一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法
【專利摘要】本發明公開了一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，包括：1）從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時的新鮮花梗，進行消毒處理；2）無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導及分化培養基上，溫度25±1℃，全黑暗條件下，培養至分化；其中，誘導及分化培養基為：B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2,4-D0.05mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.8g/L，pH5.5；3）將已分化的愈傷組織接種于增殖培養基中，溫度25±1℃，光照時間為12h/天，光照強度為2500lx，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養基為：B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6.8g/L，pH5.5。本發明以花梗為外植體進行愈傷組織的分化及增殖培養，先經過30天的誘導培養，愈傷組織的分化率較高，達到90%；然后經過25天的繼代增殖培養，愈傷組織的增殖系數較高，可以達到1.8，具有很好的實用性。
【專利說明】一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于植物組培【技術領域】，具體涉及一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法。
【背景技術】
[0002]桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，亦稱山桂、巖桂、九里香、木犀，木犀科木犀屬的代表種，常綠灌木至小喬木。它不僅是我國的十大傳統名花之一，而且集綠化、美化、香化為一體，屬觀賞和實用兼具的優良園林、經濟樹種，深受我國人民的喜愛。
[0003]雨城丹桂(Osmanthus fragrans iYucheng Dan’)是丹桂品種群中的一個優良品種，常綠大灌木，樹冠卵形， 花期9月中旬，著花繁密花冠斜展，花色橙紅香味中等，觀賞性極佳。此外環境適應性強，耐高溫較耐寒，對土壤的要求不太嚴格，生長速度快，種植范圍廣，如此之多的優點使之在丹桂家族中成為珍貴的品種。
[0004]以往桂花的繁殖多以嫁接為主，扦插、壓條為輔，繁殖系數小；播種繁殖存在生理后熟等原因，不能滿足生產上的需要；而雨城丹桂花冠雌蕊退化，花后不結實，采用何種途徑使之快速繁育成為很有價值的研究方向。組織培養作為新興的生物繁殖技術，不但繁殖系數大，還能保持品種的優良性狀，同時也是高等植物細胞工程、基因工程和改良的重要基礎之一，可以短時間獲得大量植物材料，從而使雨城丹桂得到快速繁殖與推廣。而目前關于雨城丹桂組織培養快繁體系研究的內容較少，還不能滿足使用需求。

【發明內容】

[0005]發明目的:針對現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，為短時間內獲得大量雨城丹桂小苗提供了科學的培養基配方，豐富了雨城丹桂這一珍貴的桂花品種的組織培養快繁方法，為以后的相關研究提供一些借鑒和參考意義。
[0006]技術方案:為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下:
一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，包括以下步驟:
O從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時的新鮮花梗，進行消毒處理；
2)無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導及分化培養基上，溫度25±1°C，全黑暗條件下，培養至分化；其中，誘導及分化培養基為:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ；
3)將已分化的愈傷組織接種于增殖培養基中，溫度25±1°C，光照時間為12h/天，光照強度為25001x，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L, pH 5.5。
[0007]步驟I)中，從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時，然后用流水沖洗3小時；在水平超凈工作臺的無菌條件下，將沖洗過的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘，再用無菌水仔細沖洗5遍。
[0008]步驟2)中，誘導及分化培養基為:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+瓊脂 6.8g/L，pH5.5。
[0009]采用誘導及分化培養基B5+6-BA2.0~3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L,這種激素配比的培養基配方，經過30天的培養，愈傷組織的分化率較高,達到90%，而且整個花梗變成愈傷組織團狀愈傷，淡黃白色顆粒，狀態較好。
[0010]采用增殖培養基為B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L,這種激素配比的培養基配方，經過25天的培養，愈傷組織的增殖系數較高，可以達到1.8。
[0011]有益效果:與現有技術相比 ，本發明的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，以花梗為外植體進行愈傷組織的分化及增殖培養，采用誘導及分化培養基B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L進行誘導，經過30天的培養，愈傷組織的分化率較高，達到90%，而且整個花梗變成愈傷組織團狀愈傷，淡黃白色顆粒，狀態較好；采用增殖培養基為B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L進行繼代增殖，經過25天的培養，愈傷組織的增殖系數較高，可以達到1.8，具有很好的實用性，可為后期的叢生芽誘導和基因改良工作提供大量的實驗材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是雨城丹桂花梗愈傷組織分化示意圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發明做進一步的說明。
[0014]實施例1
本實施例的雨城丹桂，以幼嫩花梗為外植體的愈傷組織分化及增殖，是先從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時的新鮮花梗，后進行消毒處理，然后將其在無菌操作臺上接種于事先配好的分化培養基上，I個月后將已分化的愈傷組織接種于繼代增殖培養基中進行增殖。
[0015]I)新鮮外植體的選取與消毒滅菌
從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時，然后用流水沖洗3小時；在水平超凈工作臺的無菌條件下，將沖洗過的花梗在75%的酒精中浸泡30秒后，在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘，再用無菌水仔細沖洗5遍。
[0016]2)無菌培養基的制備
誘導及分化培養基:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L，pH 調至 5.5，蔗糖 30g/L，瓊脂 6.8g/L。
[0017]增殖培養基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L, pH 調至 5.5，蔗糖 30g/L，瓊脂6.8g/L。
[0018]培養基分裝后盡快將培養瓶口密封，并及時放入高壓滅菌鍋內進行消毒滅菌。滅菌條件為121°C、0.1MPa下滅菌15分鐘，滅好的培養基從高壓鍋中取出后，放入干凈的準備室中讓其自然冷卻凝固。
[0019]3)接種
將滅菌后的花梗在無菌條件下剪掉兩端成0.5cm左右的小段，接種于誘導及分化培養基上，每瓶接種5個材料。
[0020]4)培養
將接種后的培養瓶放入培養室進行愈傷組織的分化，條件為:溫度25±1°C，全黑暗處理，30天后統計誘導率分別為90% (B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)和80%(B5+6-BA3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L)。其中，該誘導率為成功誘導出愈傷的花梗與花梗總接種數的比值。
[0021]30天后發現，如圖1所示，整個花梗變成愈傷組織團狀愈傷，淡綠色或淺黃綠色的顆粒，狀態較好。有些花梗基部和周圍都形成淡綠色或淺黃綠色的顆粒或團狀物質，經鑒別為分化形成的愈傷組織， 這些花梗就是用此分化培養基成功誘導出愈傷的花梗，
一個月后將分化良好的愈傷組織轉于繼代增殖培養基中，條件為:溫度25土1°C，光照時間為12h/天，光照強度為25001x，30天后統計增殖系數達1.8。其中，增殖系數的計算公式為:
增殖系數=(增殖后愈傷組織重量一增殖前愈傷組織重量)/增殖前愈傷組織重量。
[0022]對比實施例1
方法同實施例1，其中，誘導及分化培養基分別為:MS+6-BA2mg/L+2，4-D0.05mg/L、B5+6-BA1.0mg/L+2, 4_D1.0Omg/L, 30天后統計誘導率僅為20%、50%，同發明中的誘導率達90%差距較大。
[0023]對比實施例2
方法同實施例1，其中，增殖培養基為B5+6-BA1.0mg/L+NAA0.10mg/L，實驗步驟同本發明，30天后統計增值系數僅為0.9，同發明中的增值系數達1.8差距較大。
[0024]因此，本發明的結果為:以幼嫩花梗為外植體接種于誘導及分化培養基:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L中，30天后統計誘導率達90% ;將已分化的愈傷組織接于增殖培養基:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L中，30天后統計增值系數達1.8。
[0025]以上實施例中，B5和MS均為基本培養基，其配方參照分子生物學實驗手冊。其中，B5 培養基配方為:150mg/L NaH2PO4.H20、3000mg/L KN03、150mg/L CaCl2.2H20、134mg/L (NH4) 2S04、250mg/L MgSO4.7H20、37.3 mg/L Na2-EDTA,27.8mg/L FeSO4.7H20、lOmg/L MnSO4.7H20、2mg/L ZnSO4.7H20、0.025mg/L CoCl2.6H20、0.75mg/L KI,0.25mg/LNa2Mo0.2H20、3mg/L H3B03、0.025mg/L CuSO4.5H20、10mg/L 維生素 B1、1.0mg/L 維生素 B6、2.0mg/L 甘氨酸、1.0mg/L 煙酸、100.0mg/L 肌醇、30g/L 鹿糖，pH5.5。
【權利要求】
1.一種雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)從健康茁壯的雨城丹桂樹上，選取盛花期時的新鮮花梗，進行消毒處理； 2)無菌條件下，將處理后的材料接種于誘導及分化培養基上，溫度25±1°C，全黑暗條件下，培養至分化；其中，誘導及分化培養基為:Β5+6-ΒΑ2.0-3.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，ρΗ5.5 ； 3)將已分化的愈傷組織接種于增殖培養基中，溫度25±1°C，光照時間為12h/天，光照強度為25001x，25天繼代增殖一次，即可；其中，增殖培養基為:B5+6-BA3.0mg/L+NAA0.10mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L, pH 5.5。
2.根據權利要求1所述的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于:步驟I)中，從健康茁壯的雨城丹桂樹上選取盛花期時的新鮮花梗，先用加入少量去污粉的自來水浸泡I小時，然后用流水沖洗3小時；在水平超凈工作臺的無菌條件下，將沖洗過的花梗在 75%的酒精中浸泡30秒后,在2%的次氯酸鈉溶液中浸泡3分鐘,再用無菌水仔細沖洗5遍。
3.根據權利要求1所述的雨城丹桂愈傷組織分化及增殖方法，其特征在于:步驟2)中，誘導及分化培養基為:B5+6-BA2.0mg/L+2, 4-D0.05mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6.8g/L，pH5.5。
【文檔編號】A01H4/00GK103733998SQ201310725163
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】王良桂, 楊秀蓮, 王亞莉, 張春霞, 凌敏 申請人:南京林業大學