一種高產酸性多糖的蟲草菌絲體的培養方法及酸性多糖的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種高產酸性多糖的蟲草菌絲體的培養方法及酸性多糖。屬于醫藥領域，培養方法的特征在于，取種子液于液體養基中(含0.03-1230ug/mL鹽)，在15℃-28℃條件下，培養10-14天。酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，總多糖的含量不少于85％，糖醛酸占總糖的質量百分比為4.68-16.8％，硫酸根占總糖的質量百分比為1.56-11％，多糖的重均分子量為30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60％。用本發明方法培養出的菌絲體中酸性多糖抗血管活性強，培養原料來源豐富，培養成本低，發酵溫度容易達到，具有較大的經濟價值。
【專利說明】一種高產酸性多糖的蟲草菌絲體的培養方法及酸性多糖
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫藥領域，涉及一種高產酸性多糖的蟲草菌絲體的培養方法及酸性多糖。
【背景技術】
[0002]冬蟲夏草(Cordyc印S)，又名蟲草、冬蟲草、夏草冬蟲。屬于真菌界，真菌門，子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬。主要分布在我國青海、西藏、四川、云南、貴州、甘肅海拔4000米左右的高海拔地區。天然蟲草生長環境特殊，價格較高，人們已用生物發酵技術培養蟲草菌絲體來替代冬蟲夏草。其成分、藥用價值與冬蟲夏草類似，具有抗炎，抗氧化，抗流感病毒，免疫調節，降血糖，抗腫瘤和抗血管生成等活性，是冬蟲夏草的理想代用品，菌絲體中的蟲草多糖藥用價值很高，主要由甘露糖，葡萄糖和半乳糖組成。
[0003]現研究的酸性多糖(如含有糖醛酸和/或硫酸根)的活性有很多，其中抗血管生成活性與酸性多糖中的糖醛酸和硫酸根有關。現有技術中已經報道如果將巖藻糖過硫酸化,可以增加巖藻糖本身的抗血管及抗腫瘤的能力。眾所周知,若沒有血液供應,腫瘤細胞由于缺血缺氧會發生死亡，腫瘤尺寸不會超過2-3mm3。在化療間期腫瘤細胞加速再增殖過程中，若給予抗血管生成治療可抑制殘存腫瘤細胞的再增殖，可達到提高化療藥物治療效果，延緩疾病進展的目的。
[0004]目前，多數的報道集中在蟲草多糖的提取方法，蟲草的培養條件，通過改變培養條件，提高蟲草中的某一種活性成分如蟲草多糖、蟲草素等的含量。如專利CN201210353679公開了一種從蛹蟲草 提取蟲草素和多糖的方法。專利CN200910093938公開了一種蛹蟲草菌種的培養方法。專利CN201110184265公開了一種以青稞為主要原料培養蛹蟲草的方法，使蛹蟲草的有效成分蟲草素的含量由現有的0.5%提高到1%，蟲草酸含量由現有的6.1%提高到9%，蟲草多糖含量由現有的7.4%提高到10.5%，蛹蟲草的有效成分含量總提高200-250%。只有少數報道中提到糖醛酸的存在，目前沒有關于蟲草中硫酸多糖存在的報道。用現有的培養方法培養的菌絲體，其蟲草多糖的抗血管活性并不理想。

【發明內容】

[0005]本發明涉及一種高產酸性多糖的蟲草菌絲體的培養方法，培養出的蟲草菌絲體產品中含有較高濃度的酸性多糖，與普通培養基培養的多糖相比糖醛酸含量提高了0.12-2.99倍，硫酸根含量提高了 0.44-9.19倍。該酸性多糖的抗血管生成活性比普通培養方法得到的多糖活性提高了 0.1-4倍，并且培養溫度易達到，培養原料來源豐富，培養成本低，適合任何蟲草菌絲體，具有較高的應用價值和較好的市場前景。
[0006]實現上述發明目的的技術方法是:
[0007]1.一種培養高產酸性多糖的蟲草菌絲體的方法，具體包括如下步驟:
[0008](I)菌株擴增:采用固體培養基將菌株擴增；
[0009](2)種子液培養:從固體培養基上挑取菌絲體于液體培養基中培養；[0010](3)發酵培養:取種子液于液體養基中(含0.03-1230ug/mL鹽)，在15°c-28°c條件下，培養10-14天；
[0011 ]所述的鹽包括 MgCl2、MnCl2、KCl、NaCl、Na2SO4,K2SO4,MgSO4,MnSO4 中的一種或幾種的混合物。
[0012]2.進一步地，步驟(3)中鹽的含量為170-610ug/mL，培養溫度為16°C _23°C或25°C -28O。
[0013]3.更進一步地步驟(3)中鹽的含量為210-500ug/mL，培養溫度為27°C或19°C。
[0014]4.以該方法培養出的菌絲體，其中的酸性多糖，其特征在于，酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，總多糖的含量不少于85%，糖醛酸占總糖的質量百分比為4.68-16.8 %,硫酸根占總糖的質量百分比為1.56-11 %,多糖的重均分子量為30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60% ；
[0015]所述的中性糖包含甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，鼠李糖和阿拉伯糖；
[0016]所述的氨基糖包含葡萄糖胺；
[0017]所述的糖醛酸包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
[0018]與現有技術相比，本發明具有以下有益技術效果:
[0019](1)本發明涉及的培養蟲草菌絲體的培養方法，發酵溫度接近室溫，容易達到，培養原料來源豐富，培養成本低，易于大規模培養，具有較大的經濟價值。
[0020](2)由本發明所述培養方法培養出的菌絲體高產酸性多糖，多糖中糖醛酸和硫酸根含量高，與普通培養基培養的多糖相比糖醛酸含量提高了 0.12-2.99倍，硫酸根含量提高了 0.44-9.19倍，經細胞實驗研究表明該酸性多糖比普通培養方法得到的多糖抗血管生成活性提高了 0.1-4倍。
[0021](3)用本發明方法培養出的菌絲體可作為冬蟲夏草的替代品，保護了天然蟲草資源，從根本上解決了野生冬蟲夏草資源缺少的問題。
[0022](4)本發明方法適用于任何菌絲體，應用范圍廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1是酸性多糖糖醛酸含量測定結果。
[0024]圖2是酸性多糖的分子量及分子量分布測定結果。
[0025]圖3是酸性多糖單糖組成測定結果。
[0026]圖4是酸性多糖的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細闡述，給出的實施例僅為了闡明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0028]實施例所用的蟲草菌株均選用蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali),菌種編號
3.7845,購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0029]實施例1
[0030]菌株擴增:采用PDA固體培養基將菌株擴增，27 °C，培養7天；
[0031]種子液培養:從固體培養基上挑取菌絲體于150mL馬鈴薯液體培養基中，放搖床上 180r/min, 27°C，培養 10 天；
[0032]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有170ug/mL MgCl2)，23°C，培養10天。
[0033]實施例2
[0034]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0035]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有0.03ug/mL MgCl2)，28°C，培養10天。
[0036]實施例3
[0037]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0038]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有0.09ug/mLMnCl2和0.05ug/mL KCl)，15°C，培養 14 天。
[0039]實施例4
[0040]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0041]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有520ug/mLKCl)，26°C，培養14天。
[0042]實施例5
[0043]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0044]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有210ug/mLNaCl)，27°C，培養14天。
[0045]實施例6
[0046]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0047]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有500ug/mLNa2S04)，19°C，培養10天。
[0048]實施例7
[0049]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0050]發酵培養；取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有1230ug/mL K2SO4)，15°C，培養12天。
[0051]實施例8
[0052]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0053]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有610ug/mL K2SO4)，25°C，培養12天。
[0054]實施例9
[0055]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0056]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有850ug/mL MgSO4)，24°C，培養12天。
[0057]實施例10`[0058]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0059]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中(含有600ug/mL MnSO4)，16°C，培養10天。[0060]實施例11
[0061]菌株擴增與種子液培養步驟同實施例1 ;
[0062]發酵培養:取6mL種子液于200mL馬鈴薯液體養基中，培養基中不含鹽，27°C，培養10天。
[0063]將實施例1-11每種條件培養2瓶，培養出的蟲草菌絲體分別按照下列提取方法提取多糖。
[0064](I)脫脂:將同一條件培養液合并，懸蒸濃縮至1/4體積，加入4倍無水乙醇脫脂，800C回流3h，冷卻后離心lOmin，取沉淀，再加入5倍80%乙醇脫脂，反復三次，烘干，稱重。
[0065](2)冷水提:取脫脂產物2g，加入40mL水，磁力攪拌3h，離心lOmin，反復三次。上清過0.22um濾膜，MW3500透析袋透析,透析液過0.22um濾膜,濃縮,加入4倍無水乙醇醇沉，離心取沉淀，干燥，稱重。
[0066]試驗一抗血管生成活性分析:
[0067]96孔板每孔加入基底膜Matrigel 55uL,在37°C下固化60min。每孔加入200uL人類臍靜脈內皮細胞懸液(3X IO4/孔)，其中含有lOOug/mL實施例1_11的樣品，設置一組只有細胞懸液，不加多糖的空白組。37°C，5% CO2培養12h。用倒置差像顯微鏡40倍鏡下記錄圖像。統計形成的管數，并都與不加多糖的空白組進行百分比。結果見表1。
[0068]表1抗血管生成活性檢測結果
[0069]
【權利要求】
1.一種培養高產酸性多糖的蟲草菌絲體的方法，具體包括如下步驟: (1)菌株擴增:采用固體培養基將菌株擴增； (2)種子液培養:從固體培養基上挑取菌絲體于液體培養基中培養； 其特征在于它還進行: (3)發酵培養:取種子液于液體養基中(含0.03-1230ug/mL鹽)，在15°C _28°C條件下，培養10-14天; 所述的鹽包括 MgCl2、MnCl2、KCl、NaCl、Na2SO4, K2SO4,MgSO4,MnSO4 中的一種或幾種的混合物。
2.根據權利要求1所述的一種培養高產酸性多糖的蟲草菌絲體的方法，具體包括如下步驟: (1)菌株擴增:采用固體培養基將菌株擴增； (2)種子液培養:從固體培養基上挑取菌絲體于液體培養基中培養； 其特征在于它還進行: (3)發酵培養:取種子液于液體養基中(含170-610ug/mL鹽)，在16°C -23 °C或25 °C -28 °C條件下，培養10-14天。
3.根據權利要求1所述的一種培養高產酸性多糖的蟲草菌絲體的方法，具體包括如下步驟: (1)菌株擴增:采用固體培養基將菌株擴增； (2)種子液培養:從固體培養基上挑取菌絲體于液體培養基中培養； 其特征在于它還進行: (3)發酵培養:取種子液于液體養基中(含210-500ug/mL鹽)，在27°C或19°C條件下，培養10-14天。
4.用權利要求1至3任意一項所述的蟲草菌絲體的培養方法培養出的菌絲體，其中的酸性多糖，其特征在于，酸性多糖中包含中性糖，氨基糖和糖醛酸，總多糖的含量不少于85%，糖醛酸占總糖的質量百分比為4.68-16.8%，硫酸根占總糖的質量百分比為.1.56-11%，多糖的重均分子量為30KD-6000KD，其中50KD以下的多糖含量不少于60% ； 所述的中性糖包含甘露糖，葡萄糖，半乳糖，木糖，鼠李糖和阿拉伯糖； 所述的氨基糖包含葡萄糖胺； 所述的糖醛酸包含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸。
【文檔編號】A01G1/04GK103548571SQ201310538386
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】張麗娟, 曾洋洋, 韓章潤, 邱培菊, 蘭瑩 申請人:中國海洋大學