金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法
【專利摘要】本發明提供金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，包括無菌無性系的建立，快速繁殖，生根培養，試管苗的假植與移栽，離體保存步驟。金銀花具有較高的保健、觀賞、藥用及生態功能，為我國特有的名貴中藥材之一，數有中藥之中“青霉素”的美譽。本發明提供了金銀花組培中存在問題的解決方案和最佳培養技術。本發明的方法增殖速度達1:4-6，移栽成活率達90%以上，用多效唑（PP333）與吲哚丁酸（IBA）配合使用得到了99%的生根效果，得到的芽生成的試管苗遺傳性穩定，用此方法建立的金銀花無菌無性系在培養過程幾乎無污染發生，且外植體在培養基上很快恢復生長，為大規模工廠化生產金銀花優質種苗提供了技術支撐。
【專利說明】金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法
[0001]所屬領域:
[0002]本發明屬于生物【技術領域】，具體地，涉及一種金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法。
【背景技術】:
[0003]金銀花是具有較高的保健、觀賞、藥用及生態功能為一體的物種，為我國特有的名貴中藥材之一，數有中藥之中“青霉素”的美譽。特別是在2003年抗擊SARS的防治中所起的作用，受到人們關注，成為忍冬科資源植物中的重點開發對象。現代藥理研究表明:金銀花具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤，增強免疫及解熱、抗炎、利膽保肝、降血脂、抗生育、止血抗潰瘍等多種生物活性。市場上產銷兩旺、干花蕾價格逐年上漲。但種苗特別是高產優質品種的種苗奇缺。20世紀80年代人們曾經開始了金銀花組培研究，但直到近幾年有關研究才逐漸增多。但目前金銀花組培存在的問題限制了金銀花產業的形成與發展。主要問題是:①外植體滅菌困難；②繼代時期短(1-2個月)且離體保存無人做；③試管移栽成活率低，試管育苗成本高組織培養的試管苗真正大規模應用于生產的很少，僅見李紅等(2007)金銀花組培工廠化生產與栽培管理技術的報道，但工廠化培育種苗的整體水平不高，關鍵生產環節技術薄弱，造成繁殖系數低，大大限制了名貴品種的推廣應用。迄今，現有技術中未見有金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法的報道。

【發明內容】
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[0004]針對現有技術存在的上述不足之處，本發明旨在提供一種金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法。提供金銀花組培中存在問題的解決方案、技術和最佳培養條件，克服現有技術存在的工廠化培育種苗的整體水平不高，繁殖系數低的缺點，為大規模工廠化生產金銀花優質種苗提供技術支撐。
[0005]為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案:
[0006]金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，包括無菌無性系的建立，快速繁殖，生根培養，試管苗的假植與移栽，離體保存步驟，所述無菌無性系的建立是取金銀花芽條或幼莖，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞水溶液滅6min,用無菌水沖洗干凈,接入培養基中進行快速繁殖，即將幼莖消毒后，去掉葉片，切段，放在培養基①上培養25d，取下莖段上所發出的芽在培養基②上培養60d，(繼代周期為30d繼代I次)再在培養基③上經過30d的培養；所述生根培養是在培養基③上培養，3-4叢芽/瓶接種30d后，選取芽條高度在3cm以上的，截取下來放在培養基④上培養14d-17d開始生根；所述試管苗的假植與移栽是在移栽過渡前，挑出生根培養20d試管瓶苗，先放在簡易蔭棚內，IOd后移入栽苗基質中，在剛移苗1-2周內用塑料布蓋在移出苗的上面保濕，待苗長出新根或新葉后去掉塑料布，并粗放管理培育30d后移入大田，所述離體保存用試管生根苗的培養物類型進行離體保存。
[0007]所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，所述培養基采用:基本培養基為1/2MS (MS大量元素減半，其余成分與MS同)，誘導莖段長出腋芽的培養基為①1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L ;誘導幼莖段叢芽增殖的培養基為②1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.01mg/L 和③ 1/4MS+BA0.3mg/L ;誘導生根的培養基為④ l/2MS+IBA3mg/L+PP3330.5mg/L ;培養基①②③糖濃度為3%，培養基④糖濃度為2% ;培養條件均為:所有培養基PH5.8，培養溫度26±2°C，光照時間12h.cf1，光照強度20-40 μ mol.M-2.S-1。
[0008]所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，所述栽苗基質選用新黃土與腐葉土各半，混合均勻，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，將混合均勻的栽苗基質澆勻，以栽苗基質手攝成團，手散開團也散開為準，用塑料布密封24小時后打開，將栽苗基質裝入移苗袋中待用。
[0009]所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，所述移栽是將取出培養瓶內試管苗，用流水沖掉試管苗根部所粘瓊脂，不傷及葉片和根尖，移入裝滿基質的塑料袋中，澆足定根水放在沒有陽光直射的地面。
[0010]所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，所述試管苗的假植與移栽是在移栽過渡前，挑出生根培養20d，高度4.5-5.5cm，根長度0.5cm以下的試管苗，先放在棚上復蓋石棉瓦、四周圍70%遮蔭網、棚內分兩臺的簡易蔭棚內，放置培養瓶以便加強光照，IOd后移入栽苗基質中。
[0011]所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，所述離體保存是用試管生根苗在4°C下暗培養，在培養過程中，使金銀花培養物原培養條件下每20d-30d繼代一次，可延長繼代周期至I年。
[0012]與現有技術相比，本發明的方法不僅降低了工作量，還避免了連續繼代引起遺傳性改變的可能，也為離體種質庫增加了容量，還為金銀花的優良基因的保存和可持續利用提供了保證。增殖速度達1:4-6，移栽成活率達90%以上，用多效唑(PP333)與吲哚丁酸(IBA)配合使用得到了 99%的生根效果，得到的芽生成的試管苗遺傳性穩定，用此方法建立的金銀花無菌無性系在培養過程幾乎無污染發生，且外植體在培養基上能很快恢復生長。
【具體實施方式】:
[0013]下面用本發明具體實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此來限定本發明。
[0014]實施例1:
[0015]一、無菌無性系的建立
[0016]材料學名:金銀花Lonicera japonica Thnnb.[0017]外植體材料的滅菌是組培中的重要環節，因金銀花莖中空，外面被疏柔毛和疏腺毛，在組培初始滅菌較困難。既要求徹底殺死外材表面的微生物，又要盡可能少傷害外材組織和表面細胞，通過對殺菌程序的研究達到了理想效果，具體做法如下:
[0018]1、野外或大田篩選出高產的質優的金銀花Lonicera japonica Thnnb.活植株(株型緊湊，每個葉腋開花蕾數達30朵左右的植株)，移入盆內放在室內養護，先封頂(去掉頂部莖尖)有利腋芽的長出，IOd澆水I次，水為1/4MS (MS大量元素減少為1/4，其余成分相同但去掉有機成 分)+BA0.25mg/L組成，約IOd腋芽現出，并生長為新的幼莖，當幼莖長約4cm時,取下待用。
[0019]2、將野外采取的金銀花Lonicera japonica Thnnb.優株(株型緊湊,每個葉腋開花蕾數達30朵左右的植株)當年生莖段，長約30cm插入裝水的棕色瓶內，培養l-2d換水I次，水為自來水，約IOd腋芽生長為新的幼莖，當幼莖帶有2-3個節時，切下待用。
[0020]上述兩種方式取下的芽條(或幼莖)先用70%乙醇消毒20s，排出外材毛與毛之間空氣，便于消毒水液能進入達到材料滅菌徹底的目的。再用0.1%升汞水溶液滅6min，用無菌水沖洗干凈，即可接入事先準備好的培養基中。用此方法建立的金銀花無菌無性系在培養過程幾乎無污染發生，且外植體在培養基上很快恢復生長。
[0021]本發明的其中一個具體選擇的材料來源于湖南培育的“艮翠蕾”良種，引種到重慶后，又篩選培育出的“渝翠蕾I號”，從渝翠蕾I號種植田內，用肉眼選出株型緊湊，每個葉腋開花蕾數達30朵左右的植株作材料。
[0022]二、培養條件:基本培養基為1/2MS (MS大量元素減半，其余成分與MS同)，誘導莖段長出腋芽的培養基為:①1/2MS+BA0.5mg/L(單位以下同)+ΝΑΑ0.2 ;誘導幼莖段叢芽增殖的培養基為:②1/2MS+BA0.5+IBA0.01和③1/4MS+BA0.3 ;誘導生根的培養基為:④1/2MS+IBA3+PP3330.5 ;培養基①②③糖濃度為3%，培養基④糖濃度為2%。培養條件均為:培養基PH為5.8，培養溫度26±2°C，光照時間12h.cf1，光照強度20-40 μ mol.m_2.S-1。
[0023]三、快速繁殖
[0024]幼莖經消毒后，去掉葉片，修剪成長約Icm帶I節的切段，放在培養基①上培養，約經25d培養后，每個莖段節處長出腋芽1-2個，誘導率為100%，每塊材料的芽的平均數為1.7個。取下莖段上所發出的芽在培養基②上培養60d (繼代周期為30d)，便建成了金銀花快速繁殖無性系，增殖速率可達1:3，再在培養基②上經過30d的培養，增殖速度可達1:4-6。達到金銀花工廠化生產的要求。叢芽再生方式有兩種:一種是莖段葉腋長出，切下后采取無菌扦插的方式，可連續增殖下去；另一種方式為在莖段基部切口處形成叢生芽，產生位置仍在葉腋處，因為此處接觸培養基營養供給充足，芽發生和生長很快，所以是叢生芽的形式出現，在這種培養基上培養的材料，無愈傷組織產生，說明這種無性快繁方式得到的芽生成的試管苗遺傳性是穩定的。
[0025]當金銀花的增殖叢芽瓶數達到所需數量后，(這要根據市場需年產苗數和每月計劃生產的苗數來決定。)，控制存架母瓶數很關鍵，因為存架增殖瓶數過多在一定繼代周期內因人力或設備不足，造成增殖并不能按時完成，積壓瓶苗品質下降，丟棄會造成浪費。若存架增殖瓶數量少了，造成生產任務完不成，會帶來經濟上的損失和信譽降低。因此要嚴格控制存架增殖總瓶數。另外要考慮在種苗培養過程中會發生增殖苗長勢不好，芽條枯死，葉片黃化和污染等現象，在制定生產計劃時要比實際需求的苗數增加10%或20%的存架增殖瓶數。
[0026]四、生根培養
[0027]在培養基③上培養，3-4叢/瓶芽接種30d后，每瓶可得到高度達3-4cm以上芽條5個左右，同時也有增殖，月增殖速度為1:4。選取芽條高度在3cm以上的，截取下來放在培養基④上培養，14d-17d便開始生根，隨著培養時間延長，達99%生根率，每株2-5條根，根粗約0.2cm，植株生長健壯。
[0028]目前現有技術報道生根試驗中，一方面生根率不高費時長，另一方面在培養基中使用了 NAA，在誘導根出現的同時，產生大量的愈傷組織，這種試管苗產生的根不是由中柱鞘產生的內起源的根，不定根與植株之間不存在緊密的連系，移栽后是不可能成活的。本發明創造性的用多效唑(PP333)與吲哚丁酸(IBA)配合使用得到了理想的生根效果。
[0029]五、試管苗的假植與移栽
[0030]經過生根培養的金銀花試管苗，所處的環境優越，如營養供應充足，溫度濕度合適，移出培養瓶要行自養生長，加上環境中溫度濕度的變化，很難適應，造成試管苗移栽成活率不高。為解決這個問題，本發明在移栽過渡前，挑出生根培養20d試管瓶苗(試管苗高度5cm左右，根長度0.5cm以下)，放在陽臺上所建的簡易蔭棚內。棚高I米，長度依需要來定，上復蓋石棉瓦，棚的四周圍70%遮蔭網，棚內分兩臺，放置培養瓶以便加強光照，約IOd便可移入栽苗基質中。栽苗基質選用新黃土與腐葉土各半，混合均勻，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，將混合均勻的栽苗基質澆勻，以栽苗基質手攝成團手散開團也散開為準，用塑料布密封24小時后打開，將栽苗基質裝入移苗袋中待用。將加強光照后的瓶苗打開瓶蓋小心取出培養瓶內試管苗。不要傷及葉片和根尖，用流水沖掉試管苗根部所粘的瓊脂，移入裝滿基質的塑料袋中，澆足定根水放在沒有陽光直射的地面。在剛移苗1-2周內可用塑料布蓋在移出苗的上面，保濕，以后逐步打開，待苗長出新根或新葉后去掉塑料布并粗放管理培育約30d移入大田，成活率90%以上。
[0031]六、離體保存
[0032]首先對離體保存中培養物類型進行選擇，本發明在室溫下，對金銀花叢生芽和試管苗進行了繼代周期的比較(以培養物葉片黃化，芽條的枯死超過20%為標準，確定繼代與否，結果顯示:叢生芽繼代周期為30d，而試管生根苗繼代周期為4個月。本發明以試管生根苗的培養物類型進行離體保存。主要采取緩慢生長保存(Slow growth conservation)的中短期離體保存的方式，在試驗了生長抑制劑CCClmg/L(單位下同)、5、10 ；PP3330.5、1、5和ΑΒΑ0.5后，沒得到理想的結果 (試管苗生長被抑制的同時出現了愈傷組織，葉片黃化和芽條枯死等現象)。本發明又采用降低培養溫度的方法(暗培養4°C)進行離體保存。可延長繼代周期至I年。在培養過程中，原培養條件下金銀花培養物20d-30d必須繼代。
[0033]綜上，本發明的方法不僅降低了工作量，還避免了連續繼代引起遺傳性改變的可能，也為離體種質庫增加了容量，還為金銀花的優良基因的保存和可持續利用提供了保證。增殖速度達1:4-6，移栽成活率達90%以上，用多效唑(PP333)與吲哚丁酸(IBA)配合使用得到了 99%的生根效果，得到的芽生成的試管苗遺傳性穩定，用此方法建立的金銀花無菌無性系在培養過程幾乎無污染發生，且外植體材料在培養基上很快恢復生長。
【權利要求】
1.金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，包括無菌無性系的建立，快速繁殖，生根培養，試管苗的假植與移栽，離體保存步驟，所述無菌無性系的建立是取金銀花芽條或幼莖，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞水溶液滅菌6min,用無菌水沖洗干凈,接入培養基中進行快速繁殖，即將幼莖消毒后，去掉葉片，切段，放在培養基①上培養25d，取下莖段上所發出的芽在培養基②上培養60d，繼代周期為30d繼代I次，再在培養基③上經過30d的培養；所述生根培養是在培養基③上培養，3-4叢芽/瓶接種30d后，選取芽條高度在3cm以上的，截取下來放在培養基④上培養14d-17d開始生根；所述試管苗的假植與移栽是在移栽過渡如，挑出生根培養20d的試管瓶苗，先放在簡易陰棚內，IOd后移入栽苗基質中，在剛移苗1-2周內，用塑料布蓋在移出苗的上面保濕，待苗長出新根或新葉后去掉塑料布，培育.30d后移入大田，所述離體保存是用試管生根苗的培養物類型進行離體保存。
2.如權利要求1所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，其特征在于所述培養基采用:基本培養基為1/2MS (MS大量元素減半，其余成分與MS同)，誘導莖段長出腋芽的培養基為①1/2MS+BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L ;誘導幼莖段叢芽增殖的培養基為② 1/2MS+BA0.5mg/L+IBA0.01mg/L 和③ 1/4MS+BA0.3mg/L ;誘導生根的培養基為④l/2MS+IBA3mg/L+PP3330.5mg/L ;培養基①②③糖濃度為3%，培養基④糖濃度為2% ;培養條件均為:所有培養基PH5.8，培養溫度26±2°C，光照時間12h.cf1，光照強度20-40 μ mol.πm-2.S'
3.如權利要求1所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，其特征在于所述栽苗基質選用新黃土與腐葉土各半，混合均勻，再用1份甲醛+水20份制成消毒液，將混合均勻的栽苗基質澆勻，以栽苗基質手攝成團，手散開團也散開為準，用塑料布密封24小時后打開，將栽苗基質裝入移苗袋中待用。
4.如權利要求1所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，其特征在于所述移栽是將培養瓶內取出的試管苗，用流水沖掉試管苗根部所粘瓊脂，不傷及葉片和根尖，移入裝滿基質的塑料袋中，澆定根水放在沒有陽光直射的地面。
5.如權利要求1所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，其特征在于所述試管苗的假植與移栽是在移栽過渡前，挑出生根培養20d，高度4.5-5.5cm，根長度0.5cm以下的試管苗，先放在棚上復蓋石棉瓦、四周圍70%遮蔭網、棚內分兩臺的簡易蔭棚內，放置培養瓶以便加強光照，IOd后移入栽苗基質中。
6.如權利要求1所述的金銀花種苗的快速繁殖和離體保存方法，其特征在于所述離體保存是用試管生根苗在4°C下暗培養，在培養過程中，使金銀花培養物原培養條件下每.20d-30d繼代一次，可延長繼代周期至I年。
【文檔編號】A01H4/00GK103535285SQ201310537723
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月4日 優先權日:2013年11月4日
【發明者】何俊, 程治英, 李春芳, 周少明, 李培 申請人:中國科學院昆明植物研究所