Narasimha，D.L.R.等，J.Sc1.Food Agric.33:456-460(1982))。在鈍頂螺旋藻的市售產品中CGP的存在指示CGP可能參與了定期服用螺旋藻的健康作用。然而，在被分析的樣品中測定的CGP含量變化很大，并且相對很低。這與先前對藍細菌中的CGP積累的研究一致，其中CGP的積累已知受到許多因素的影響，并且相應地發生變化(Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005)) ο而且，市售的螺旋藻產品在其獲得商業化許可之前一定已經經過了大量的臨床和毒性試驗。這顯示提取的CGP和CGP- 二肽如果經口攝入將不會誘發毒性作用。此外，CGP 二肽通常被細菌攝取并利用于生長，并且在靶向研究(數據未顯示)期間顯示沒有抑菌或殺菌作用。通常，螺旋藻的已知作用和應用非常類似于對精氨酸所證明的那些作用，表明這些作用的一部分可能實際上是由其精氨酸含量(約6%)所引起的，包括CGP的作用。
[0086]細菌具有三種肽轉運系統，兩種屬于ABC(ATP_結合盒)轉運蛋白的大家族，寡肽透膜酶(Opp)和二肽透膜酶(Dpp)，和用于二肽和三肽的一種屬于PTR(肽轉運蛋白)家族。僅后一系統在從酵母開始的高級真核生物中是保守的(Daniel，H.等，Physiology21:93-102 (2006))。在哺乳動物中，用于二肽和三肽的載體系統PEPT (SLC15家族)包括2種變異體；腸PEPTl (SLC15A1)和腎亞型PEPT2 (SLC15A2)。它們以立體選擇性的方式轉運幾乎所有可能的二肽和三肽，對于L-α氨基酸和它們的衍生物是優先的。含僅D-氨基酸或四個以上氨基酸的肽不被接受。因為PEPTl在整個小腸中具有顯著的表達，并且由于其高轉運能力，PEPTl的所有藥物底物具有優異的口服利用度，因此，PEPTl已經成為了藥物遞送的主要靶標(Daniel, H.等，Physiology21:93-102 (2006))。CGP 二肽、Asp-Arg和Asp-Lys (重組CGP)的構成性L-氨基酸經α - β肽鍵連接。此類型的鍵和CGP二肽的立體結構強力地提示它們可以充當PEPT系統的底物，并且當它們被攝入時可以從哺乳動物腸腔轉運。因此，CGP和/或其二肽的應用將是用于構成性氨基酸作為治療和/或營養劑的口服給藥的理想方式。[0087]從幾個世紀前便已知氨基酸的營養和臨床價值，包括構成CGP的那些氨基酸諸如天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸以及仍然可以結合至其結構中的那些如瓜氨酸、鳥氨酸、刀豆氨酸或谷氨酸。這些氨基酸的合成寡聚體組合證明比游離氨基酸更高的生物利用度并且因此經常在營養和治療中進行研究和應用(見前)。CGP代表了這些寡聚體的理想天然來源，預期其可以在比其游離形式的構成性氨基酸更低的劑量下更為有效。因此，CGP和其二肽的吸收、安全性和作用目前正在研究當中。而且，關于將其它氨基酸結合在CGP中的研究顯示了有效的結果(數據未顯示)。得到的二肽可以應用于幾個治療領域中，例如，天冬氨酸-鳥氨酸用于治療肝臟疾病(Kircheis，G.等，!fepatology25:1351-1360 (1997))。因此，未來對CGP結構的任何改變將增加CGP 二肽的范圍并且隨之擴展其作為治療和/或營養補充劑的應用范圍。
[0088]對于從藻青素(CGP)大規模制備β - 二肽建立了三階段方法。階段I基于用于從生物質工藝分離CGP的優化的酸提取法，獲得總計704g純CGP，并且在結構上該CGP含有天冬氨酸、精氨酸和少量的賴氨酸。階段II是細胞外CGP酶(CphE)的發酵制備，該酶從產堿假單胞菌DIPl株中以5001規模并且使用Ig/檸檬酸鹽作為唯一底物制備，獲得17.5g粗制蛋白粉末，并且該蛋白顯示對CGP的高降解活性。階段III包括經CphE降解CGP，250g CGP降解為β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸二肽，純度級別超過99%(TLC，HPLC)。階段III的總效率為91%，同時回收了 78%(wt/wt)的使用的CphE粉末，并且該粉末顯示對CGP的持久活性。建立的方法取決于根據工業標準的原料和設備，并且對于每一種所需的規模均適用。
[0089]產堿假單胞菌的菌株，包括DIPl株，已知生長在大范圍的底物上，并且需要量其極微量。這些菌株的高酶生產率也是其應用于細胞外脂肪酶的發酵制備中的主要原因(W095/30744;Gerritse, G.等，Appl.Environ.Microbiol.64:2644-2651 (1998) ;Moore, E.R.B.等Mai 1999.Pseudomonas:Nonmedical.(假單胞菌屬:非醫學)見 Moore 等(編輯)，TheProkaryotes:An Evolving Electronic Resource for the Microbiological Community,(原核生物:微生物群體的進化電子資源)第三版，release3.0，Springer-Verlagj NewYork)) ο除了來自DIPl株的CGP酶的高穩定性和活性以外(Sallam，A.和A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation of cyanophycin by thedenitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strain DIPl-Role of other threeco-1solates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細菌產減假單胞菌 DIPl 株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發表)，這些特性是考慮此菌株理想地用于設計的工藝方法的主要因素。
[0090]在建立最終的三階段方法之前，進行了幾個試驗通過直接在CGP上培養DIPl株以達到相同的目標，然而，由于CGP- 二肽被正在生長的細胞快速消耗，該策略不太有效，在該三階段方法的規定步驟中避免了此問題，在該三階段方法中去除了 DIPl株的細胞。此外，通過直接培養獲得的二肽溶液具有大的體積，并且因此難以處置，在得到的二肽溶液中還存在小蛋白和鹽類，作為該策略的另一缺點。相反，通過三階段方法CGP的降解濃度以及降解時間是完全可以控制的。因此，獲得的二肽溶液限于小且容易處置的體積。最高的測試濃度(50g/l)是各個方面之一，其仍可以為未來應用而進行優化，使得該方法更為經濟有效。
[0091]對于工藝方法經濟因素通常是最重要的，因此在培養基優化和底物利用中獲得的結果發現是令人滿意的，檸檬酸鹽是工藝數量級時的廉價底物，并且理想地作為唯一底物用于應用的菌株，其已經應用于細胞外脂肪酶的發酵制備中(Gerritse，G.等，Appl.Environ.Microbiol.64:2644-2651 (1998))，然而，對于粗制 CphE 的制備階段(階段 II)需要優化的培養基，使得必需準確地監測發酵期間的濁度等級，尤其是在誘導和降解階段期間。以前試驗性CGP降解的經驗顯示不透明的培養基以及細胞的強力生長可能會令人誤解，除此之外，較好的細胞生長實質上不意味細胞外CGP酶的較高產量(未發表的數據)。
[0092]Frey, K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002)的 CGP 酸提取法在以前的研究中被成功地應用，該方法被優化以適用于從任何工藝量的生物質中分離純CGP。對原始方法的最有效的改變是溶解的CGP的無菌過濾步驟，此步驟保證完全去除不溶于稀HCl的任何細胞碎片。相反，增加的使用稀酸和水的純化步驟可能不必要地增加CGP的損失，這就解釋了獲得的CGP和預測量之間的差異。CGP的損失以及其提取所需的時間可以通過將CGP離心代替將其置于4°C而最小化。
[0093]備選地，如果應用有效的設備諸如錯流，則此提取法的總生產率可以大幅度增加，在此情況下，需要具有兩種不 同的COP的2個盒；一個比待分離的CGP的分子大小大，而另一個比該大小小，這兩個盒被應用于分別交替地過濾溶解和沉淀狀態下的CGP。然而，這樣的超濾盒的相對高的價格和然而有限的壽命使其應用成為一個成本的問題。在粗制CphE的發酵制備(階段II)期間，在靜止生長期內采用CGP的誘導以保證CphE的最大制備，并且僅僅參考培養基中CGP量的濁度變化。
[0094]培養基的pH增加超過耐受范圍(pH6.9~7.5)并且通過加入HCl來控制，這最可能的原因是產堿假單胞菌DIPl株的細胞釋放氨的緣故。類似的生理行為也在以前關于 CGP 降解的研究中對此菌株提及(Sallam, A.和 A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic andaerobic degradation of cyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonasalcaligenes strain DIPl-Role of other three co—isolates in the mixed bacterialconsortium.(反硝化細菌產堿假單胞菌DIPl株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發表)。
[0095]在不同的測試過濾系統之前和之后，得到的CGP- 二肽純度等級相同的原因顯然是初始二肽溶液中開始就沒有雜質。這顯示與使用細菌細胞直接培養的策略相比，應用確定的酶法過程的另一優點。另一方面，由于過濾造成的二肽的定量損失是預期的并且可惜是無法避免的；已知有幾種一般因素會導致這樣的損失，包括；過濾材料，截留點，和/或被過濾的物質本身的特性。這還解釋了降解階段(階段III)期間9%CGP和22%粗制CphE的損失。除此之外，僅測試了新的濾膜(0.5~IOkDa.COPs)，并且因此CGP- 二肽的損失量最可能附著在膜表面上直至飽和。
[0096]即便91%的總過程產率是十分高的，幾個方面可以甚至進一步改進，并且均在優化之中，這些方面包括粗制CphE的較高生產率，對CphE的可能工藝純化策略和用于降解階段的更有效的條件(未發表的數據)。CGP-二肽的商業價值與CGP本身的生產成本直接相關，盡管，在過去幾年中，CGP的生產被廣泛地研究并且使用幾種細菌菌株進行優化，從而正在使用新的和更適合的經濟底物來實現對CGP含量的提高，這些發展似乎在商業化CGP生產的方向上快速地發展(見上)，此方式也是其它已知的細菌性聚(氨基酸)諸如聚(谷氨酸)和聚(ε -賴氨酸)被商業化以用于工藝以及食品應用所需要的(由Oppermann-SanioF.B.等，Naturwissenschaften89:11-22(2002);Obst,Μ.等，Biomacromolecules5:1166-1176(2004)綜述)。到那時，CGP- 二肽的生物醫學價值可能才事實上為CGP的實際生產成本提供均衡的關系。因此，CGP-二肽的生物醫學作用目前正在研究之中(Sallam，A.，和A.Steinbuchel.2007c.Potential of cyanophycin and its β -dipeptides as possibleadditives in therapy, food and feed industries (藻青素和其 β-二妝作為治療、食品和飼料工業中的可能添加劑的潛力))。
[0097]以前應用的用于從藻青素(CGP)大規模生產β - 二肽的生物工藝方法被優化；該原始方法由三個階段組成；階段1:從生物質中大規模提取純CGP，階段I1:從產堿假單胞菌DIPl株大規模生產粗制藻青素酶(CphEal)，階段II1:將CGP降解為其二肽。對于第二階段確定最適培養條件；2g L-1檸檬酸鹽，pH6.5和培養溫度為37°C。作為CphEal的誘導物的CGP的最適濃度為50g L-1，這是以前應用的濃度的1/5。在誘導后5h獲得最大酶濃度。相同濃度的CGP- 二肽在僅3h后顯示類似的誘導效率。然而，最適的4g F1L-天冬氨酸也誘導CphEal，其效率為CGP的1/3。CphEal經CGP上的底物特異性結合來純化。純化的酶被表征并且結果顯示是一種絲氨酸蛋白酶，在50°C和pH7~8.5時具有最大活性。對于初始方法的階段HI (CGP降解)的條件:50g F1CGP, IOgF1粗制CphEal和在30°C中孵育IOh可以優化為:100g F1CGP, IOg I-1粗制CphEal和在50°C中僅孵育4h。CGP降解為β -天冬氨酸-精氨酸和天冬氨酸-賴氨酸二肽，純度等級超過99% (HPLC)。這些優化使得該工藝方法是更成本、時間和投入有效的。
[0098]在protamylasse上以500-1規模發酵制備CGP之前，在可利用的protamylasse裝料上進行的預試驗表明對于CGP制備7%(vol/vol)是最適的,然而,在先前Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005)對以前的 protamylasse 裝料的研究中，最適濃度發現為6%(vol/vol)。這是因為protamylasse (其是工業淀粉生產的殘余化合物)是一種復雜的培養基，其組成可以在每批裝料之間發生變化，并且因此必需在作為培養基應用之前進行調節。
[0099]在發酵期間和第一個6h之后，溫度升高至37°C以便使溫度敏感的λ -抑制物(cl857)失活，并且因此能夠誘導CGP-合成酶(CphA)基因。在此時間點，重組大腸桿菌菌株細胞已經處于指數生長期中2h。此發酵過程證明對于CGP-合成酶的誘導以及對于CGP的最大細胞內積累是最適的(Frey, K.Μ.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384 (2002))。
[0100]在發酵6h后，培養基的濁度還顯示突跳(sudden jump)，自動控制的攪拌與其相平行地增加。這可以解釋為，通過除溫度升高至37°C以外，由于強力的細胞生長引起的培養基中氧的減少。顯然，培養基中的氧含量變得低于預先調節的最小值并且導致攪拌的自動增加，這引起較多地形成泡沫和氣泡，并且隨后引起失真的OD85tlnm值。人工地加入消泡乳液導致濁度快速降至正常水平。
[0101]當用顯微鏡估計達到細胞中的最大CGP積累(15h后)時，終止發酵。然而，后來對發酵樣品的分析指示較好的收獲時間為孵育13h后。在該時間點處，CGP含量為約13%(CDM的wt/wt),而在15h后，其下降至10%(CDM的wt/wt)。這種損失顯然是由于顯微鏡對CGP含量估計的不準確造成的，該方法是發酵期間僅有的可用方法。此外，CGP含量的降低最可能是由于質粒損失引起的，這種質粒損失在孵育期間隨著時間推移而發生(Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005)) ? 在提取和純化聚合物后，HPLC分析指示CGP的高純度等級，并且其由三種氨基酸組成:天冬氨酸(47.7mol%)，精氨酸(45.6mol%)和賴氨酸(6.8mol%)。SDS-PAGE顯示CGP的分子大小為25~30kDa。這些特征與以前由相同菌株在幾種培養基上產生的CGP的特征非常一致(Frey，K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.68: 3377-3384 (2002) ; Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005))。
[0102]近年來，含有Ig l-1檸檬酸鹽的簡單礦物鹽培養基(SM-培養基)被應用于從產堿假單胞菌DIPl菌株中大規模生產CphEal。此培養基是有利的，原因是其簡單和節約成本的組成以及其對使用的菌株的適合性(Sallam, A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technical production ofβ-dipeptides fromcyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產β _ 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))。然而，在此研究中，即使對生長最適的檸檬酸鹽濃度為6g l-1，在這樣的培養中也不產生0?1^^0?1^31的最大產量出現在28 l-1檸檬酸鹽上生長的培養物中；這說明該酶僅在底物的限制條件下被誘導。其它對溫度和PH最適值的試驗顯示37°C和5.5~7.5的pH范圍，最適值為6.5，對于DIPl株以及對于CphEal的生產是最適的。這提高了生產過程的效率，該生產過程最初應用在Ig l-1檸檬酸鹽上，PH7.5和孵育溫度為30°C (Sallam, A.，和 k.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for thetechnical productionof β -dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產β - 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))。
[0103]對CphEal誘導的滲入研究揭示了以前應用的CGP濃度(250mg l-1)的僅1/5 (50mgl-1)就足以達到相同的作用。在相同的濃度(50mg l-1)下CGP-二肽也足以以相同的效率誘導CphEal。然而，至收獲用二肽誘導的培養物時所需的較短孵育期(3h)顯示CGP-二肽是CphEal的實際誘導物而非CGP本身。
[0104]另外，天冬氨酸是CphEal的成功誘導物，而與CGP-二肽不同，對于最大CphEal產量需要4g l-1的濃度和更長的5h孵育期，這顯示CphEal生產效率僅為CGP或其二肽的三分之一。因此，在未來應用中選擇誘導物仍然取決于個例和成本。
[0105]原始方法的第三個階段(經粗制CphEal大規模降解CGP)發現在50°C中是非常有效的，而非在30°C中。此優化使得高得多的CGP濃度(至多達100g l-1)可容易地在為30°C中降解時間的僅四分之一的時間內降解。這是根據Van’t Hoff方程，其中溫度增加10開(10°C )，反應速率加倍。在此升高的溫度下降解混合物的體積和其污染的風險被最小化。在30°C和50°C兩種孵育溫度下，降解時間顯示隨著粗制CphEal的濃度下降和隨著CGP濃度增加而共線增加。因此，所得的公式可以有助于在未來的工藝應用中應用最適的降解參數。由于降解階段的效率在50°C中高得多，因此該公式對在50°C中的應用進行計算，并且隨后適合于至多達100g l-1的CGP濃度。
[0106]有機溶劑或硫酸銨沉淀提供弱的純化作用和低的酶回收速率。相反，通過對CGP的特異性結合開發的方法證明高度有效，并且具有使用一種底物(CGP)從粗制溶液中的其它蛋白中分離CphEal的優點。純化方法以CGP混合物降解為其二肽結束；這些同時的都是該方法的有價值的終產物，并且因此可以進一步引導至主生產物流(無原料損失)。該純化方法容易擴大規模并且如果需要結合在未來的工藝應用中。
[0107]建立兩個公式來增加原始方法的第二階段(粗制CphEal的大規模生產)和其可能的純化的效率。第一個公式(s.a.)基于CphEal的光量分析，并且能夠在粗上清液中快速測定CphEal含量。測定的CphEal濃度可以然后結合至第二個公式中以估計要結合的CGP的所需量，并且因此純化上清液中全部的CphEal含量。此方案為未來粗制CphEal的生產裝料提供了一種可信賴的手段，這些裝料在其蛋白組成方面可能極大地不同。
[0108]在用于純化CphEal的底物特異性的試驗中，不僅CGP被降解，然而，BSA也以較小的程度被降解。這顯示來自產堿假單胞菌DIPl株的CGP酶可能分別不如以前表征的來自病鱔假單胞菌BI株和巨大芽孢桿菌BAC19株的CphEpa和CphEBm特異。對此非特異性作用的更為合理的解釋是在純化的酶溶液中存在少數其它的蛋白。即使這些蛋白僅在高度濃縮的樣品和用強烈的硝酸銀染色在SDS-PAGE中可見到；僅極小量的非特異性蛋白酶就可能對CGP以外的測試物質產生這樣的作用。
[0109]來自產堿假單胞菌DIPI株的CphEal主要被絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc?和PMSF抑制。這顯示此CGP酶最可能屬于絲氨酸型蛋白酶。這與以前表征的CGP酶；CphB, CphEpa和CphEan的結果一致。此外，CphEal被色氨酸氧化劑N-溴代琥珀酰亞胺完全抑制，顯示色氨酸殘基可能參與該酶的分解代謝中。這還指出了 CphEal和細胞外CphEpa和CphEem之間的高度相似性。用亮抑酶肽或EDTA處理的CphEal樣品顯示在CGP覆層瓊脂板上沒有活性抑制，然而，對用EDTA處理的樣品的HPLC分析顯示CGP酶的抑制為約75%。這是由于在OPA衍生化期間形成了大量的沉淀物引起，而不是由于酶抑制引起的(0bst，M.等，J.Biol.Chem.277:25096-25105 (2002) ; Obst, M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004)) ο與以前表征的分別來自集胞藻屬(Synechocystissp.)PCC6803、病鱔假單胞菌BI株和巨大芽孢桿菌BAC19株的CphB，CphEpa和CphEBm相比較，在表3中說明了產堿假單胞菌DIPl株的CphEal的生化特性。盡管純化CphEal的幾種特性相對地類似于CphEpa和CphEBm，但可以觀察到一些相關的差異諸如分子大小和最適溫度。對于CphEal后者為50°C，這是對于所有已知CGP酶的最高最適溫度，并且因此，為以純凈形式以及以粗制形式應用此酶提供了極大的益處。純化的酶顯示最適pH范圍為7~8.5，最適值為8.5，該范圍偏離了對粗酶所測定的范圍(5.5~7.5，最適值為6.5)。這最可能是由于粗提取物中許多其它蛋白的存在引起的，所述粗提取物代表了復雜的環境；在這種環境內的相互作用可能反過來影響CGP酶的結構和/或性質。細胞系產堿假單胞菌DIPl于2008年6月10日保藏在DMSZ，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeglbj 38124Braunschweig, Germany，保藏號為 DSM21533。[0110]在下面的實施例進一步描述本發明，然而，這些實施例不應解釋為對本發明的限制。[0111]實施例
[0112]材料和方法
[0113]樣品采集和樣品制備:腸道菌叢樣品采集自剛處死的健康標本(表1)。除了反芻動物以外(飼養史不能確定)，所有選擇的動物，鳥類和魚類至少部分地自由生活或自由放牧。通過完全填充50ml無菌falcon試管，從每個來源動物的幾個部位(表1)以及消化道采集樣品，樣品在4°C保存備用。樣品用無菌生理鹽水稀釋(表1)，然后在無菌體檢下過濾(折紙漏斗，Schleicher&Schuell, Dassel, Germany)固體物質。排泄物樣品在無菌鹽水中切碎并如上所述過濾。
[0114]培養基:為了富集能夠在厭氧條件下降解CGP的細菌，應用下列的基礎培養基(BM) -M I 蒸餾水中 1.0g NH4Cl, 3.0g KH2PO4, 3.0g K2HPO4, 0.1g KCl, 0.5g MgCI2.6H20,
0.1g CaCl2.2H20，0.5g NaCl，0.5g半胱氨酸-HC1，0.5g酵母提取物(除非文中另外指明)，10ml SLlO微量元素溶液，和Img刃天青。pH用KOH調節至7.0。將培養基煮沸，并在加入Na2S.9H20至0.04%(wt/vol)的終濃度后，立即將其轉移至含有Formier氣體(N2:H2, 95:5%, vol/vol)的氣氛的厭氧培養室(A型-手動氣閘；Coy Inc., GrassLake, MI, USA)中。在冷卻至室溫后,將IOml等分試樣分配至Hungate試管中，密封,從厭氧培養是中取出，隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進行滅菌。厭氧培養在含有缺少還原劑半胱氨酸-HCl和Na2S.9H20的BM培養基的100ml Klett培養瓶中進行。
[0115]Luria Bertani (LB)培養基(Sambrook, J.等，Molecular cloning:aLaboratoryManual (分子克隆:實驗室指南)，第二版，Cold Spring Harbor, NY:Cold Spring HarbourLaboratory (1989))用于純化CGP降解細菌和用于維持有活力的培養物。
[0116]對于產堿假單胞菌DIPl株的分離，使用Dufresne, A.等，Macromolecules31:6426-6433 (1998)的改良礦物質培養基(SMnedium);每 I 自來水中，1.0g NH4Cl, 5.0g KH2PO4, Ig MgSO4.7H20 (滅菌并單獨地加入)和IOml微量元素儲備溶液。微量元素儲備溶液含有次氮基三乙酸(70mM，pH6.5)，FeS04.7H20(5g/I)，MnCl2.4H20 (0.85g/l)，CoCl2.6H20 (0.14g/l)，CuCl2.2H20 (0.085g/l)，H3BO3 (0.17g/I)，ZnSO4.7H20(0.9g/l),和 Na2MoO4.2H20(0.09g/l)。培養基的 pH 調節至 7.0 丙醚隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進行滅菌。
[0117]液體培養在帶有擋板的Erlenmeyer培養瓶中進行，并且在Pilotshake RC-4/6-W水平式振蕩器(Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland)上以 150rpm 孵育。為了制備 CGP 覆層瓊脂板，1.2%(wt/vol)細菌-瓊脂加入至CGP懸液(I~2g/l)中，此混合物隨后通過在121 °C中高壓滅菌20min而進行滅菌，冷卻至45°C后，將其傾倒在事先制備的SM瓊脂板上成
為薄層。
[0118]為了制備CGP覆層瓊脂板，將1.2%(wt/vol)細菌-瓊脂加入至CGP懸液(I~2g1-1)中，此混合物隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進行滅菌，冷卻至45°C后，將其傾倒在事先制備的SM瓊脂板上成為薄層。
[0119]CGP的來源和分離重組” CGP分離自富養羅爾斯通氏菌Η16-ΡΗΒ-4-Λ eda(pBBR1MCS-2::cphA6308/edaH16)的細胞(Voss, 1.等，Metabol.Eng.8:66-78 (2006))并根據改良的酸提取法純化(Frey, K.Μ.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))。CGP 根據以前對于藍細菌所述的方法分離自螺旋藻市售產品(Simon, R.D.等，Biochim.Biophys.Acta420:165-176(1976))。
[0120]為了以較大的規模分離和純化CGP,酸提取法(Frey, K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))如下進行優化；含CGP的干物質懸浮在自來水中得到0.lg/ml的終濃度。pH用濃HCl (32%)降低至I并攪拌過夜。懸液用CEPA Z61連續離心機(CEPA, Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)以 17000rpm離心，片狀沉淀物重新懸浮在201 HC10.1N中，攪拌lh，再次離心，將上清液加入至第一批裝料中，并棄去片狀沉淀物。用NaOH (50%)在301玻璃瓶中中和含CGP的上清液(pH7.3)，使得CGP沉淀。使乳狀懸液放置在4°C澄清過夜，然后棄去上清液。反復溶解CGP并中和三次以上以去除所有在稀HCl中不溶的雜質。得到的CGP溶解在301 HCL0.1N中，并通過0.2μπι Sartobran-POO型過濾裝置(Sartorius AG, Gottingen, Germany)。溶液再次用NaOH中和(ρΗ7.3),放置澄清過夜，棄去上清液。為了去除任何水溶性雜質和使CGP脫鹽，片狀沉淀物用5柱床體積的蒸餾水連續洗滌3次。最后，CGP片狀沉淀物以20000rpm離心(CEPA Z41連續離心機)，在-3CTC冷凍和在 BETA1-16 型凍干機(Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode, Germany)凍干。
[0121]CGP的滅菌:為了制備CGP的無菌儲備懸液，二乙醚以3:1 (vol/wt)的比率加入至CGP。15min后，棄去溶劑，完全蒸發后，通過將CGP溶解在無菌0.1N HCl中，然后通過加入等體積的無菌0.1N NaOH在pH7.3下將聚合物沉淀，而獲得懸浮液。備選地，CGP首先溶解在 0.1N HCl 中，通過濾器(孔徑 0.2 μ m, Millipore GmbH, Eschborn, Germany)并且最終如上所述再沉淀。通過短暫離心(3500 X g，2分鐘)沉降CGP，或通過使CGP放置在4°C沉積過夜來調節儲備溶液中CGP的濃度。在兩種情況下，然后部分棄去上清液，從而最終獲得所需濃度的CGP。在含有帶有或不帶有0.5g 1-1酵母提取物的IOml BM的厭氧制備的Hungate試管中進行厭氧CGP降解的試驗。將無菌CGP懸液直接注入至厭氧制備的BM Hungate試管中至Ig 1-1的終濃度。看到試管中CGP消失指示其降解。為了制備CGP覆層瓊脂板，將
1.2%(wt/vol)細菌-瓊脂加入至CGP懸液中，此混合物隨后通過在121°C中高壓滅菌20min而進行滅菌，冷卻至45°C后，將其傾倒在事先制備的SM瓊脂板上成為薄層。
[0122]哺乳動物、禽類和魚類腸道菌叢對CGP的厭氧性降解:為了模擬獲取菌叢樣品的生活環境的自然條件，制備的樣品用作接種物和同時用作營養補充物。含有在BM培養基(不含酵母提取物)中的Ig F1CGP的無菌厭氧Hungate試管接種至10%的終濃度，并在37 °C中孵育直至CGP降解出現。
[0123]在腸道菌叢中篩詵CGP降解細菌:為了分離CGP降解細菌，100 μ I等分試樣的已制備的菌叢樣品涂布在厭氧制備的帶有CGP覆層的BM瓊脂板上。在37°C孵育幾天期間，檢查各板中由CGP降解細菌集落導致的暈圈(halo)的出現。在孵育期間，還應用集落計數步驟以確定CGP降解細菌集落和非降解集落之間的比率。
[0124]CGP降解純性培養物的分離:選擇形態學不同的CGP降解細菌集落并通過將來自顯示降解暈的集落的物質轉移至新鮮的CGP覆層瓊脂板上進行三次連續傳代而進一步純化。在LB瓊脂板上應用另外三次純化步驟，然后在CGP覆層瓊脂板上測試純性培養物以確認它們保留了降解CGP的能力。[0125]純度對照:分離的純性培養物的純度通過顯微鏡，且還通過在不同的培養基上在厭氧以及需要條件下培養定期地確認。
[0126]分析技術:游離氨基酸和小肽(CGP- 二肽)通過反相HPLC (KontronInstruments, Neufahrn, Germany)檢測,在檢測前它們的游離氨基用鄰苯二甲醒(OPA)試劑如前所述(Aboulmagd, E.等，Arch.Microbiol.174:297-306 (2000))進行柱前衍生化。對于CGP樣品的分析，聚合物預先進行酸水解HCl, 950C ,過夜)。同樣，應用酸水解以進行二肽構成的氨基酸的定性和定量確認。HPLC系統安裝有B801柱(Pr印Nova-PakHR3.9x300) (Knauer GmbH, Berlin, Germany),并用起始洗脫液(81%, vol/vol,硝酸鈉(50mM):19%, vol/vol,甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19~75%，vol/vol)在40°C中和以l.0ml/min的流速洗脫，然后采用1046A型熒光檢測儀(HewlettPackard, Waldbronn, Germany)在330/450nm(激發/發射)下進行突光檢測。為進行校準，使用色譜純的氨基酸(來自 Serva Feinbiochemica, Heidelberg, Germany 的 KollectionAS-10)或使用通過采用產堿假單胞菌DIPl的細胞外CGP酶(CphEal)通過CGP的完全酶法水解產生的二肽(Sallam，A.等，已投稿待發表(2008))。
[0127]在將Klett-培養瓶插入至EppendorfllOlM分光光度計(Eppendorf, Hamburg, Germany)后,通過測量578nm處的池度增加監測細菌生長。
[0128]在硅膠60 板(Merck, Darmstadt, Germany)上應用薄層色譜(TLC)分析，HPLC 的起始稀釋液也用作TLC的rum緩沖液，為進行染色，應用丙酮中的20%(wt/vol)茚三酮溶液。在電泳示蹤緩沖劑(Laemmli)后在11.5%(wt/vol)凝膠中進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，U.K.，Nature227:680-685 (1970)。蛋白和藻青素用考馬斯染色法染色(Weber, K.等，J.Biol.Chem.244:4406-4412 (1969))，之后用銀染法染色(Heukeshoven, J.等，Electrophoresis6:103-112 (1985))使得較低濃度的蛋白顯現。
[0129]DNA提取和16S rRNA基因的分析:來自純性培養物的全基因組DNA的分離如前所述進行(Rao, R.N.等，Methods Enzymol.153:166-198 (1987))。16S rRNA 基因通過 PCR 從總DNA使用標準寡核苷酸引物(MWG-B10TECH AG, Ebersberg, Germany)進行擴增。PCR產物使用 Nucleo-trap CR 試劑盒(Macherey-NageI，Duren, Germany)純化,然后直接測序。DNA測序在臨床化學和實驗室醫學協會(W.W.U.Munster, Germany)在毛細管測序儀(ABIPrism3730DNA分析儀)上定制進行，并且序列通過數據采集軟件v3.0 (均獲自AppliedBiosystems, Darmstadt, Germany)進行分析。使用BigDye?終止子v3.1循環測序試劑盒(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)根據生產廠商說明的步驟和下列的測序引物制備序列反應:
[0130]27f(5，-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ;SEQ ID NO:1),
[0131]343r(5，-CTGCTGCCTCCCGTA-3’ ;SEQ ID NO:2)，
[0132]357f (5，-TACGGGAGGCAGCAG-3’ ;SEQ ID NO:3),
[0133]519r(5，-G(T/A)-ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3，; SEQ ID NO: 4),
[0134]536f (5，-CAGC(C/A)GCCGCGGTAAT(T/A)C_3’ ;SEQ ID NO:5),
[0135]803f (5’-ATTAGATACCCTGGTAG-3’ ;SEQ ID NO:6),
[0136]907r(5’-CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’ ;SEQ ID NO:7),
[0137]1114f (5，-GCAACGAGCGCAACCC-3，;SEQ ID NO:8),[0138]1385r(5’-CGGTGTGT(A/G)CAAGGCCC-3’ ; SEQ ID NO:9)和
[0139]1525r(5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’ ;SEQ ID NO:10)
[0140](MWG-BIOTECH AG, Ebersberg, Germany)。
[0141]序列分析和比對，以及系統發育樹的構建如前所述進行(Sallam，A.等，已投稿待發表(2008)):核酸序列數據用Contig匯編程序(CAP)在線軟件分析。序列與以前發表的代表性菌株和其它細菌的序列使用國家生物技術信息中心(NCBI)數據庫上獲得的blast功能進行比對。參考序列使用ClustalXl.8軟件進行比對，系統發育樹使用程序TreeViewl.6.5和NJplot構建。應用靴帶法(Bootstraping)通過進行100次重排來評價樹形布局。 [0142]以5001規樽的培養:在Biostat D650不銹鋼生物反應器(B.BraunBiotechInternational, Melsungen, Germany)中進行5001規模的培養，該反應器的總體積為6501 (64cm內徑和198cm高度)以及d/D值關系(攪拌器直徑與容器直徑的關系)為0.375。此生物反應器安裝有三個攪拌器，每個含有6個槳和Funda-Foam機械消泡器(B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany)。另外，多個孔用于可滅菌探頭測量溶解氧(p02) (25 型;Mettler Toledo GmbH, Steinbach, Switzerland), pH (Pa/25型；Mettler-Toledo GmbH),泡沫(L300/Rd.28 型；B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany),溫度(ptlOO 電極;M.K.Juchheim GmbH, Fulda, Germany),和 850nm 處的光密度(CT6型；Sentex/Monitek Technology Inc.)。操作由數字控制裝置結合MFCS/win軟件包(B.Braun Biotech International)控制和記錄。培養在30°C中完成，且p02調節至在培養基中超過40%飽和度，其自動地通過攪拌控制，通風率穩定地保持在0.7vvm(體積/體積X分鐘)。培養基的初始pH為6.9且在生長期間耐受增加至7.5的pH，否則，通過加入4N HCl控制pH。
[0143]細胞分離，上清液蛋白的濃縮和脫鹽:細胞通過用CEPA Z41型或Z61型連續離心機(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)離心收獲。使用 COP(截留
點(cut-off point))為 30kDa 和帶有 SartOCOn? 2Plus 型(Sartorius AG, Gottingen,
Germany)不銹鋼支架的錯流SartOCOn⑩聚醚砜-盒濃縮分子大小超過30kDa的蛋白并隨后脫鹽(5柱床體積的H2O)。
[0144]在不同底物上牛長:在100ml帶有擋板的Klett培養瓶中研究底物利用；每個培養瓶含有IOml SM培養基和Ig L`1下列底物之一:乳酸鹽、檸檬酸鹽、琥拍酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、葡糖酸鹽、葡萄糖、果糖、蔗糖和甘油。所有底物的儲備溶液通過過濾(孔徑0.2um，MilliporeGmbH, Eschborn, Germany)滅菌。試驗一式兩份地進行，接種在相同測試條件下生長的預培養物。在30°C中24小時孵育期后通過OD578nm的增加監測生長。
[0145]藻青素的發酵生產:使用帶有質粒pMa/c5_914:: CphApcc6803的大腸桿菌DHl的重組菌株以500-1規模發酵生產CGP (Frey, K.M.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384(2002))。作為底物和培養基，使用以前應用的protamylasse (Avebe, Veendam, The Netherlands)培養基，并如(Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767(2005))所述通過稀釋、篩分和離心制備。
[0146]為了測定用于CGP生產的protamylasse的可利用裝料的最適濃度,在濃度為4~8%(vol/vol)的protamylasse培養基上的100ml培養物在200ml帶擋板的培養瓶中測試；培養基的PH為7.5，并且含有IOOmgl-1氨芐西林。接種后，培養瓶在37°C中孵育15h并振搖(120rpm) (G25 型振蕩器，New Brunswick Scientific GmbH, Nurt ingen, Germany),最后，在來自每個培養瓶的50ml樣品中估計CGP含量。
[0147]在發酵之前，16-1預培養物培養在2-1帶擋板的培養瓶中，每個培養瓶含有1-1protamylasse 培養基(7%; vol/vol, pH7.5) > IOOmg I 1 氛節西林和 0.15%(vol/vol)含娃消泡乳液(50%; vol/vol, Wacker Silicones, Burghausen, Germany),并在 30°C 中孵育 20h 并振搖(llOrpm, RC-6-W 型振蕩器，Adolf Kuhner AG, Birsfelden, Switzerland).[0148]在不鎊鋼生物反應器(B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany)中進行主要培養,該反應器的總體積為6501 (64cm內徑和198cm高度)以及d/D值關系(攪拌器直徑與容器直徑的關系)為0.375。該生物反應器安裝有三個攪拌器，每個含有6個槳和Funda-Foam機械消泡器(B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany)。另外，多個孔用于可滅菌探頭測量溶解氧(p02) (25型；Mettler Toledo GmbH, Steinbach, Switzerland)，pH (Pa/25 型；Mettler-Toledo GmbH)，泡沫(L300/Rd.28 型；B.Braun Biotech International, Melsungen, Germany),溫度(ptlOO 電極；Μ.K.Juchheim GmbH, Fulda, Germany),和850nm處的光密度(CT6型；Sentex/Monitek Technology Inc.)。操作由數字控制裝置結合 MFCS/win 軟 件包(B.Braun Biotech International)控制和記錄。
[0149]該生物反應器填充以400-17%protamylasse-培養基(ρΗ7.5)和75ml消泡溶液，原位滅菌，并在冷卻至3(TC后,加入IOOmg -1無菌氨節西林溶液后,接種以4%(vol/vol)預培養物。在30°C中進 行第一個6h的培養，通過加入6M NaOH或6M HCl將培養基的pH保持在
7.5。p02恒定地保持20%飽和度，并自動地通過攪拌調節，通風率穩定地保持在0.17vvm(體積/體積X分鐘)。6h孵育后，溫度升高至37 °C直至發酵結束。細胞通過用CEPA型Z61連續離心機(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH, Lahr, Germany)離心收獲。
[0150]CGP的大規模提取和純化:為了從得到的濕生物質獲得純的CGP，應用以前優化的用于大規模提取和純化CGP的酸提取法(Sallam, A.,和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technical production ofβ-dipeptides fromcyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產β _ 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))。最后，提取的CGP在-30°C中冷凍，并在BETA1-16型凍干機(Christ Gefriertrocknungsanlagen, Osterode, Germany)中凍干。
[0151]CGP的滅菌:CGP通過二乙醚滅菌或如前所沭通過溶解在0.1N HCl中并過濾滅菌(Sallam, A.和 A.Steinbuchel.2007b.Anaerobic and aerobic degradation ofcyanophycin by the denitrifying bacterium Pseudomonas alcaligenes strainDIPl-Role of other three co-1solates in the mixed bacterial consortium.(反硝化細菌產堿假單胞菌DIPl株對藻青素的厭氧和需氧降解一混合細菌聚生體中其它三種共分離物的作用)已投稿待發表)。通過短暫離心(2800Xg，2分鐘)沉降CGP，或通過使CGP放置在4°C沉積過夜來調節儲備溶液中CGP的所需濃度，然后部分棄去上清液，以獲得所需濃度的CGP。
[0152]分析技術:在將Klett-培養瓶插入至Klett-光度計(ManostatCorporation, New York, USA)后，通過測量池度變化，或通過用Libra S5光度計(BiochromLtd.，Camebridge, UK)測量600nm處Iml樣品的OD來監測細菌生長和CGP降解。在電泳示蹤緩沖劑(Laemmli)后在11.5%(Wt/vol)凝膠中進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，U.K.，Nature227:680-685 (1970)。在(Lacks, S.A.等，J.Biol.Chem.225:7467-7473(1980))后進行蛋白的凝膠中復性。蛋白和藻青素用考馬斯染色法染色(Weber, K.等，J.Biol.Chem.244:4406-4412 (1969))，或用銀染法染色(僅用于蛋白)(Nesterenko, Μ.V.等，J.Biochem.Biophys.Methods3:239-242(1994))。.總蛋白和CGP的濃度使用Bradford試劑如(Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005))所述測定。從 CGP-二肽中通過使用 IOkDa-膜 Vivaspin管(Vivascience AG, Hannover, Germany)或使用帶有用于較大體積的IOkDa-膜(MilIiporeCorporation, Bedford, USA)的 Amicon-室(Amicon, Beverly, USA)通過超濾濃縮、脫鹽和分離培養樣品中的大尺寸蛋白。游離氨基酸和二肽通過反相HPLCOtontronInstruments, Neufahrn, Germany)檢測，在檢測前它們的游離氨基用鄰苯二甲醒(OPA)試劑如前所述(Aboulmagd, E.等，Arch.Microbiol.174:297-306 (2000))進行柱前衍生化。對于CGP或CGP- 二肽的構成氨基酸的分析，樣品預先進行酸水解(6N HCl, 95°C，過夜)。HPLC 系統安裝有 B801 柱(Prep Nova-Pak HR3.9x300) (KnauerGmbH, Berlin, Germany),并用起始洗脫液(81%，V01/V01，硝酸鈉(50mM):19%, vol/vol,甲醇)平衡。氨基酸的OPA衍生物用甲醇梯度(19-75%，vol/vol)在40°C中以1.0ml/min的流速洗脫，然后采用1046A型突光檢測儀(Hewlett Packard, Waldbronn, Germany)在 330/450nm (激發 / 發射)下進行熒光檢測。
[0153]CphEd活性和濃度的測定:藻青素酶(CphEal)的活性通過小等分試樣的濃縮酶溶液在CGP覆層瓊脂板上形成降解暈來檢查，為此，5ml培養物樣品以2800x g離心30min (Megafugel.0R, Heraeus Sepatech GmbH, Osterode, Germany)并且 4ml 所得上清液通過超濾離心100倍。對于培養樣品中酶的定量測定，開發了如下的光度測定法:2μ I濃縮的培養上清液加入至Iml CGP懸液(IOOmg l-1)中并在試管旋轉器中(3rpm，502S型，Watson-Marlow GmbH, Rommerskirchen, Germany)在 30°C 中孵育 30min。最后，測量樣品的OD6tltol以指示由于降解而引起的CGP量的減少；此反過來通過各自的校準曲線用來指示溶液中CphEal的濃度。
[0154]CGP降解的最適濃度和條件:使用前面使用產堿假單胞菌DIPl株(Sallam，A.，和 A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technical productionof β -dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產β_ 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))獲得的粗制CphEal粉末，并且測量CGP濃度和粗制CphEal之間關于所需降解時間的最適比率,在Eppendorf管中制備純CGP懸液(水中，PH7.3)的系列稀釋液(50~100g l-1)，每個稀釋液總體積為1ml，將不同量的粗制
末[4.6%(wt/wt) CphEal含量]加入至每種制備的CGP濃度中，反應管在試管旋轉器(3rpm)中在30°C中孵育以揭示用于CGP完全降解所需的孵育時間。
[0155]在含有Iml CGP懸 液(100g l-1)的Eppendorf管中進行測定CGP降解的最適pH的試驗，懸液的pH值為5.0~9.0，反應管含有另外的IOg l-1粗制CphEal,并且在30°C中孵育30min。用于最適降解溫度的反應混合物含有類似濃度的CGP (pH7.0)和CphEal并在
15、20、25、30、35、37、40、50、60或70°C中孵育30min。兩個試驗后，所有試管中的CGP降解以百分比進行計算并一起進行比較。
[0156]通過有機溶劑和硫酸銨沉淀純化CphEd:1ml濃度為川~100%(vol/vol)的冷乙醇、丙酮或甲醇加入至Eppendorf管中的50 μ I濃縮的粗制CphEal溶液(14g 1)中，反應混合物在_20°C中孵育60min。反應管以16000x g離心5min后，片狀沉淀物干燥并重懸在50 μ I磷酸鈉緩沖液(ρΗ7.0)中。通過在IOml粗制CphEal溶液(3.5g L-1)中逐步增加硫酸銨飽和度百分比(10~100%)來進行硫酸銨分級分離，在每個步驟中，試管在室溫下孵育30min并以16000x g離心lOmin，片狀沉淀物懸浮在磷酸鈉緩沖液(pH7.0)中，然后通過超濾脫鹽。所有蛋白沉淀物測定CGP覆層瓊脂板上的CGP降解以及SDS-PAGE中的蛋白含量。
[0157]CphEd的特異性底物純化:根據粗提取物中的酶與其不溶性底物(CGP)的強親和力開發CphEal的純化方法，其中僅CphEal與CGP結合，并且因此可以通過沉淀收獲。為了確定在PH7.0下酶與CGP的完全結合所需的時間，0.5ml濃縮的粗制CphEal溶液(14g L-1)加入至0.5ml CGP懸液(100g L-1)中。在每次首個10分鐘孵育后，測試來自反應上清液的2 μ I等分試樣(短暫離心后)在CGP覆層瓊脂板上的降解活性，降解暈的消失指示CphEal與CGP的完全結合。實際純化過程在類似的Iml反應混合物中進行，并且如下進行:在CphEal與CGP完全結合后，混合物離心30秒(16000x g)，棄去上清液，并且片狀沉淀物用IOml磷酸鈉緩沖液(50mM)洗滌5次。之后，片狀沉淀物懸浮在Iml磷酸鹽緩沖液中，并在30°C中在旋轉(3rpm)下孵育過夜直至發生CGP的完全降解。混合物離心(5min，16000x g)，然后通過超濾去除CGP- 二肽，并且通過SDS-PAGE分析上清液的濃縮蛋白級分的純度。[0158]來自產堿假單胞菌DIPl株的CphEd的表征:為了確定純化的CphEal的溫度穩定性，10 μ I等分試樣在不同的溫度(10~80°C )下孵育20min，然后其中3μ1在30°C中測試在CGP覆層瓊脂板上的降解活性。對于最適降解溫度，3 μ I等分試樣的純化CphEal溶液加入至Iml CGP懸液(50mM磷酸鈉緩沖液中的100g 1-1，pH7.0)并在不同的溫度(10，20, 30, 40, 45，50和60 °C )下孵育20min。對于純化CphEal對CGP的最適降解ρΗ，3μ I等分試樣的純化備溶液加入至Iml具有不同pH值(5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5 或 9)的 CGP 懸液(50mM 磷酸鈉緩沖液中的 100g 1-1)并在30°C中孵育30min。最后，如上所述在兩個試驗的反應管中光度法測定CGP降解。如前所述測試純化CphEal對下列多肽底物的底物特異性(0bst，M.等，Biomacromolecules5:153-161 (2004)):CGP,牛酪蛋白(Hammersten-級)(Merck, Darmstadt, Germany)，牛血清白蛋白(BSA) (Roth, Karlsruhe, Germany)和聚(a, β -D/L-天冬氨酸)(BayerAG, Leverkusen, Germany)。
[0159]為了揭示酶抑制劑對純化CphEal的作用，50 μ I等分試樣的純化酶儲備溶液加入至450 μ I磷酸鈉緩沖液(50mM)并在下列基團特異性抑制劑(Group-specificinhibitors)的存在下在30°C中孵育2h:亮抑酶肽(巰基蛋白酶)，EDTA (金屬蛋白酶)，Pefabloc(絲氨酸蛋白酶)，PMSF(絲氨酸蛋白酶)或N-溴代琥珀酰亞胺(色氨酸殘基)。測定每種反應混合物的5 μ I樣品在CGP覆層瓊脂板上的活性。之后，5 μ I等分試樣的CGP儲備懸液(50 g 1-1)加入至反應管，孵育另外15 min，離心和經HPLC篩選降解產物。
[0160]實施例1來自哺乳動物、禽類和鳥類腸道菌叢的樣品對CGP的厭氧降解:過濾的菌叢樣品含有大量的不同細菌以及高含量的底物。為了模擬獲得這些樣品的消化道內的自然條件，菌叢溶液用作接種物并且同時用作營養補充劑。含有BM培養基和作為唯一底物的Ig F1CGP的無菌厭氧Hungate管以10%的濃度接種。所有接種的厭氧管顯示在這些條件下完全降解CGP。在試管中完全降解CGP所需的孵育時間為12-48 h的范圍。
[0161]在腸道菌叢中篩選CGP降解細菌:為了分離CGP降解細菌，100 μ I等分試樣的已制備的菌叢樣品涂布在CGP覆層瓊脂板上。在37°C中孵育幾天期間，瓊脂板顯示CGP降解細菌的出現在不同的菌叢之間變化很大(表1)。在來自兔(埃及)、綿羊(德國)的盲腸菌叢和來自鯉魚(德國)的消化道菌叢的情況下出現最高的發生率。降解集落的形態學特征，所需的孵育時間和由CGP降解導致的暈圈(halos)的形式和強度在不同的菌叢樣品以及每個樣品內的集落間變化也很大。這指示存在有具有各種各樣的CGP降解能力的獨特的細菌物種。
[0162]CGP降解株的分離和純化:選擇形態學上獨特的CGP降解細菌集落并通過將顯示降解暈的集落轉移至新鮮的CGP覆層瓊脂板而進一步純化。在純化工作期間，許多CGP降解集落喪失了其作為純性培養物誘導降解暈的能力，并且因此被丟棄。同樣，幾種CGP降解群顯示非常難以作為純性培養物獲得，并且也被忽略而不進行進一步的純化步驟。另一方面，純化階段產生62個純性培養物，它們顯示形態學上獨特的特征且保留了 CGP降解的能力。如表1中所證明，CGP降解細菌分離自每種動物的沿消化道的不同部位。這與關于例如反芻動物中飲食蛋白的降解所已知的事實相符；而瘤胃是飲食蛋白的主要降解部位，未消化的蛋白(過瘤胃蛋白(bypass或escape protein))隨著消化物移動至下消化道,在此其一部分被動物的酶破壞或被下消化道菌叢破壞，然后被吸收，之后剩余物被排泄。過瘤胃蛋白的降解對于特殊生理功能是很重要的，諸如產奶(Holter，J.B.等，J.Dairy.Sc1.76:1342-1352(1993))。
[0163]純性培養物在厭氧和需氧條件下降解:檢驗62個純性培養物在液體培養基中在需氧條件下降解CGP的能力。這在含有Ig F1CGP和0.5g l-1酵母提取物的BM培養基中進行，并且顯示所有純性培養物降解CGP的能力(表1)。在除還原劑以外含有類似培養基的Hungate管中的厭氧CGP降解試驗表明在62個分離株中，46個也能夠厭氧性降解CGP。這些中，38個完全地降解CGP，而剩余的顯示部分降解CGP。純性培養物厭氧降解CGP所需的孵育時間的范圍為在37°C中24h至7天。
[0164]CGP的降解產物:在需氧和厭氧培養中62個純分離物對CGP完全降解后，立即通過HPLC測定培養上清液中CGP的降解產物，在HPLC測定之前如方法章節中所述用OPA試劑進行柱前衍生化。如預期的那樣，HPLC分析表明所有分離物將CGP降解為構成其的二肽。對之前已經進行酸水解的上清液樣品的類似分析表明存在三種構成CGP的氨基酸:天冬氨酸，精氨酸和賴氨酸。后三種氨基酸的檢測依照重組CGP的已知組成，該重組CGP應用于這些試驗中，其中約6Mol%的精氨酸部分用賴氨酸替換(Voss，1.等，Metabol.Eng.8:66-78(2006)) ο
[0165]CGP降解純性培養物的分類學隸屬關系:分離的純性培養物的形態學特征提示約50%的分離物屬于芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，而其余的分離物屬于其它的屬包括鏈霉菌屬和小單孢菌屬。為了對檢驗的腸道菌叢中CGP降解細菌的系統發生提供更清楚的理解，來自62個菌株的8個菌株進一步通過16S rDNA測序鑒定。如表中所示，三種分離物:分別來自綿羊(德國)的瘤胃菌叢、火雞(埃及)的盲腸菌叢和羅非魚(埃及)的消化道菌叢的17，35，49，被鑒定為芽孢桿菌屬的成員，它們與巨大芽孢桿菌AC46bl，巨大芽孢桿菌MPF-906和B.KoguryoaeSMC4352-2T的16S rDNA序列相似性分別超過99%。兩種分離物:來自奶牛(德國)的結腸菌叢和鴿子(埃及)的盲腸菌叢的15和47發現屬于短芽孢桿菌屬，它們與羅伊茲氏芽孢桿菌(B.reuszeri)DSM9887T和短芽孢桿菌SE004的16S rDNA序列相似性分別超過98%。分離自兔盲腸(德國)的株31隸屬為鏈霉菌屬，其與阿維鏈霉菌(S.avermitilis) NCIMB12804T的序列相似性超過98%。16S rDNA序列分析還顯不來自鴨盲腸(德國)的株38屬于小單孢菌屬，并且與小單孢菌0138種的序列相似性超過99%。最后，在鑒定的分離物中還發現了假單胞菌屬的代表:來自鯉魚(德國)的株52顯示與CGP降解細菌產堿假單胞菌DIPl的16S rDNA序列相似性超過99%。
[0166]構建的系統發育樹(圖1)顯示來自各種動物、禽類和魚類菌叢的8個鑒定株與它們密切相關的菌株和與其它細菌之間的關系。此外，在系統發育樹中證明了所有能夠細胞外降解CGP的已知細菌的分類學位置。此外表2提供了對能夠細胞外降解CGP的細菌的廣泛分布、生活環境和系統發生的概述。 [0167]鈍頂螺旋藻市售產品中的CGP:市場名稱螺旋藻，其常常與幾種營養益處相關，并且因此用作用于人和動物的添加劑(Narasimha, D.L.R.等，J.Sc1.Food Agric.33:456-46O (1982) ; Kihlberg, R., A.Rev.Microbiol.26:427-466 (1972) ; Lu, J.等，Aquaculture254:686-692 (2004) ; Ross, E.，Poult-Sc1.69:794-800 (1990)))。為了研究研究這是否與 CGP 的存在相關，在德國市場可獲得的三種螺旋藻產品檢查CGP的存在。兩種產品；來自SanaturGmbH(Singen, Germany)和 Greenvally GmbH (Berlin, Germany)由 100% 純頂螺旋藻組成，而第三種變種來自Aurica GmbH (Schwalbach-Elm, Germany),其含有40%。通過在CGP分離之前研磨成細粉制備這三種產品的每一種的IOg CDM，此對應于大約普通日劑量的兩倍。三種市場變種分別0.06%, 0.13%和0.15%的CGP含量。如期望的，分離的CGP的水解樣品的驗證性HPLC分析表明，藍細菌CGP的典型構成性氨基酸為:天冬氨酸和精氨酸。
[0168]實施例2:開發用于從CGP生產β - 二肽的最適方法:首先以小規模優化幾個因素，例如；所需要的合適和經濟的培養基，高度濃縮的CGP懸液，其在實踐中可以被制備用于降解，和規定細胞外酶在相對短的孵育期內實現完全的CGP降解的必需量。
[0169]在CphE的制備期間，由于加入誘導物(CGP)和其隨后的降解，OD600nm的變化代表CphE釋放的明確跡象，因此，清亮的培養基和細胞的可控生長是必需的，這通過材料和方法章節中提及的最終培養基組成來實現。而且，在測試的底物中，產堿假單胞菌DIPl株顯示在檸檬酸鹽上生長最好(圖3)，作為唯一底物的檸檬酸鹽的施用濃度(lg/Ι)確保合理但同時在誘導和降解階段期間確保培養物可控的生長濁度。
[0170]為了測定用于大規模方法的降解階段(階段III，見下)的CGP和粗制CphE濃度之間的平衡比率，進行下列小規模試驗；在Eppendorf管中制備純CGP懸液(在水中，pH7.3)的系列稀釋液(10~50g/l)，每個管中的總體積為1ml。此外，對每個制備的CGP濃度測試粗制CphE的系列稀釋液(I~10g/l)，反應管在30°C中在試管旋轉器中以3rpm的旋轉速度孵育。試驗顯示當施用較低濃度的粗制CphE時，CGP降解時間的相對恒定的增加。最高測試濃度的CGP(50g/l)可以在2g/l粗制CphE粉末的存在下在IOh內被降解(圖4)。
[0171]CGP- 二肽的大規模生產:為了能夠常規生產大量的純CGP- 二肽，建立三階段方法:階段I =CGP的大規模分離和純化，階段I1:粗制CphE粉末的大規模生產，階段III =CGP降解為其二肽。[0172]階段I (CGP的大規模分離和純化):為了獲得大量的CGP，使用4776g細胞干質量的含CGP細胞，此量是以前在使用富養羅爾斯通氏菌H16-PHB—4- Aeda (pBBRlMCS-2::cphA6308/edaH16)的一次5001發酵期間產生的。此生物質裝料的CGP含量為32%(wt/wt) (Voss, 1.等，Metabol.Eng.8:66-78 (2006))。另外，混合來自使用富養羅爾斯通氏菌H16-PHB—4- Δ Idh/ Ω km-cphA6308的實驗室規模發酵的幾種其它干生物質裝料(總計2490g)并且被認為是第二裝料。根據在材料和方法章節中提到的改良的酸提取法從每種裝料中單獨地提取和純化CGP。得到的CGP濕生物質對于主要細胞裝料為1948g，且對于第二裝料為295g，在凍干純化的CGP后，分別從兩種裝料中獲得621.83g和82.17g純CGP。對來自兩種細胞裝料的分離的CGP的各自氨基酸成分的HPLC分析表面，該聚合物主要由天冬氨酸和精氨酸組成，并且其含有僅少量的4.5%(m0l/m0l)的賴氨酸。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳表明兩種裝料中分離的CGP的分子量為約20-30kDa。然而，HPLC分析和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳指示在獲得的CGP中沒有任何雜質。因此，兩種CGP裝料可以混合在一起達到最終量為704g 的純 CGP。
[0173]階段II (粗制CphE粉末的大規模生產):為了繼續開發CGP-二肽的商業生產方法，從產堿假單胞菌DIPl中生產足量的粗制CphE是必需的，因此，該菌株在Biostat D650生物反應器中以5001規模培養。產堿假單胞菌DIPl的預培養物在含有11具有lg/Ι檸檬酸鈉的SM培養基的21帶擋板的培養瓶中進行培養；將培養瓶在30°C中孵育12h并振搖。生物反應器充以4201含有lg/Ι檸檬酸鈉的SM培養基，滅菌，并接種以4%(vol/vol)預培養物。初始的PH調節至6.9。在發酵期間，產堿假單胞菌DIPl株的細胞在發酵的第一個小時后開始緩慢地生長，并達到0.4的OD6tltol值，從而在差不多9h后進入靜止生長期。在靜止生長期的第一個2h后通過加入0.25g/l無菌CGP懸液誘導CphE的分泌，誘導物(不溶的CGP)的加入將OD6tltlnm立即從0.55增加至0.98，加入的CGP的完全降解需要2h并且通過OD600nm的減小指示達到接近誘導前的值。Ih后，細胞開始緩慢地生長，這最有可能是培養基中CGP- 二肽的存在所導致的。在總計14h的培養期后發酵終止(圖5)。
[0174]對于包括分泌的細胞外藻青素酶的上清液中蛋白的收獲、濃縮和脫鹽，制備連續系統，同時進行發酵(圖6);為收獲，使用CEPA Z41連續離心機來分離細胞，同時將上清液收集在中央1001槽中。為了同時濃縮收集的上清液，具有30kDa盒的錯流裝置連接到中央槽；含有分子尺寸大于濾器盒的C0P(30kDa)的蛋白的濃縮滲余物重新泵入槽中，同時直接棄去滲透物。調節錯流的流速以保持槽中的體積為約501。為冷卻，將冰袋引入至中央槽中以保持溶液的溫度在20°C中。在收獲結束后，繼續濃縮過程直至僅51濃縮物留在槽中。為脫鹽，濃縮物用5柱床體積的H2O洗滌。在前面的每個步驟期間，收集樣品并檢查在CGP覆層瓊脂板上的CGP降解活性(圖2)。最后，濃縮物冷凍在_30°C并凍干從而獲得最終干重為17.5g的粗制蛋白粉末。
[0175]階段III (純CGP降解為其二肽)=CGP至其二肽的大規模降解在250g純CGP上并使用IOg粗制CphE粉末進行，這些量代表最高的、易于制備的CGP濃度(50g/l)和充足的粗制CphE濃度(2g/l)從而卻找不到12h內的完全降解,如通過小規模試驗所測定的。250gCGP粉末同屆在510.1M HCL中，中和至pH7.3，置于在4°C中沉降，并且最后通過用自來水洗滌3次脫鹽，從而獲得最終體積為51的所需濃度。之后，IOg粗制CphE粉末加入至CGP懸液中，并在30°C中孵育12h并輕輕攪拌。CGP完全降解后，將二肽溶液過濾除菌，使用在階段II期間采用的相同錯流系統從粗制蛋白成分中分離，在-30°C下冷凍，并且最后凍干，從而獲得227.5g CGP-二肽。
[0176]為了測定對于CGP 二肽的純化是否需要進一步的純化步驟，將幾個20ml等分試樣(在后面的冷凍和凍干步驟之前獲取)用具有下列COP的不同膜過濾:10，5，1，和0.5kDa。過濾后，通過測定過濾之前和之后的凍干的Iml等分試樣的干重以及通過HPLC分析評價CGP-二肽的損失。與初始的二肽溶液比較，過濾期間的最大干重損失為具有最小COP (0.5kDa)的膜的情況，為78.5%(wt/wt)，具有IkDa的膜導致47.8%(wt/wt)的損失，而具有5kDa的膜導致11.6%(wt/wt)的損失，具有較高COP(IOkDa)的濾膜顯示7.4%(wt/wt)的最小損失。
[0177]從所有過濾系統獲得的二肽的純度等級通過TLC以及HPLC分析監測，所有過濾的二肽樣品顯示相同的高純度等級(圖7，I)。因此，對于主要二肽裝料不需要進一步的過濾步驟。具有30kDa盒的錯流明顯也是用于回收降解的CGP溶液的蛋白部分的最實用的設備。將回收的蛋白溶液再次冷凍和凍干。回收的粉末在CGP覆層瓊脂板上的活性測試顯示經歷所有前面提到的步驟后CphE存在并且保留了其活性(圖2)。粗制粉末的回收率78%。
[0178]對于所得二肽粉末的最后質量控制，直接樣品以及酸水解樣品通過TLC檢驗；對于直接樣品指示僅一個斑點(圖7，I)，而水解樣品顯示標準氨基酸天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸的典型斑點(圖7，II)。此外，對酸水解樣品的驗證性HPLC分析表明僅有這三種構成性氨基酸的典型峰。在這些結果中，二肽粉末的純度估計為超過99%。來自250g CGP降解的最終結果(227.5g純二肽)表明整個方法的總效率為91%，其通過未來的優化甚至可以更聞。
[0179]實施例3.以5001規模發酵生產藻青素:用于此研究的足量CGP以500-1規模發酵產生(Elbahloul, Y.等，Appl.Environ.Microbiol.71:7759-7767 (2005))。然而，重組大腸桿菌 DHl 株(pMa/c5_914:: cphAPCC6803)培養在 7%protamylasse (vol/vol)上；在對可獲得的protamylasse裝料的預試驗中，此濃度證明對于CGP制備是最適的。
[0180]在發酵期間(圖8)和孵育的第一個6h后，溫度升高至37°C以誘導CGP-合成酶(CphA)基因(Frey, K.Μ.等，Appl.Environ.Microbiol.68:3377-3384 (2002)),每 h 取的樣品顯示，如預期的那樣，聚合物在細胞內進行性地積累，在13h后達到最大(顯微鏡估計)并且之后保持恒定(圖9)。15h后OD6tltlnm達到18.3，然后發酵終止，然后，后來的分析顯示13%(wt/wt CDM)的最大CGP積累為發酵13h后，并且在收獲期(15h)時其下降至10%(wt/wt CDM)。從所得的4626g濕重的細胞中提取CGP(1372g CDM)后，獲得135g純CGP粉末，CGP的HPLC分析表明除了賴氨酸(占聚合物的6.8Mol%)以外僅有構成性氨基酸天冬氨酸、精氨酸。SDS-PAGE證實CGP的純度并且顯示其分子量為25~30kDa。
[0181]產堿假單胞菌DIPl株的最適生長條件:測試含有不同濃度的檸檬酸鹽(0.5~IOg l-1)的SM-培養基，其以前證明是DIPl株的最適底物(Sallam，A.，和A.Steinbuchel.2008b.Biotechnological process for the technical productionof β -dipeptides from cyanophycin.(用于從藻青素中工藝生產β_ 二肽的生物工藝方法)Under preparation.(準備中))，顯不6g l-1產生最大生長(475Klett裝置，在30°C中13h后)。在相同條件但具有不同的pH值(5.5~8.5)下在6g l-1檸檬酸鹽上培養的DIPl株的培養物顯示DIPl株具有6.5的最適生長pH，而在不同孵育溫度(15~45°C )下的培養表明37°C是生長的最適溫度。
[0182]用于產堿假單胞菌DIPl株的最大CphEd產暈的最適培養條件:為了判斷當細胞達到靜止生長期時用于DIPl株的CphEal最大產量的最適培養條件，通過加入0.25g F1CGP誘導制備CphEal。在接下來的5h期間，將上清液樣品濃縮(100倍)并篩選CGP覆層瓊脂板上的降解活性以及進行光度測定。來自檸檬酸鹽濃度低于0.5或高于4g l-1的培養物的上清液樣品不顯示任何降解活性，而對在2g l-1檸檬酸鹽上生長的培養物誘導5h后監測到最大活性和隨后CphEal最大產量。此外在最適生產條件下的進一步培養試驗證實DIPl株的細胞在孵育約13h后達到靜止生長期，并證明此時間點對于CphEal的誘導的最適的。因此，下面的條件被認為對于CphEal生產是最適的；含有2g l-1檸檬酸的SM-培養基，pH6.5，37°C，在13h后誘導，并且在孵育的第16h期間收獲。
[0183]使用CGP和可詵的誘導物對CohE^1的最適誘導:除了 CGP以外，在DIPl株的培養中測試其它可能的誘導物；來自CGP的β_ 二肽形式，合成二肽U-精氨酸-天冬氨酸，α-賴氨酸-天冬氨酸，α-鳥氨酸-天冬氨酸)(Sigma-Aldrich，St.Louis, Missouri, USA), α -聚天冬氨酸(Bayer AG, Leverkusen, Germany),聚 _ ε -賴氨酸(Chisso, Tokyo, Japan)，L-天冬氨酸，L-精氨酸，L-賴氨酸，L-瓜氨酸，L-鳥氨酸以及天冬氨酸類似物[N-乙酰基-天冬氨酸，脲基琥珀酸(N-氨甲酰基-天冬氨酸)]。所有誘導物首先以0.25g l-1的濃度測試，并且CphEal的產生在CGP覆層瓊脂板上測定并且還經光度計測定。僅CGP，其二肽和天冬氨酸誘導顯著量的CphEal。隨后，在用這三種誘導物誘導的培養物中研究最適濃度和最適CphEal收獲時間；對于CGP，測試0.001~3.0g l-1之間的濃度，誘導效應 隨著濃度增加而增加直至0.05g l-1，而較高的濃度顯示相同的效率。在用
0.05g F1CGP誘導5h后獲得最大CphEal產量。
[0184]在與對于CGP測試的類似條件下培養但用與其相同的濃度范圍內的CGP- 二肽誘導的培養物，就誘導物的濃度而言，顯示類似的結果，然而，僅在誘導3h后獲得最大CphEal產量。天冬氨酸還證明是合適的誘導物，其中使用4g l-1天冬氨酸在誘導5h后獲得最大CphEal產量；然而，與用最適CGP濃度(0.05g l-1)誘導的培養物相比，用天冬氨酸誘導后的CphEal產量僅為三分之一。
[0185]經粗制CphEd將CGP降解為二肽的最適條件:為了減少處理的反應體積和原始方法的第三階段(CGP降解)所需的時間，較高CGP濃度(50-100g/l)的降解時間在30°C中測試，這顯示降解時間隨著粗制CphEal的濃度降低和隨著CGP濃度的升高共線的增加。在IOg l-1粗制CphEal的存在下，對于最低測試濃度(50g l-1)的CGP監測到最短的降解時間(4h)，而需要16h降解最高測試濃度的CGP(100g l-1)。
[0186]如材料和方法章節中所述分別進行估計粗制CphEal粉末降解CGP的最適pH和溫度。光度法測定反應管中剩余的CGP表明最大CGP降解(45%)發生在pH6.5，然而，5.5~7.5的pH范圍顯示了相近的結果。另一方面，CGP降解隨著溫度增加而增加，在50°C時達到最大值90%。因此，在最適參數(50°C，pH6.5)下重復CGP和CphEal的濃度之間的最適關系。對于50和100g l-1的CGP濃度，這將所需的降解時間(在IOgr1粗制CphEal的存在下)分別減少至I和4h。在最適條件下，降解時間還顯示隨著粗制CphEal的濃度降低和隨著CGP濃度的升高的共線增加。此共線關系可以有助于在未來的工藝應用中應用最適降解參數。各個公式是對至多達100g l-1的CGP濃度并基于純CphEal (E)的濃度計算的，為了應用粗制提取物，CphEal含量必需在使用該公式(s.u.)之前確定；
[0187]P5CTC中的降解時間=I?.55 — 29.891Et^Μ^0ρ1ιΕει1 (g/1)]
[0188]從粗制上清液粉末中純化CphEd:為了使方法更為有效并獲得關于來自產堿假單胞菌DIPl株的CGP酶的特性的更多知識，測試了用于從粗制粉末中純化CphEal的幾種工藝上適用的方法。由于回收率低和純化效果差，使用溶劑諸如乙醇、甲醇或丙酮沉淀和分離酶不能提供令人滿意的結果。然而，硫酸銨沉淀提供相當好的結果，其飽和濃度為70%，而純度等級有點太低。
[0189]經特異性底物結合純化CphEd:開發了一種簡單的方法純化來自產堿假單胞菌DIPl株的CGP酶。為此，如材料和方法章節中所述，不溶的CGP本身用作結合基質以特異性地結合CphEal。預試驗顯示在首個5min后CphEal與CGP完全結合，因此這被認為是在另外的應用中的最小結合時間。所有純化步驟的SDS-PAGE顯示酶的逐步純化(圖10A)，并且前兩個洗滌步驟是必需的，以去除不結合CGP的其它蛋白。在XGP基質的降解和通過超濾去除二肽后，獲得高純度等級的CphEal。CGP覆層瓊脂板顯示純化CphEal的高活性，并且純化的蛋白顯示在SDS-PAGE中的表觀分子量為45kDa。CphEal的性質通過凝膠內復性(in-gel-renaturation)來證實,其中其再次獲得活性并且在CGP覆層瓊脂板上形成降解暈。純化CphEal的濃度為43.2μ g πι1，而初始的粗蛋白溶液中的總蛋白含量為944 μ gπι1。為了更準確地檢測純化酶的純度等級，對于較大的樣品體積(三倍體積)重復進行SDS-PAGE，并且用銀染色法染色較長的時間；這顯示了少數的其它蛋白條帶以相當低的濃度存在(圖10B)。
[0190]在發酵上清液中測定CphEd含暈:如果在未來的工藝應用中需要應用純CphEal，則首先要估計產生的上清液中CGP酶的濃度，因此，使用Iml具有固定濃度(IOOmg 1)的CGP懸液開發了一種快速檢測法，所述CGP懸液的OD6tltol為0.215。向此溶液中加入3 μ I具有不同濃度(2.7~43.2 μ g πι1)的純化酶的溶液。反應在30°C中孵育60min，同時緩慢地旋轉(3rpm)。最后，在600nm下經光度法測定CGP降解的程度。為了保證該檢測的再現性和其公式(s.u.)的準確性，必需保持測試參數和0D_下的測量范圍(0.15~0.215)。
[0191]E[粗制提取物中的CphEal 含量(μg/ml)] — [0.2404 — D(60min后的OD6(IOnm)]/0.0017
[0192]CphE.的工藝純化所需的CGP暈:為了將酶純化步驟結合至主生產方法中，還需要確定結合(具有已知CphEal含量的上清液中的)所有CphEal所必需的CGP的量。在0.5ml的總反應體積中，將50μ I具有不同濃度(1.4~19μ8 πι1)的純化的CphEal溶液加入至不同的CGP濃度(0.1~6g 1)中。反應混合物在30°C中孵育lOmin，同時緩慢地旋轉(3rpm)。離心(16000Xg，2min)后，將反應管離心，并且篩選上清液在CGP覆層瓊脂板上的活性。對于所有測試的CphEal濃度，為安全起見，不誘導降解暈的最小CGP濃度乘以3，并且然后結合至校準曲線中。得到的公式如下:
[0193]C[需要的 CGP濃度(g/1)] = [Ε[β制提取物中的 CphEal 含量(ug/ml)] — 2.4392]/0.9432
[0194]純化的CohE2l的牛化表征:純化的CphEal在50°C中顯示最大CGP降解活性，而該酶的完全滅活發生在68°C中。CGP降解的最適pH范圍為7-8.5，最適值為8.5。測試純化的CphEal對CGP、BSA、牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)的底物特異性顯示對CGP的最高降解活性。然而，BSA也被部分降解(與CGP相比為65%)。牛酪蛋白和聚(天冬氨酸)受純化的CphEal的酶活性的影響最小。[0195]為了獲得關于CphEal的催化機制的信息，采用不同的基團特異性抑制劑進行抑制劑試驗(表1)。在CGP覆層瓊脂板上和通過CGP降解產物的HPLC分析來測定CGP酶的抑制。這表明細胞外CphEal被絲氨酸蛋白酶抑制劑Pefabloc和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)強烈地抑制。N-溴代琥珀酰亞胺(色氨酸氧化劑)也導致酶的完全抑制。相反，CphEal導致的降解暈形成不受巰基蛋 白酶抑制劑亮抑酶肽或受金屬蛋白酶抑制劑EDTA的影響。HPLC分析證實除了用EDTA處理的樣品以外，這些結果均顯示對CphEal的抑制。
[0196]實施例4.CaCo-2細胞培養物對CGP 二肽的吸收:為了證明CGP 二肽在營養和治療中的潛在應用，在初步研究中使用Caco2細胞(人結腸上皮腺癌細胞)的細胞培養物測試這些高度可溶的二肽的吸收。含有20%胎牛血清(FCS)和l%2mM谷氨酰胺溶液的Dulbecco's改良伊格爾培養基(DMEM)用作培養用培養基。約7000Caco2細胞/孔散布在24孔板中并在5%C02的氣氛和約98%的濕度下在37°C中孵育。每天在顯微鏡下檢查細胞直至大約50h后形成單層。孵育培養基用每孔新鮮的700μ I相同培養基完全更換，所述培養基中補充了 350 μ g/ml CGP二肽(90%Asp_Arg: 10%Asp_Lys)或補充了相同量的游離L-天冬氨酸、L-精氨酸和L-賴氨酸的混合物。一排孔供給以新鮮的700 μ I不含后面的添加物的孵育培養基并且被當作對照。在0，13，22，67和113h的孵育期后取樣品，并且如Sallam和 Steinbuchel (J.App.Microbiol.DO1:10.1111/j.1365-2672.2009.04221.x)所述通過HPLC進行分析以確定測試的二肽和氨基酸的濃度變化。
[0197]培養基樣品的HPLC分析表明在孵育113h后，約60%的藻青素Asp-Arg 二肽和68%的藻青素Asp-Lys 二肽被吸收。另一方面，在相同的孵育期后，僅41%的游離精氨酸和51%的游離L-賴氨酸被吸收。
[0198]例外地是，L-天冬氨酸似乎以游離的形式較好地被Caco2細胞吸收，并且在約67h的較短孵育期內被完全吸收。相反，與游離精氨酸和游離賴氨酸的吸收量相比，以CGP 二肽的形式多31.6%的精氨酸和多24.4%的賴氨酸被細胞吸收。因此，CGP 二肽代表了兩種氨基酸精氨酸和賴氨酸的更高生物利用度的來源。這些結果是CGP 二肽在營養和治療中的潛在應用的第一個直接證據并且證實了以前關于腸道菌叢降解CGP的結果(Sallam和Steinbuchel J.App.Microbiol.DO1:10.1111/j.1365-2672.2009.04221.x))。這些結果還與以前的體外和體內研究相一致，這些研究證明寡肽(通常)具有比游離形式的其構成性氨基酸高的生物利用度(Adibi, S.A., J.Clin.1nvest.50:2266-2275(1971) ;Adibi, S.A., Gastroenterologyl13:332-340(1997);Dock,D.B.等，Biocell28:143-150 (2004))。
[0199]表1.哺乳動物、禽類和魚類腸道菌叢中CGP降解細菌的廣泛分布、系統發生和特征
【權利要求】
1.一種藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 含有分離的通過蛋白水解方法從藻青素(CGP)的制劑酶法制備的β-二肽組合物，所述方法包括以CGP酶將所述CGP的制劑降解為β - 二肽，其中所述CGP酶是作為DSM21533在DSMZ保藏的產堿假單胞菌DIP1CGP酶CphEal。
2.如權利要求1所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: (i)所述β - 二肽組合物由單個β - 二肽或β - 二肽的混合物構成；和/或(?)所述二肽組合物由含有選自下列的氨基酸殘基的二肽構成:天冬氨酸、精氨酸和賴氨酸。
3.如權利要求2所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 所述β-二肽選自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸。
4.如權利要求1所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 還包括通過培養原核或真核生物生產細胞系制備CGP制劑。
5.如權利要求4所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 所述生產細胞系選自大腸 桿菌、富養羅爾斯通氏菌、鮑氏不動桿菌、谷氨酸棒桿菌、惡臭假單胞菌、酵母菌株和植物生物質。
6.如權利要求5所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 所述生產細胞系為富養羅爾斯通氏菌Η16-ΡΗΒ-4- Δ eda (pBBRlMCS-2:: CphA6308/edaH16)和大腸桿菌 DHl (pMa/c5_914:: cphAPCC6803)。
7.如權利要求4、5或6所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 還包括分離、純化和/或化學修飾通過培養所述生產細胞系獲得的所述CGP產物。
8.如權利要求1所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 還包括純化或分離降解產物。
9.如權利要求1所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 還包括化學修飾降解產物。
10.如權利要求1所述的藥物組合物、食品或飼料補充劑，其特征在于: 其含有β-天冬氨酸-精氨酸和/或β-天冬氨酸-賴氨酸。
11.權利要求1-10所述的β-二肽組合物在制備用于營養治療的藥物，或作為食品或飼料補充劑中的應用。
12.如權利要求11所述的應用，其中所述β_二肽組合物由單個β_ 二肽或β_ 二肽的混合物構成。
13.如權利要求12所述的應用，其中所述β-二肽選自β-天冬氨酸-精氨酸和β-天冬氨酸-賴氨酸。
【文檔編號】A23K1/16GK103520700SQ201310343230
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2009年6月15日 優先權日:2008年6月13日
【發明者】A.薩拉姆, A.施泰因比歇爾 申請人:北萊茵法威廉明斯特大學