一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不定芽的方法
【專利摘要】本發明公開了一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不定芽的方法，采用了主要加入不同植物生長調節劑的1/2MS液體培養基進行不定芽誘導的技術特征，建立了大馬士革玫瑰固體-液體-固體培養體系，愈傷組織誘導率為100%，不定芽分化率為90.9%，生根率為100%，移栽成活率為100%。本發明方法可以減輕大馬士革玫瑰愈傷組織褐化程度，降低在培養過程中發生變異的幾率，簡單易行，解決了大馬士革玫瑰組織培養過程中再生率比較低的問題，效率高，為大馬士革玫瑰的組織培養和高頻離體再生體系的建立提供了重要的技術基礎。
【專利說明】一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不定芽的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組織培養【技術領域】，具體涉及一種通過懸浮培養提高大馬士革不定芽分化的方法。
【背景技術】
[0002]大馬士革玫瑰(Rosadamascena Mill.),蓄薇科(Rosales),蓄薇屬(Rosaceae)，是提取玫瑰精油和玫瑰水的重要原料，主要應用在醫療保健、高檔香水、美容用品、食品添加劑、煙草等行業。該品種玫瑰中含有300多種化學成分(如香茅醇、香葉醇等數百種芳香物質、有機酸等有益美容的物質)，還有人體需要的18種氨基酸及微量元素等，其中對人體有效成分高達120多種，比國內已有的玫瑰品種多了 80余種，是世界公認的優質玫瑰品種。但由于適應種植區域有限，其產量和價格滿足不了日益增長的國際市場的需求，為了提高大馬士革玫瑰的繁殖速度，緩解目前玫瑰傳統繁殖方式不能滿足市場需要的困境，采用新的方法提高大馬士革玫瑰的再生率是大勢所趨。
[0003]由于大馬士革玫瑰具有顯著的研究價值，目前研究重點主要在植物非試管快速繁殖和玫瑰精油提取等方面，大馬士革組織培養技術卻一直停滯不前，主要由于大馬士革玫瑰分化難，愈傷組織易褐化，培養時間長等因素造成。這些不利因素使大馬士革研究嚴重滯后，所以，通過懸浮培養促進不定芽的分化率，從而建立穩定的植物高頻再生體系，對于大馬士革玫瑰的深入研究具有積極作用。目前，大馬士革玫瑰(Rosa damascene Mill.)組織培養已有少量報道，吳新海和薛志忠通過帶葉芽莖段大馬士革玫瑰(Rosa damascenaMill.)研究了在不同激素濃度下植株的繼代增殖和生根培養(安徽農學通報，2010)，趙蓓蓓和劉松等通過帶腋芽莖段獲得了大馬士革玫瑰的再生植株(園藝學報，2011)，而通過對疏松愈傷組織進行懸浮培養促進大馬士革玫瑰不定芽分化的研究國內外未有報道。

【發明內容】

[0004]為了克服大馬士革玫瑰再生率不高的問題，本發明采用懸浮培養進行誘導愈傷組織分化；本發明目的在于提供一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不芽的方法，為大馬士革規模化快繁和遺傳操作研究奠定基礎。該方法以大馬士革玫瑰14天齡無菌葉片為外植體，建立固體誘導愈傷-液體誘導分化-固體促進生根的體系，同時調節誘導各階段的光照強度，可以防止大馬士革愈傷組織的褐化，降低在培養過程中發生變異的幾率，并且極大的促進芽的分化。
[0005]為了實現上述任務，本發明采取如下的技術解決方案得以實現:
[0006]一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不芽的方法，其特征在于，按以下步驟進行:
[0007](I)外植體的獲得
[0008]取長出約14d的幼嫩葉片在自來水下沖洗干凈，接著用75%酒精表面消毒30~40s,再在0.1%升萊溶液中滅菌 2~6min,用無菌水漂洗3~5次,最后在無菌條件下將葉片剪成四周有傷口、尺寸為IcmX Icm大小的葉片。
[0009]( 2)愈傷組織的誘導
[0010]將剪切好的葉片接種在誘導愈傷組織培養基上，在溫度為25°C ±2°C、光照培養條件為500-2000LX的條件下培養，3周后將愈傷組織轉到新鮮培養基上繼代培養，每2周繼代一次；所述的誘導愈傷組織培養基的組成為:在常規的MS培養基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7% 的瓊脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，(3-5) mg.L-1 的 2，4_D，(0.l-l)mg.L-1 的 6-BA，IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 調為 5.8-6.2。
[0011](3)單細胞分散[0012]稱取Ig新鮮疏松的愈傷組織，加入濃度為0.1%的果膠酶(溶于培養液或者
0.6mol/L的甘露醇溶液中，pH調至3.5)，黑暗中25°C中靜置12_16h，再用電磁攪拌器低速攪動幾分鐘，即可獲得細胞懸液，然后用血球計數板進行計數，參照所測得的單位愈傷組織的細胞數目，稱取適量的愈傷組織，放入液體培養基的三角瓶中，在50rpm，25°C ±2°C連續振蕩培養3周后，用100目的尼龍網過濾，可獲得95%左右的單細胞。濾液用1500rpm的速度離心5min，離心后將2/3上清液倒掉，剩余的1/3搖勻，形成細胞懸液。
[0013](4)細胞懸浮培養誘導不定芽
[0014]離心后將2/3上清液倒掉，剩余的1/3搖勻，將細胞懸液倒入三角瓶中，根據需要的起始密度，補定量的新鮮液體1/2MS分化培養液，在150ml三角瓶含有40ml液體1/2MS分化培養液，搖床為50rpm，在溫度為25°C ±2°C、光照強度為1000_2500Lx條件下，每天光照16h，進行誘導不定芽的形成；所述的液體1/2MS分化培養液的組成為:在1/2MS液體培養基中加入(1.5-3) mg.171 的 TDZ, (0.05-0.5)mg L-1 的 NAA, (0.1-1.0)mg L-1 的 6-BA，IOmg.I/1 的 AgNO3, (0.1-0.3) mg/L 的水解酪蛋白，pH 調至 5.8-6.2。
[0015]接種密度為IO5個/L，每Ild繼代一次，篩選在液體分化培養基中繼代2-3次的愈傷組織細胞系，將有綠色芽點細胞團從液體1/2MS分化培養基中取出，轉入1/2MS固體分化培養基中繼續培養，2-3周形成不定芽，所述的1/2MS固體分化培養基成分為:常規的1/2MS固體培養基中附加1.0mg.L-1的6-BA，0.5mg.L-1的ΝΑΑ，質量濃度為0.7%的瓊脂，質量分數為3%的蔗糖，pH調至5.8-6.2。
[0016](5)苗的生根
[0017]待芽長至2-3cm，將誘導得到的芽剪下，插入誘導生根培養基中進行培養，所述的誘導生根培養基的組成為:在常規的1/4MS固體培養基中加入0.5mg.L—1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的瓊脂，0.1%~0.3%的活性炭；培養溫度為250C ±2°C、光強為20001x、光照16h/天，培養2-3周后即可獲得大量組培苗。
[0018]采用本發明的方法，大馬士革不定芽分化率可高達90.9%。與傳統固體培養相比，通過利用固-液-固的生長體系和調節光照強度，極大的抑制了愈傷組織的褐化，降低在培養過程中發生變異的幾率，促進愈傷組織生長和提高不定芽分化率。
【具體實施方式】
[0019]以下結合發明人給出的實施例對本發明作進一步的詳細說明。
[0020]在以下實施例中，所述的MS培養基(或者1/2MS培養基或者1/4MS培養基)是目前使用最普遍的培養基，本領域的技術人員均可獲得，其具有較高的無機鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質營養還能加速愈傷組織的生長。其主要成分為:
[0021 ]大量元素:NH4N03、KNO3> CaC12.2H20、MgSO4.7H20、KH2PO4 ；
[0022]微量元素:K1、H3BO3>MnSO4.4Η2。、ZnSO4.7Η20、Na2Mo04.2Η20、CuSO4.5Η20、CoCl2.6Η20 ；
[0023]鐵鹽=FeSO4.7Η2。；Na2-EDTA.2Η20 ；
[0024]有機成分:肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇(維生素B6)、鹽酸硫胺素(維生素BI)、甘氨酸。
[0025]實施例1:
[0026](1)外植體的獲得
[0027]取長出14d左右的幼嫩葉片在自來水下沖洗干凈，接著用75%酒精表面消毒30~40s,再在0.1%升萊溶液中滅菌2~6min,用無菌水漂洗3~5次,最后在無菌條件下將葉片剪成四周有傷口、約為IXlcm大小葉片。
[0028]( 2)愈傷組織的誘導
[0029]將剪切好的葉片接種在誘導愈傷組織培養基上，3周后將愈傷組織轉到新鮮培養基上繼代培養，每2周繼代一次；所述的誘導愈傷組織培養基的組成為:在常規的MS培養基中加入30g *L_1的鹿糖,0.7%的瓊脂，2mg *L_1的谷氨酰胺,3.0mg *L_1的2,4_D, 1.0mg *L_1的 6-BA, IOmg.1 的 AgNO3, pH 調為 5.8-6.2 ；
[0030]在溫度為25°C ±2°C、光照培養條件為500-2000LX的條件下培養。葉片周圍迅速膨脹，誘導出愈傷組織，誘導率可達100%，所誘導的愈傷組織絕大多數為質地疏松的淡黃色或淡綠色愈傷組織。
[0031](3)單細胞分散
[0032]稱取Ig新鮮疏松的愈傷組織，加入0.1%果膠酶(溶于培養液或者0.6mol/L的甘露醇溶液中，PH調至3.5)，黑暗中25°C中靜置12h~16h，再用電磁攪拌器低速攪動幾分鐘，即可獲得細胞懸液，然后用血球計數板進行計數，參照所測得的單位愈傷組織的細胞數目，稱取適量的愈傷組織，放入液體培養基的三角瓶中，在50rpm，25°C ±2°C連續振蕩培養3周后，用100目的尼龍網過濾，可獲得95%左右的單細胞。濾液用1500rpm的速度離心5min，離心后將2/3上清液倒掉，剩余的1/3搖勻，形成細胞懸液。
[0033](4)細胞懸浮培養誘導不定芽
[0034]離心后將2/3上清液倒掉，剩余的1/3搖勻，將細胞懸液倒入三角瓶中，，根據需要的起始密度，補定量的新鮮1/2MS分化培養液，150ml三角瓶含有40ml液體1/2MS分化培養液，搖床為50rpm，在溫度為25°C ±2°C、光照強度為1000_2500Lx條件下，光照16h/天，進行誘導不定芽的形成；
[0035]所述的液體1/2MS分化培養液的組成為:在液體1/2MS培養基中加入2.0mg.1的 TDZ,0.5mg.L 1 的 NAA，1.0mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.3mg.L 1 的水解酪蛋白，PH 調至 5.8-6.2。
[0036]接種密度為IO5個/L，每Ild繼代一次，篩選在液體分化培養基中繼代2-3次的愈傷組織細胞系，將有綠色芽點細胞團從液體1/2MS分化培養基中取出，轉入固體1/2MS分化培養基中繼續培養，2-3周形成不定芽，該種1/2MS固體分化培養基成分為:常規的1/2MS培養基中附加1.0mg.I/1的6_BA，0.5mg.1的ΝΑΑ，0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，pH調至5.8-6.2。不定芽的誘導率可達90.9%。
[0037](5)苗的生根
[0038]待芽長至2-3cm，將誘導得到的芽剪下，插入誘導生根培養基中進行培養，所述的誘導生根培養基的組成為:在常規的1/4MS固體培養基中加入0.5mg.L—1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的瓊脂，0.1%~0.3%活性炭；培養溫度為25°C ±2°C、光強為20001x、光照16h/天，生根率為100%，培養2-3周后即可獲得大量組培苗。
[0039]實施例2:
[0040]( I)外植體的獲得同實施例1中方法。
[0041](2)愈傷組織的誘導過程同實施例1，本實施例與實施例1所不同的是，所述的誘導愈傷組織培養基的組成為:在常規的MS培養基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7%的瓊脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，4.0mg.L-1 的 2,4-D, 0.5mg.L-1 的 6-BA, IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 調為5.8 ~6.2 ;
[0042]在溫度為25°C ±2°C、光照培養條件為500-2000LX的條件下培養。葉片周圍膨大，誘導出愈傷組織，誘導率達100%，所誘導的愈傷組織絕大多數為質地不疏松的黃色或綠色愈傷組織。
[0043](3)單細胞分散方法同實施例1中所述方法。
[0044](4)細胞懸浮培養誘導不定芽過程同實施例1，本實施例與實施例所不同的是進行誘導不定芽的形成；所述的液體1/2MS分化培養液的組成為:在液體1/2MS培養基中加入
1.5mg.L 1 的 TDZ, 0.1mg.L 1 的 NAA，0.5mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.3mg.L 1 的水解酪蛋白，pH調至5.8-6.2。
[0045]接種密度為IO5個/L，每Ild繼代一次，篩選繼代2~3次的愈傷組織細胞系，將有綠色芽點細胞團從液體1/2MS分化培養基中取出，轉入固體1/2MS分化培養基中進行壯苗生長，2-3周形成不定芽，不定芽分化率為79.5%，該種1/2MS固體分化培養基成分為:常規的1/2MS培養基中附加1.0mg.L-VBA，。.5mg.L^1NAA, 0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，PH調至5.8。
[0046](5)苗的生根過程同實施例1。
[0047]實施例3:
[0048]( I)外植體的獲得同實施例1中方法。
[0049](2)愈傷組織的誘導過程同實施例1，本實施例與實施例1所不同的是，所述的誘導愈傷組織培養基的組成為:在常規的MS培養基中加入30g.L-1的蔗糖，0.7%的瓊脂，2mg.L-1 的谷氨酰胺，5.0mg.L-1 的 2,4-D, 0.1mg.L-1 的 6-BA, IOmg.L-1 的 AgNO3, pH 調為
5.8-6.2 ；
[0050]在溫度為25°C ±2°C、光照培養條件為500Lx~2000Lx的條件下培養。葉片周圍膨大速度較慢，誘導出愈傷組織，誘導率達100%，所誘導的愈傷組織絕大多數為質地致密且較硬的綠色愈傷組織。
[0051](3)單細胞分散方法同實施例1中所述方法。
[0052](4)細胞懸浮培養誘導不定芽過程同實施例1，實施例與實施例1所不同的是進行誘導不定芽的形成；所述的液體1/2MS分化培養液的組成為:在液體1/2MS培養基中加入
3.0mg.L 1 的 TDZ, 0.05mg.L 1 的 NAA，0.5mg.L 1 的 6-BA, IOmg.L 1 的 AgNO3,0.1mg.L 1的水解酪蛋白，PH調至5.8-6.2。接種密度為IO5個/L，每Ild繼代一次，篩選繼代2_3次的愈傷組織細胞系，將有綠色芽點細胞團從液體1/2MS分化培養基中取出，轉入固體1/2MS分化培養基中進行壯苗生長，2-3周形成不定芽，不定芽分化率為66.5%，所述1/2MS固體分化培養基成分為:常規的1/2MS培養基中附加1.0mg.L1的6-BA，0.5mg.L1的ΝΑΑ，0.7%的瓊脂，3%的蔗糖，pH調至5.8。
[0053]( 5 )苗的生根 過程同實施例1。
【權利要求】
1.一種適用于大馬士革玫瑰懸浮培養高效誘導不定芽的方法，其特征在于，按以下步驟進行: (1)外植體的獲得 取長出14天的幼嫩葉片在自來水下沖洗干凈，接著用濃度為75%的酒精表面消毒30s~40s,再在濃度為0.1%的升萊溶液中滅菌2min~6min,用無菌水漂洗3~5次,最后在無菌條件下將葉片剪成四周有傷口、且尺寸為IcmXlcm的葉片； (2)愈傷組織的誘導 將剪切好的葉片接種在誘導愈傷組織培養基上，在溫度為25V ±2°C、光照培養條件為500Lx~2000Lx的條件下培養，3周后將愈傷組織轉到新鮮的誘導愈傷組織培養基上繼代培養，每2周繼代一次； 所述的誘導愈傷組織培養基的組成為:以MS培養基為基礎，加入30g -L-1的蔗糖，0.7%的瓊脂，2mg *L_1 的谷氨酰胺，(3 ~5)mg *L_1 的 2,4-D, (0.1 ~l)mg *L_1 的 6-BA, IOmg *L_1的 AgNO3, pH 調為 5.8-6.2 ； (3)單細胞分散 稱取Ig新鮮疏松的愈傷組織，加入濃度為0.1%的果膠酶，黑暗中25°C中靜置12h~16h，再用電磁攪拌器低速攪動幾分鐘，即獲得細胞懸液，然后用血球計數板進行計數，參照所測得的單位愈傷組織的細胞數目，稱取適量的愈傷組織，放入液體培養基的三角瓶中，在50rpm,25°C ±2°C連續振蕩培養3周后，用100目的尼龍網過濾，可獲得95%的單細胞；濾液用1500rpm的速度離心5min，離心后將2/3上清液倒掉，剩余的1/3搖勻，形成細胞懸液； (4)細胞懸浮培養誘導不定芽 將細胞懸液倒入三角瓶中，根據需要的起始密度，補定量的新鮮的液體1/2MS分化培養液，三角瓶含有40ml的液體1/2MS分化培養液，搖床為50rpm，在溫度為25°C ±2°C、光照強度為1000-2500LX條件下，每天光照16h，進行誘導不定芽的形成； 所述的液體1/2MS分化培養液的組成為:以液體1/2MS培養基為基礎，加入(1.5-3)mg.L 1 的 TDZ, (0.05-0.5) mg.L 1 的 NAA, (0.1-1.0) mg.L 1 的 6-BA, 10mg.L -1 的 AgNO3,(0.1-0.3) mg.L-1 的水解酪蛋白，pH 調至 5.8-6.2 ； 接種密度為IO5個/L，每Ild繼代一次，篩選在液體1/2MS分化培養基中繼代2~3次的愈傷組織細胞系，將有綠色芽點細胞團從液體1/2MS分化培養基中取出，轉入固體1/2MS分化培養基中繼續培養，2-3周形成不定芽，該1/2MS固體分化培養基成分為:以1/2MS培養基為基礎，附加1.0mg.1^-ΒΑ,0.5mg.L^1NAA, 0.7%的瓊脂，質量分數為3%的蔗糖，pH調至 5.8-6.2 ； (5)苗的生根 待芽長至2-3cm，將誘導得到的芽剪下，插入誘導生根培養基中進行培養，所述的誘導生根培養基的組成為:以1/4MS培養基為基礎，加入0.5mg -L-1的NAA，2%的蔗糖，0.8%的瓊月旨，0.1%~0.3%的活性炭；培養溫度為25°C ±2°C、光強為20001x、光照16h/天，培養2_3周后即獲得大量組培苗。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的濃度為0.1%的果膠酶加入方法是溶于培養液或者0.6mol/L的甘露醇溶液中，pH調至3.5。
【文檔編號】A01H4/00GK103651131SQ201310654295
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】黃萱, 馮歡, 易姝利, 劉夢昕, 曾潔, 姚靜雯, 賈如, 左佳琪, 謝佳恒 申請人:西北大學