一種百合酯類花香基因LoAAT1及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體公開了一種百合酯類花香基因LoAAT1及其應(yīng)用。所述LoAAT1基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～2所示；基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。LoAAT1基因在有香味的百合花組織表達(dá)，在無香味的百合品種中不表達(dá)，并且其表達(dá)與花發(fā)育進(jìn)程有關(guān)。將LoAAT1基因可以連接到任意一種植物轉(zhuǎn)化載體，然后導(dǎo)入百合或其它植物細(xì)胞中，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因花香，從而用于生產(chǎn)；也可以根據(jù)本發(fā)明所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，用于鑒定百合或其它植物的花香基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
【專利說明】一種百合酯類花香基因LoAAT1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種百合酯類花香基因LoAAT1及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]大多數(shù)植物的花香是由一系列低分子量的揮發(fā)物混合在一起形成，其化學(xué)成分主要是職烯類化合物、苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物和脂肪酸衍生物(Pichersky et al,2006 ；Dudareva et a7，2004)。經(jīng)莽草酸途徑形成的苯丙烷類酯類成分苯甲酸乙酯是百合主要特征香氣成分之一(范燕萍，2008)。
[0003]苯甲酸乙酯是苯丙酸類化合物/苯環(huán)型化合物，它是以L-苯丙氨酸前體的。在質(zhì)體中通過莽草酸途徑產(chǎn)生苯丙氨酸，在苯丙氨酸裂解酶(PAL)的催化作用下生成肉桂酸。肉桂酸在一系列酶的催化作用下合成苯甲醛、苯甲酸，在苯甲酸輔酶A連接酶(BZL)作用下，苯甲酸形成苯甲酰CoA (Boatright J.et a7, 2004),最后在醇酰基轉(zhuǎn)移酶(AAT)催化下生成，該酶是控制苯甲酸乙酯形成的末端關(guān)鍵酶。
[0004]Nordstrom (1962)首次指出酵母中酯類合成主要依靠酰基轉(zhuǎn)移酶或酯合成酶的作用。到目前為止，已從不同的酵母中克隆出三個(gè)不同的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因。花和果實(shí)是植物體中酯類揮發(fā)性成分合成的主要器官，成熟酯類揮發(fā)性成分構(gòu)成了花和果實(shí)特有的香氣，這一過程也與醇酰基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)。Ueda和0gata(1977)發(fā)現(xiàn)香蕉細(xì)胞提取液中的酯類揮發(fā)性香氣成分的合成依賴酰基CoA和酰基轉(zhuǎn)移酶。此后，人們在草莓、蘋果、菠蘿、甜瓜等水果中研究了醇酰基轉(zhuǎn)移酶與酯類揮發(fā)性物質(zhì)合成之間的關(guān)系。這些果實(shí)中酯類物質(zhì)的形成都是在醇酰基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將酰基CoAs中的酰基轉(zhuǎn)移到醇類底物形成了酯。Perezet al.(1993)對4個(gè)草莓品種果實(shí)成熟期間AAT活性的研究表明，各品種AAT活性均隨果實(shí)成熟而增加，但不同品種最大活性差異很大。Shalit et al.(2001)的研究表明，富有香氣的甜瓜品種‘Arava’成熟果實(shí)與未熟果實(shí)中香氣揮發(fā)性成分組成顯著不同。
[0005]近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在花和果實(shí)中克隆了幾個(gè)醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因。研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)構(gòu)和功能類似的酶是酰基轉(zhuǎn)移酶類(EC 2.3.1.X)進(jìn)化來的一個(gè)新類別，都屬于酰基轉(zhuǎn)移酶類的BAHD基因家族。植物中最早分離出的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因來自Clarkia breweri花，編碼苯甲醇乙酰轉(zhuǎn)移酶,調(diào)控了乙酸苯甲酯的代謝,屬于酰基轉(zhuǎn)移酶的 BAHD 家族(Dudareva et al, 1998)0 D，Auria et al.(2002)米用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)文庫搜索結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)技術(shù)從仙女扇中獲得了 BEBT的cDNA的全長。該基因與植物酰基轉(zhuǎn)移酶基因序列具有很大的同源性，屬于酰基轉(zhuǎn)移酶中的BAHD家族。沒妨在花和受傷的葉片中都有表達(dá)，表明苯甲酸芐酯在植物防御機(jī)制中也起一定作用。
[0006]Aharoni et al.(2000)首次采用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)文庫搜索結(jié)合植物揮發(fā)性成分譜，利用cDNA芯片從成熟草莓果實(shí)中分離了一個(gè)新的與芳香氣味相關(guān)的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因說義幾它具有催化中鏈脂肪酸乙酸酯形成的能力。在Charentais甜瓜中克隆出兩個(gè)具有高度同源性(87%，在蛋白水平確定)的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因，CM-AATl (GenBankCAA94432)和 CM-AAT2 (GenBank AF468022)，編碼 461 個(gè)氨基酸，分子量分別為 51.5KD 和51.8 KD, pi分別為8和8.5。轉(zhuǎn)化酵母發(fā)現(xiàn)CM-AATl具有合成酯類揮發(fā)性成分的能力，而CM-AAT2沒有檢測到醇酰基轉(zhuǎn)移酶活性。Shalit et al.(2003)在含有1834個(gè)單基因的玫瑰花EST數(shù)據(jù)庫中檢索，發(fā)現(xiàn)3個(gè)可能的EST序列與已知的其它來源的BAHD醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因相似。其中一個(gè)cDNA被命名為編碼一個(gè)458個(gè)氨基酸殘基的多肽，其分子量51.8 KD, pi 5.45，屬于BAHD酰基轉(zhuǎn)移酶家族。通過同源性比較，這個(gè)蛋白序列與草莓SAAT蛋白具有69%的同源性。Boatright et al.(2004)在對矮牽牛的研究中，運(yùn)用功能基因組學(xué)的方法克隆出苯甲醇/苯基乙醇苯甲酰轉(zhuǎn)移酶基因(沒/貨/)。該基因的氨基酸序列與煙草的BEBT基因和仙女扇的說以7都具有較高的同源性。苯甲醇/苯乙醇苯甲酰基轉(zhuǎn)移酶以苯甲酰輔酶A為苯甲酰基供體，以苯甲醇和苯基乙醇為前體，將苯甲酰基轉(zhuǎn)移至苯甲醇和苯乙醇上，形成苯甲酸芐酯和苯甲酸苯乙酯。Li et al.(2006)通過RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)分離了喬納金蘋果和金冠蘋果果實(shí)中的醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因，分別命名為MdAAn和MdAA 2ο其全長分別為:1,639 bp和1，628 bp，二者在氨基酸水平上的同源性為94.26%。序列比對發(fā)現(xiàn)量偏72也含有BAHD基因家族和其它已知醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因共有的保守區(qū)=HXXXD和FGWG。聚類分析發(fā)現(xiàn)，MdAAT2蛋白與同屬薔薇科仁果類的梨果實(shí)醇酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白親緣關(guān)系最近，而與檸檬、草莓、玫瑰花等醇酰基轉(zhuǎn)移酶蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，Yoshioka和Hashimoto (1981)在酵母研究中發(fā)現(xiàn)醇酰基轉(zhuǎn)移酶是定位在細(xì)胞膜上，并對該酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了初步的研究。D’ Auria (2002)認(rèn)為大部分BAHD家族的成員被認(rèn)為定位于細(xì)胞質(zhì)。Fujiwara et al.(1998)對三花龍膽)的 5_0_ 葡萄糖苷芳香族酰基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行免疫定位研究發(fā)現(xiàn)其主要分布于上表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。然而 Yu et al.(2008)發(fā)現(xiàn)蔡藜苜猜(ifet/icago trunca tula )中的 BAHD 家族的 MtMaTl 則是定位于細(xì)胞核中。
[0007]近年來，植物花香次生生物合成的基因操作已成為一個(gè)熱門的研究領(lǐng)域。Guterman et al.(2006)將從月季中克隆的也導(dǎo)入矮牽牛中，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因植株中產(chǎn)生乙酸卞酯和乙酸苯乙酯。這為采用基因工程技術(shù)培育香花品種提供了一條有效的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]目前，國內(nèi)對醇酰基轉(zhuǎn)移酶與花香形成的研究鮮見報(bào)道，直到本專利申請前沒有發(fā)現(xiàn)對百合花香基因報(bào)道。克隆花香基因是對百合花香形成機(jī)理研究的前提，揭示百合花香的分子機(jī)理可以增加花香。這為采用基因工程的方法培育具濃郁花香植物新品種提供了一條嶄新的途徑。本發(fā)明的目的是分離克隆西伯利亞百合百合花中攜帶的一個(gè)控制酯類花香成分苯甲酸乙酯的基因。
[0009]本發(fā)明另一目的在于提供上述基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0010]本發(fā)明另一目的在于提供含有上述基因的載體。
`[0011]本發(fā)明另一目的在于提供含有上述載體的轉(zhuǎn)基因植物。
[0012]本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述基因在產(chǎn)生分子標(biāo)記及其在選育對花香品種中的應(yīng)用，以及上述基因編碼的蛋白質(zhì)在制備香精和藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)上述目的:
一種百合酯類花香基因所述基因的全長cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，全長cDNA序列長1380bp ;基因的全長DNA序列如SEQ ID NO: 2所示，全長DNA序列長1472bp。
[0014]百合酯類花香基因賦予姜花花朵沉香醇香味，而且百合酯類花香基因77在有香味的百合花組織表達(dá)，在無香味的百合品種中不表達(dá)，并且其表達(dá)與花發(fā)育
進(jìn)程有關(guān)。該基因基因編碼區(qū)共1380bp (即全長cDNA序列)，推測其編碼459個(gè)氨基酸，蛋白分子量為50 kDa。在這個(gè)基因序列中有HXXXD和DFGWG兩個(gè)保守序列，DNA全長核苷酸序列長度為1472bp，包含I個(gè)內(nèi)含子，位于第442?533位，共有92bp，且剪切位置均符合“GT-AG法則”。通過原核表達(dá)并用反應(yīng)底物乙醇和苯甲酰輔酶A反應(yīng)體外生成苯甲酸乙酯。
[0015]一種百合酯類花香基因編碼的蛋白質(zhì)，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示。
[0016]一對用于擴(kuò)增 百合酯類花香基因ZoW77的引物，引物序列如SEQ ID NO: 10?11所示。
[0017]一種重組載體，在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入，權(quán)利要求1所述百合酯類花香基因的序列。所述出發(fā)載體可以是本【技術(shù)領(lǐng)域】中經(jīng)常用到的所有類型的植物表達(dá)載體，優(yōu)選地，本發(fā)明所用的植物表達(dá)載體為pMOGMON植物表達(dá)載體。
[0018]一種包含如上所述重組載體的重組菌。一種包含如上所述重組載體的細(xì)胞系。
[0019]一種轉(zhuǎn)基因植物，含有如上所述載體。
[0020]如上所述百合酯類花香基因LoAATl的應(yīng)用，具體為將百合酯類花香基因LoAATl連接到植物轉(zhuǎn)化載體中，然后導(dǎo)入百合或其它植物細(xì)胞中，獲得表達(dá)所述百合酯類花香基因LoAATl的轉(zhuǎn)基因花香品種。
[0021]如上所述百合酯類花香基因的應(yīng)用，具體為根據(jù)該基因產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，用于鑒定百合或其它植物的花香基因型。
[0022]如上所述百合酯類花香基因編碼的蛋白質(zhì)在制備香精和藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明同樣包括將花香基因的主要結(jié)構(gòu)部分有效地連接上合適的調(diào)節(jié)序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個(gè)組成型表達(dá)的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下和細(xì)胞發(fā)育的任何時(shí)期表達(dá)。這種組成型表達(dá)的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個(gè)組織特異性表達(dá)的啟動子或發(fā)育時(shí)期特異性表達(dá)的啟動子或精確環(huán)境誘導(dǎo)的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導(dǎo)型啟動子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時(shí)期的不同都可以改變該基因的表達(dá)，同樣，也可以將該基因的表達(dá)限定在某一個(gè)組織內(nèi)，使由該基因誘導(dǎo)的抗性反應(yīng)得到人為的控制。其中環(huán)境條件包含病蟲害的攻擊、高低溫和光等，組織和發(fā)育時(shí)期包括葉、果實(shí)、種子和花等。
[0024]根據(jù)本發(fā)明提供的基因序列信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過以下方法容易地獲得與等同的基因:(1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；(2)以基因片段為探針篩選姜花或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據(jù)基因序列信息設(shè)計(jì)寡核苷酸引物，用PCR擴(kuò)增的方法從姜花或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲取；(4)在LoAATl基因序列的基礎(chǔ)上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學(xué)合成的方法獲得該基因。
[0025]本發(fā)明提供的百合花香基因具有重要的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用之一是將所述的LoAATl基因序列連接到任何一種植物轉(zhuǎn)化載體，用任何一種轉(zhuǎn)化方法將花香基因?qū)氚俸匣蚱渌参锛?xì)胞，可獲得表達(dá)所述基因的轉(zhuǎn)基因花香，從而應(yīng)用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構(gòu)建到植物轉(zhuǎn)化載體中，可以對所述基因或其調(diào)控序列適當(dāng)修飾，也可以在其轉(zhuǎn)錄起始密碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強(qiáng)植物產(chǎn)生花香和增強(qiáng)抗性的能力。
[0026]本發(fā)明提供的花香基因的另一個(gè)應(yīng)用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，包括但不限于SNP (單核苷酸多態(tài))、SSR (簡單序列重復(fù)多態(tài))、RFLP (限制性內(nèi)切酶長度多態(tài))、CAP(切割擴(kuò)增片段多態(tài))。用這些標(biāo)記可鑒定百合或其它植物的花香基因型，用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明將克隆的花香基因轉(zhuǎn)入無花香的植物，有助于產(chǎn)生新的花香植物。特別是可以用轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)花香基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時(shí)間。花香基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種中不能在植物種間轉(zhuǎn)移花香基因的問題的前提。另外，本發(fā)明能夠進(jìn)一步提供或應(yīng)用利用上述DNA片段獲得的花香的轉(zhuǎn)基因植株和相應(yīng)的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉(zhuǎn)化的植株或由這類植株獲得的種子。可以用有性雜交的方式將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)入其他的植株。
[0028]說明書附圖
圖1.LoAATl在花香苯甲酸乙酯釋放量不同的百合品種中的表達(dá)；A:百合花瓣花香主成分苯甲酸乙酯的釋放量；B:百合花瓣ZW777表達(dá)水平；C:不同的百合品種。
[0029]圖2.LoAATl在花器官不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)和不同組織表達(dá)特異性；A =Siberia百合不同器官表達(dá)水平；B = Siberia百合花朵不同花發(fā)育時(shí)期苯甲酸乙酯的釋放量；C:Siberia百合不同開花時(shí)期；D:Siberia百合花瓣77表達(dá)量；E:Siberia百合花尊LoAATl表達(dá)量；F:Siberia百合雄蕊77表達(dá)量；G:Siberia百合雌蕊表達(dá)量。
[0030]圖3.重組蛋白體外酶催化反應(yīng)；A:pET-28a-重組蛋白體外酶催化反應(yīng)產(chǎn)物色譜和質(zhì)譜分析圖:苯甲酸乙酯標(biāo)樣色譜和質(zhì)譜分析圖。
[0031]圖4.77轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR檢測圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。除非特別說明，實(shí)施例中采用的試劑和方法均為本領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑和方法。
[0033]實(shí)施例1 LoAATl基因cDNA和DNA全長的獲得:
S1.百合花瓣RNA的提取:稱取0.2g百合盛開期花瓣，加液氮迅速研磨成粉末狀，快速轉(zhuǎn)入4°C存放的加有0.5 mL2 % CTAB (含0.1 %的巰基乙醇)提取液的2 mL離心管中，振蕩至徹底混勻；室溫放置5min,平放離心管,使表面積最大；4°C 12000rpm離心lmin,上清轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。加入0.lmL5M NaCl,溫和混勻；加入0.3mL氯仿,上下顛倒混勻；4°C 12000rpm離心lOmin，取上層水相轉(zhuǎn)入新的無RNase離心管。加入與所得水相等體積的預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置IOmin,平放離心管,使表面積最大；4°C 12000 rpm離心lOmin，棄掉上清，注意不要倒出沉淀，加I mL 75%乙醇(DEPC水配制)洗滌RNA沉淀，顛倒混勻；4°C 5000 rpm離心3min,倒出液體,注意不要倒出沉淀。剩余的少量液體短暫離心，然后用槍頭吸出，室溫晾干2?3 min ;加入30μ? DEPC H2O,反復(fù)吹打，混勻，充分溶解RNA。放于_80°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]S2.以百合盛開期的花瓣總RNA作為模板，用生工M-MuLV First cDNA SynthesisKit合成第一鏈cDNA。據(jù)GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物Fl:TCTCCAAGGCTCTGGTGTTCTA(T/C) TA(T/C) CC(A/C/G/T) (G/T/C) T ;如 SEQ ID NO:4 所示。下游引物 Rl:TGCATGAACCTGATAGCGAAG (A/G) (T/C) (A/G) AA (A/C/G/T) CC (A/C/G/T ) CC ;如SEQ ID N0:5所示。并交由上海生物工程公司合成。以上述合成的cDNA為模板采用TaKaRaPCR Amplification Kit進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，具體方法按照說明書進(jìn)行。PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、57°C復(fù)性30s、72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。在一 20°C下保存?zhèn)溆谩CR反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產(chǎn)物中是否含有目的片段條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用手術(shù)刀在紫外燈下切出含有目的片段的膠塊，用DNA凝膠回收試劑盒(Agarose Gel DNA Purification Kit,TaKaRa)進(jìn)行回收，回收方法基本參照試劑盒說明書。之后要對回收產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測，看其回收效果及大致濃度，以便保證后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。根據(jù)回收的目的片段大小及其有效濃度，取適量回收純化的產(chǎn)物與克隆載體連接，載體選用TaKaRa pMD18_T載體，目的DNA與克隆載體的摩爾比控制在3:1左右，具體操作按說明書進(jìn)行。在16°C下恒溫連接3?6h，連接時(shí)間的長短視目的片段的長度而定。提前將感受態(tài)細(xì)胞DH5 a (TaKaRa)從一80°C冰箱取出，并置于冰盒中待其自然融化，將IOPL連接液全量加入感受態(tài)細(xì)胞的離心管中，冰浴30min后，42°C水浴熱激50s，迅速冰上放置2?5min，然后加入37°C預(yù)溫的SOC液體培養(yǎng)基890μ?補(bǔ)足到lmL，混勻后37°C下180rpm振蕩培養(yǎng)Ih。在含lOOPg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板表面上涂30μ?的X-gal (20mg/mL)和30μ? IPTG (20mg/mL),然后涂布適量轉(zhuǎn)化液，待轉(zhuǎn)化液完全被吸收后倒置于37°C恒溫箱中過夜培養(yǎng)，約16h后觀察結(jié)果，通過X-gal/IPTG藍(lán)白斑篩選白色菌落，并初步鑒定重組質(zhì)粒，平板置于4°C保存。通過藍(lán)白斑初步篩選后，通常選6個(gè)菌斑搖菌后提取質(zhì)粒，用于進(jìn)一步鑒定。用滅菌的牙簽從LB平板培養(yǎng)基上挑取白色單菌落接種于含有l(wèi)OOPg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于控溫震蕩水浴搖床上37°C、240rpm振蕩過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒DNA小抽試劑盒(上海博亞生物有限公司)提取質(zhì)粒，步驟按說明書上方法進(jìn)行。對所提質(zhì)粒進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較質(zhì)粒大小并將明顯滯后的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切(及7? I /Hind III, TaKaRa)分析。在37°C下酶切Ih后，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。隨意選送酶切鑒定后含目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，采用美國ABI377序列分析儀。所得的序列在NCBI進(jìn)行比對和同源性分析。
[0035]根據(jù)已得到的cDNA片段序列,利用生物軟件Primer Premier 5.0在靠近片段序列的 3'端設(shè)計(jì)兩個(gè)特異引物，3' -RACE 1st Primer:GAGTTGCTCTTCGACGTTGAG ;如 SEQ IDNO:6 所示；3' -RACE 2nd Primer:CGCTGATCCTAATTCAGGTGACTC ;如 SEQ ID NO: 7 所示。經(jīng)生物軟件Oligo 6.0分析后交由上海生物工程公司合成。以01igo(dT)-3'末端錨定引物為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。將合成的cDNA第一鏈作為模板，用3' —回引物與3'末端錨定引物進(jìn)行3'末端PCR擴(kuò)增。PCR程序?yàn)?94°C預(yù)變性3min;94°C變性30s、復(fù)性30s (溫度視具體而定)、72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；然后72°C總延伸lOmin。第一次PCR反應(yīng)液稀釋10-100倍后作為模板，用3' 二回巢式引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳初步檢測PCR產(chǎn)物中是否含有目的片段條帶。經(jīng)過回收、檢測，隨機(jī)選送酶切鑒定后含目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成，采用美國ABI377序列分析儀。把測序結(jié)果與cDNA片段的序列進(jìn)行拼接分析，判斷其是否是cDNA片段序列3'的延伸。
[0036]同樣利用已知的cDNA片段序列，在靠近其5'末端的位置設(shè)計(jì)一對引物，5' -RACE 1st Primer:CGAGCCGAACATTGGCATCAG ;如 SEQ ID N0:8 所示；3' -RACE 2ndPrimer:TAGAACACCAGAGCCTTGGA ;如SEQ ID NO:9所示。采用Y端加接頭的方法進(jìn)行，經(jīng)回收、檢測，隨機(jī)選送酶切鑒定后含目的片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列測定。測序工作交由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。把測序結(jié)果與cDNA片段的序列進(jìn)行拼接分析，判斷其是否是cDNA片段序列5'的延伸。
[0037]對所得到的片段序列、3 和5 序列進(jìn)行Blast分析后，利用DNAstar軟件包的SeqMan程序?qū)⑷齻€(gè)片段進(jìn)行比對拼接，拼接所得序列即為萜類合成酶基因cDNA全長序列。拼接所得的cDNA全長序列再在NCBI上對核苷酸序列及推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性比較和分析。
[0038]基因cDNA全長序列的犾得:
根據(jù)已經(jīng)得到的基因cDNA全長，設(shè)計(jì)并合成上下游引物，Hctpsl-Pl:ATGGCATCATCCCTCACTTTCTC ;如SEQ ID NO: 10所示。Hctpsl_P2:CTA GAGGGCAGAAGCAATAAAC ；如 SEQ ID NO: 11 所示。以百合 cDNA 為模板，采用 TaKaRa PCR Amplification Kit 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、復(fù)性30s (溫度視具體而定)、72°C延伸3min，35個(gè)循環(huán)；然后72°C總延伸lOmin。取5PLPCR產(chǎn)物在含溴化乙錠0.8%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，紫外光下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0039]應(yīng)用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(TaKaRa),按照操作說明，將PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物溶解于25PLElution Buffer中。取純化回收產(chǎn)物4gL、pMD20_TVector ?μ?、連接液Solution I 5μ?,組成10μ?的連接體系，16°C下連接過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有X-gal、IPTG、氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜；然后挑選白色克隆斑20個(gè)于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、240rpm擴(kuò)大培養(yǎng)16-24h ;用質(zhì)粒DNA小抽試劑盒(上海博亞生物有限公司)提取質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳比較質(zhì)粒大小并將明顯滯后的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。從鑒定出的陽性重組質(zhì)粒中隨機(jī)挑選，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測定。獲得1AAH基因的全長cDNA序列和全長DNA序列，根據(jù)cDNA序列推測出其蛋白序列。
[0040]實(shí)施例2 77基因的表達(dá)分析:
不同品種百合花瓣，西伯利亞百合不同發(fā)育時(shí)期花瓣及西伯利亞百合不同組織部位的RNA提取使用Trizol法(TaKaRa)，熒光定量PCR采用SYBR green(TaRaKa)法，染料法的具體原理見說明書。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，按熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，用Primer premier 5.0分別設(shè)計(jì)引物，通過熒光定量PCR檢測其是否有錯(cuò)配或引物二聚體及其擴(kuò)增效率，從中選擇一對最佳引物，Pl:ATTGTGGTGCCAGTTTGCTTGC ；如 SEQ ID NO: 12 所示。P2:CCCTTTTACCCTTCGTTGAACTTC ;如 SEQ ID NO: 13 所示。內(nèi)參基因ACT根據(jù)Real-time PCR引物的設(shè)計(jì)原則，用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)引物，ACT-Pl:TTCGTGTTGCACCAGAAGAGdnSEQ ID NO: 14所示，ACT-P2:TGAATGGCGACATACATGGCAG ;如 SEQID N0:15所示。通過Real-time PCR進(jìn)行檢測，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以檢測其擴(kuò)增效率(E)是否在90?110%范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。以各樣品的cDNA為模板，在ABI熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以ddH20為陰性對照。反應(yīng)體系為SYBR PremixEx Taq (TaKa Ra)10.0 μ?，上游引物(10 μΜ) 0.4 μ?，下游引物(10 μΜ) 0.4 μ?, cDNA 2.0μ?, ddH20 7.2μ?。反應(yīng)程序?yàn)?94°C，30 s ；94°C, 15 s ；55°C,30 s ；72°C,30 min;40個(gè)循環(huán)，94°C 15 s, 72°C 30 s, 0.4°C /s融解曲線分析。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，用 2-AAct 法(2 (-Delta Delta C(T)), Livak and Schmittgen, 2001)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)算百合1AAH在不同樣品中的表達(dá)情況。基因表達(dá)分析結(jié)果見圖1和圖2。從圖1和圖2中可以看出:
77僅在有花香主成分苯甲酸乙酯釋放的百合品種花瓣中表達(dá)，沒有改成分釋放的品種中不表達(dá)，且表達(dá)量與花香釋放量成顯著正相關(guān)'LoAATl僅在百合花器官中表達(dá)，在根、莖和葉等營養(yǎng)器官不表達(dá)，該基因的表達(dá)量與不同開花時(shí)期成顯著正相關(guān)，苯甲酸乙酯釋放量最多盛花期花瓣77表達(dá)量最 高，而不香的蕾期則不表達(dá)，說明77是控制百合花香主成分苯甲酸乙酯合成釋放的關(guān)鍵基因。
[0041]實(shí)施例3 汝基因原核表達(dá):
S1.根據(jù)所得到基因的cDNA全長，用包含feMlI和Afoi I酶切位點(diǎn)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用Takara回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物直接用和AbtI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠回收目的片段。pET-28a原核表達(dá)載體用Bamm和AbtI限制酶進(jìn)行雙酶切1%瓊脂糖凝膠回收大片段。于16°C連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(M.coli ) DH5 α感受態(tài)細(xì)胞；提取質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序鑒定后，獲得重組原核表達(dá)載體。
[0042]S2.用經(jīng)鑒定的重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Rosetta)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于5mL LB (含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)接100 μ?種子液于新鮮的IOOml(含25 mg /L Kan, 34 mg /L Chl)的LB培養(yǎng)基中，37°C 180rpm培養(yǎng)4?6h，測OD值至0.4?0.6后用一定量的IPTG (0.1?0.2mM)在14?18°C誘導(dǎo)14?16h。同時(shí)取另一對照組其中未加IPTG誘導(dǎo)。離心收集菌體，用5ml裂解buffer (50mM磷酸buffer pH 8.0)懸浮細(xì)胞，將菌體冷卻，置于冰上超聲波破碎細(xì)胞。12000rpm，4°C離心IOmin,將上清移至新的離心管中，用雙蒸水清洗沉淀一次,再用5mL裂解buffer懸浮沉淀。分別取上清和沉淀各50 μ?，保存與-20°c，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。配制12.5% SDS聚丙烯酰胺凝膠，按照順序上樣。分別用60V和120V的電壓對濃縮膠和分離膠的進(jìn)行電泳。電泳完畢，考馬斯亮藍(lán)染色30min，再用脫色液脫色I(xiàn)?8h，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。
[0043]S3.蛋白的純化:挑取單菌落接種于5ml的液體LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm，培養(yǎng)過夜，后全部轉(zhuǎn)接至500mL的新鮮液體LB培養(yǎng)集中，37°C，180rpm，培養(yǎng)4h，用IPTG (0.1?0.2 mM)，18°C條件下誘導(dǎo)16h后，收集菌體。取200μ?菌體于離心管中，4°C保存，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。用5mL的裂解buffer懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，置于冰上使菌體始終保持冷卻，超聲波破碎細(xì)胞。10，000 X g，4°C離心20?30 min，收集上清液。取20 μ?的上清于_20°C保存，進(jìn)行SDS-PAGE分析。向5mL細(xì)胞裂解液中加入I?2mL的N1-NTAresin (鎳一次氮基三乙酸樹脂填料)混勻，并低速在4°C搖床上結(jié)合60min。將結(jié)合完全的細(xì)胞裂解液和樹脂混合物裝入層析柱中，移走底部蓋帽收集流出液部分(flow-thixmghfraction,F),取20μ?的流出液，于_20°C保存,進(jìn)行SDS-PAGE分析。用4ml的洗漆buffer洗脫層析柱兩次，收集每部分的洗脫液(wash fraction, W),各取20 PL保存于_20°C冰箱中作SDS-PAGE分析。用0.5mL的洗脫buffer洗柱四次，分別用不同的收集管依次收集每部分的洗脫液(elution fraction, E),分別標(biāo)記為El, E2, E3, E4,各取20μ?進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)SDS-PAGE的檢測結(jié)果，集中含有目標(biāo)蛋白洗脫部分于一個(gè)離心管中，用移液器轉(zhuǎn)移至透析袋中，4°C透析過夜。收集透析后的溶液，加入甘油使蛋白溶液中甘油總含量為20%，并且以200 μ? /管的量進(jìn)行分裝，取微量進(jìn)行SDS-PAGE蛋白濃度檢測，其余的放于_70°C超低溫冰箱進(jìn)行保存?zhèn)溆谩?br> [0044]S4.醇酰基合成酶酶活性鑒定:轉(zhuǎn)接100 μ種子液于新鮮的200mL (含25 mg /LKan, 34 mg /L ChD的LB培養(yǎng)基中，37°C 180rpm培養(yǎng)4-6h，測OD值至0.4-0.6后用一定量的 IPTG (0.1 -0.2mM)在 14 -18°C誘導(dǎo) 14 -16h。5000rpm，4°C離心 5min 離心收集菌體，用5mLbuffer (IOmM MOPS buffer pH 7.0 10%甘油ImM DTT)懸浮細(xì)胞，置于冰上超聲波破碎細(xì)胞。12000rpm，4°C離心20min，將上清移至新的離心管中。
[0045]S5.酶促反應(yīng)及 GC-MS 分析:將 80 μ? 50μΜ pH 8.0Tris-HCl，酶提取液 50μ?，0.05μΜ苯甲酰CoA 20μ?溶液，5.8 μ? 20Mm的乙醇溶液，巰基乙醇溶液2 Pl-PddH2O 842.2PL加入樣品瓶中密封，將75Mm聚二甲基氧烷(PMDS)萃取纖維頭插入玻璃瓶中，28°C水浴lh，頂空固相微萃取，反應(yīng)結(jié)束后將萃取纖維頭放至氣相色譜-質(zhì)譜連用儀中進(jìn)行分析，氣相色譜條件為:色譜柱為HP-1NN0WAX柱(30mX0.25mm);載氣為高純氦氣，分流比20:1，柱前壓50 Pa，流量I mL /min ;取樣時(shí)間2min ;程序升溫:柱起始溫度45 °C，保持2min，以5V /min的速度升至80 °C保持lmin,然后以10°C /min的速度升至250°C保持5 min。質(zhì)譜條件為=GC-MS的接口溫度220 °C，電子轟擊源E1、350V ;離子源溫度170 °C ;電子能量70eV ;掃描質(zhì)量范圍35-335aum，采集到的質(zhì)譜圖用WILLEY/MAINLIB庫進(jìn)行分析。原核表達(dá)結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出:以乙醇和苯甲酰CoA為底物的pET-28a- Lo-AATl體外酶催化反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜鑒定為苯甲酸乙酯，與采用苯甲酸乙酯標(biāo)樣色譜和質(zhì)譜圖相一致，說明該基因編碼生成的酶是一種以乙醇與苯甲酰CoA為底物合成苯甲酸乙酯的酶，該基因?yàn)橐掖急郊柞；D(zhuǎn)移酶基因。
[0046]實(shí)施例4 LoAATl對煙草的遺傳轉(zhuǎn)化:
S1.載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化--將1AAn基因的全長CDNA序列用&ORI和漢酶切，回收目的片段；載體pMOGMON用&0RI和漢-bHI酶切，純化回收相應(yīng)大小的片段，連接，轉(zhuǎn)化DH5 α，提質(zhì)粒，酶切鑒定，挑出所需克隆，測序，并將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中。
[0047]S2.煙草轉(zhuǎn)化:將煙草“W38”葉片(0.5 cmX0.5 cm的方塊)在培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2-3 d，用步驟SI得到的OD6tltl 0.5-0.8的農(nóng)桿菌LBA4404菌液，浸染5-lOmin，然后共培養(yǎng)3 d，煙草在含有20 mg/L潮霉素Hyg ,400 mg/L頭孢霉素Cef的培養(yǎng)基上，矮牽牛在含有5 mg/L潮霉素Hyg、400 mg/L頭孢霉素Cef的培養(yǎng)基上，在光照2000-lOOOOLx，25 1:條件下進(jìn)行選擇培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)2-3周后，外植體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞將產(chǎn)生抗性愈傷組織，將材料轉(zhuǎn)入相應(yīng)的選擇分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化出芽培養(yǎng)，待不定芽長至I cm以上時(shí)，切下并插入含有選擇壓的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，每瓶插入2-3棵小苗，進(jìn)行生根誘導(dǎo)。將根長至約4-5 cm健壯小苗，煉苗5-6d，煉苗結(jié)束后，清水洗凈根部培養(yǎng)基，進(jìn)行移栽。[0048]S3.轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA的提取:
S31.取0.2 g材料，加入液氮研磨成粉末，將磨好的材料轉(zhuǎn)入2 ml的離心管中，加入I ml預(yù)熱2 % CTAB提取液(含0.1 %的巰基乙醇)，充分混勻，置于65°C水浴45 min，6-8min 混勻一次。10000 rpm,離心 5 min。
[0049]S32.冷至室溫，取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1 )，輕輕混勻至溶液成乳化狀，10000 rpm,離心5 min。
[0050]S33.取上清，加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，-20°C放置30min。10000 rpm離心5min,棄上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2-3次。加入200 μ I TE溶液溶解。
[0051]S34.加入1/10體積NaAC (3 mol/L)和2倍體積的無水乙醇，_20°C放置2h以上。12000 rpm離心5min,棄上清液,沉淀用70%乙醇洗漆2-3次,室溫干燥沉淀。用20-50 μ?ΙΧΤΕ 溶解，_20°C保存。
[0052]S4.轉(zhuǎn)基因煙草PCR檢測:以轉(zhuǎn)化菌液為陽性對照，未轉(zhuǎn)化DNA作陰性對照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增體系。
[0053]上游引物F2:CTT CTA CAC AGC CAT CGG TCC AGA ;如 SEQ ID NO: 16 所示。
[0054]下游引物R2:GAT GTA GGA GGG CGT GGA TAT GTC ；如 SEQ ID NO: 17 所示。
[0055]反應(yīng)體系(20μυ:轉(zhuǎn)基因植株 DNA ?μ? (20ng"50ng) ； 10 X buffer 2μ? ；MgCl2 (2.5mM) 2μ? ；Taq 酶 0.2μ? ； dNTP (2.5mM) 2μ? ;引物各加 ΙΟμΜ ;加無菌水至 25μ?。
[0056]反應(yīng)條件-MV，4分鐘-MV，30秒；54°C，30秒；72°C，I分鐘；30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘。篩選出PCR陽性植株(圖4)。
[0057]S5.轉(zhuǎn)基因煙草植株揮發(fā)性物質(zhì)SPME-GC/MS分析:采用固相微萃取一氣相色譜質(zhì)譜方法分析。將煙草小苗從基質(zhì)中取出，洗凈，置于2.5 L密封箱中，加入31.6 ng/ L(100μΜ SNP處理為316 ng/ L)的癸酸乙酯10 PL作為內(nèi)標(biāo)物，用聚四氟乙烯襯里的硅橡膠墊密封，插入100 Mm聚二甲基娃氧燒(PMDS)萃取纖維頭,于25°C溫下頂空取樣30 min。米用FINNIGAN TRACE MS氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國)進(jìn)行分析。色譜條件為DB-5石英毛細(xì)管柱長30m,內(nèi)徑0.25 mm,液膜厚0.25 Mm,載氣He，柱頭壓力68.974 kPa，程序分流/不分流(LSS)進(jìn)樣口溫度250°C。程序升溫:50°C，保持2 min ;以3°C /min的升溫速度升至250°C，保持30 min。在SPME分析中，PSS進(jìn)樣口設(shè)定為不分流進(jìn)樣方式，不分流時(shí)間為2 min，襯管采用1.5 mm內(nèi)徑的玻璃管，脫附時(shí)間為3 min ;在DHS進(jìn)樣口分流比為20:1，進(jìn)樣量為2.0 μ?。GC/MS傳輸線溫度為250°C，質(zhì)量掃描范圍是30-350 aMm，掃描時(shí)間0.3 S，掃描間隔0.2s，EI離子源溫度170°C，EI電子能量70 eV，光電倍增管(PMT)電壓230 V，對采集到的質(zhì)譜圖用WILEY、MAINLIB、REPLIB及NISTDEM0 4個(gè)庫進(jìn)行分析，并根據(jù)各組分峰面積與內(nèi)標(biāo)癸酸乙酯峰面積之比定量，確定煙草揮發(fā)性物質(zhì)的化學(xué)成分。結(jié)果表明:野生型煙草中主要的揮發(fā)物是乙酸葉醇酯和葉醇，含量分別為0.241 Pg/gFW.h和0.263 Pg/gFW.h ;而轉(zhuǎn)基因植株中有苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯和2-羥基苯甲酸甲酯，它們揮發(fā)量分別是0.020 μδ/gFW.h、0.349 Pg/gFW.h和0.044 Pg/gFW.h，其中苯甲酸乙酯是主要的揮發(fā)成分。這說明醇酰基轉(zhuǎn)移酶基因77在煙草中正義表達(dá)改變了煙草葉片揮發(fā)性成分的組成，苯甲酸乙酯揮發(fā)量有較大提高。
【權(quán)利要求】
1.一種百合酯類花香基因ZoA/7，其特征在于，所述基因的全長CDNA序列如SEQ IDNO:1所示；基因的全長DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。
2.一種百合酯類花香基因編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO:3 所示。
3.一對用于擴(kuò)增百合酯類花香基因的引物，其特征在于，引物序列如SEQ IDNO: 10?11所示。
4.一種重組載體，其特征在于，在出發(fā)載體的多克隆位點(diǎn)插入，權(quán)利要求1所述百合酯類花香基因77的序列。
5.一種包含權(quán)利要求4所述重組載體的重組菌。
6.一種包含權(quán)利要求4所述重組載體的細(xì)胞系。
7.—種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，含有權(quán)利要求4所述載體。
8.權(quán)利要求1所述百合酯類花香基因的應(yīng)用，其特征在于，將百合酯類花香基因77連接到植物轉(zhuǎn)化載體中，然后導(dǎo)入百合或其它植物細(xì)胞中，獲得表達(dá)所述百合酯類花香基因的轉(zhuǎn)基因花香品種。
9.權(quán)利要求1所述百合酯類花香基因的應(yīng)用，其特征在于，根據(jù)該基因產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，用于鑒定百合或其它植物的花香基因型。
10.權(quán)利要求2所述百合酯類花香基因編碼的蛋白質(zhì)在制備香精和藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H5/00GK103436537SQ201310369037
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】范燕萍, 劉芳, 尹君樂, 余讓才, 王文君, 李滿意, 黃麗君, 岳躍沖, 玉云祎 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)