一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法，屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該方法包括下述步驟：(1)對(duì)大豆種子進(jìn)行表面滅菌處理；(2)將經(jīng)過滅菌的大豆種子在無菌條件下移至YMA瓊脂表面皿中催芽，待種子發(fā)芽后，移至滅菌的濃度為30％的無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第12天收集大豆根系分泌物，即得高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物。本發(fā)明具有確定了無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液最佳濃度為30％，收集時(shí)間為12d時(shí)所收集的大豆根系分泌物能顯著提高大豆根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，進(jìn)而體現(xiàn)其高效促進(jìn)大豆競爭結(jié)瘤效果的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制 備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大 豆根系分泌物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 根瘤菌-豆科植物構(gòu)成的共生體系是自然界生物固氮效率最高的體系，其固氮量 占整個(gè)生物固氮量的3/4,成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要氮源，大豆與大豆根瘤菌的共生體系是生物 固氮中的典型代表。利用大豆根瘤菌接種豆科植物以提高其固氮效率已有100多年歷史， 作為一項(xiàng)節(jié)本增效的農(nóng)業(yè)措施，在許多國家得到了廣泛的應(yīng)用。然而，作為大豆起源地的中 國，大豆根瘤菌的接種面積僅占大豆種植面積的2%左右，遠(yuǎn)低于美國、巴西、阿根廷等主要 大豆主產(chǎn)國70%以上接種率。其主要原因是具有高效匹配和競爭結(jié)瘤能力的優(yōu)良菌株的篩 選和根瘤菌競爭結(jié)瘤過程中與豆科植物根系分泌物間信號(hào)識(shí)別的"分子對(duì)話"研究滯后于 生產(chǎn)，導(dǎo)致接種根瘤菌的競爭結(jié)瘤能力差，土壤中存在大量的土著根瘤菌群，干擾和降低了 接種根瘤菌的占瘤率，致使接種根瘤菌劑的增產(chǎn)效果不顯著，制約了其應(yīng)用和發(fā)展。
[0003] 大豆根瘤菌的競爭結(jié)瘤是以大豆宿主與大豆根瘤菌菌株之間可擴(kuò)散復(fù)雜信號(hào)分 子的特異識(shí)別為基礎(chǔ)的復(fù)雜調(diào)控過程，這一過程受到一系列由大豆品種和根瘤菌菌株雙方 提供的信號(hào)分子的嚴(yán)格調(diào)控。研究表明，根瘤菌的競爭結(jié)瘤決于菌株自身產(chǎn)生的不同NodD 調(diào)節(jié)蛋白與豆科植物根系不同分泌物組分的早期相互作用，大豆苷元和染料木黃酮是一類 能影響根瘤菌結(jié)瘤的黃酮物質(zhì)。為了響應(yīng)豆科植物分泌的類黃酮類物質(zhì)，根瘤菌可以合成 宿主特異的（LCOs)作為精確外源結(jié)瘤因子，從而啟動(dòng)根瘤菌和宿主的早期識(shí)別。特異結(jié)瘤 因子的物質(zhì)骨架都是由普通的nod基因（nodABC)合成，而后進(jìn)一步被其他nod基因所編碼 的蛋白質(zhì)所修飾。根瘤菌中NodD(原核生物L(fēng)ysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子）通過與宿主特異的 類黃酮進(jìn)行相互識(shí)別，能夠激活結(jié)瘤基因的表達(dá)。
[0004] 大豆根瘤菌nod基因的表達(dá)受到宿主大豆根系分泌物的影響，很多研究大多采用 類黃酮類純物質(zhì)、大豆苷元或大豆幼苗根系提取物來代替大豆根系分泌物，但實(shí)際上，豆科 植物根系分泌物組分復(fù)雜，截至目前，已發(fā)現(xiàn)豆科植物根系分泌物中的類黃酮種類已超過 4000種，某些單一的純組分或幾種純組分的復(fù)合雖然能夠影響大豆根瘤菌nod基因的表 達(dá)，但研究結(jié)果有一定的片面性；大豆苷元及大豆幼苗根系提取物能夠影響根瘤菌競爭結(jié) 瘤，但在其制備過程中，還包含了大豆根系組織，并不能真正模擬大豆根系中的實(shí)際環(huán)境； 除此之外，目前已報(bào)導(dǎo)的大豆根系分泌物的收集大都集中在收集裝置的設(shè)計(jì)上，對(duì)培養(yǎng)條 件和收集時(shí)間上存在較大的主觀性，其組分和濃度未知，有效性也無法評(píng)價(jià)，在一定程度上 制約了研究的深入。因此，建立大豆根系分泌物的制備方法，并對(duì)其有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)研 究大豆根系分泌物與根瘤菌的互作、大豆根瘤菌nod基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制以及高效菌 株的篩選具有重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于公開了一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物 的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法，包括下述步 驟：
[0008] (1)、對(duì)大豆種子先用蒸餾水洗凈，放入95%的酒精中浸泡lmin，轉(zhuǎn)至5%次氯酸 納溶液浸泡5min進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水沖洗至少10次；
[0009](2)、將經(jīng)過表面滅菌的大豆種子在無菌條件下移至YMA瓊脂表面皿中催芽，待種 子發(fā)芽后，移至滅菌的濃度為30 %的無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第12天收 集大豆根系分泌物，即得高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物；其中培養(yǎng)條件 為：白天30°C、16h光照，光照強(qiáng)度為960iimol?JiT2 ?S4 ;夜間15°C、8h黑暗。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制 備方法，其中，YMA培養(yǎng)基組成為：甘露糖醇 10. 0g、K2HP040. 5g、MgS04，7H20 0. 2g、NaC10.lg、 酵母粉0.88、0&〇)31.5 8、濃度為0.5%的剛果紅51111、瓊脂15-2(^、1120 10001111;￥麻培養(yǎng)基 pH值為6. 8?7. 0。
[0011] 上述技術(shù)方案所述的一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制 備方法，其中，無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液中的成分為：CoCl2 *6H20 0? 004mg/L、H3B032. 86mg/ L、MnCl2 ? 4H20I. 81mg/L、ZnSO4 ? 7H20 0? 22mg/L、CuSO4 ?SH2O0? 102mg/L、Na2MoO4 ? 2H20 0? 122mg/L、MgSO4 ? 7H20 492. 96mg/L、K2HP04174. 18mg/L、KH2P04136 . 886mg/L、CaCl2 ? 2H20 110. 99mg/L和FeC6H5O7 ? 5H20 5. 62mg/L。
[0012] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0013] 本發(fā)明確定了當(dāng)無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液最佳濃度為30%，收集時(shí)間為12d時(shí) 所收集的大豆根系分泌物能顯著提高大豆根瘤菌結(jié)瘤基因的表達(dá)，具體表現(xiàn)為：當(dāng)無氮 Rigaud-Puppo營養(yǎng)液濃度為30 %所收集的大豆根系分泌物，能使菌株Bradyrhizobium diazoefficiensUSDA110中nodC和nodDl基因分別較對(duì)照上調(diào)5. 48倍和4. 95倍，使菌株 BradyrhizobiumjaponicumUSDA6 中nodC和nodDl基因分別較對(duì)照上調(diào) 1. 92 倍和 3. 04 倍；當(dāng)收集時(shí)間為12d時(shí)所收集的大豆根系分泌物，能使菌株B.diazoefficiensUSDA110 中nodC和nodDl基因分別較對(duì)照上調(diào)22. 41倍和8. 27倍，使菌株B.japonicumUSDA6中 nodC和nodDl基因分別較對(duì)照上調(diào)11. 86倍和7. 33倍。最終通過nod基因的上調(diào)實(shí)現(xiàn)高 效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的效果。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0014] 1、圖1為大豆根系分泌物收集玻璃容器；
[0015] 2、圖2為大豆根系分泌物收集玻璃容器置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)生長照片；
[0016] 3、圖3為不同營養(yǎng)液濃度條件下收集的根系分泌物對(duì)菌株B.diazoefficiens USDA110中nod基因的誘導(dǎo)表達(dá)差異；
[0017] 4、圖4為不同營養(yǎng)液濃度條件下收集的根系分泌物對(duì)菌株B.japonicumUSDA6 中nod基因的誘導(dǎo)表達(dá)差異；
[0018] 5、圖5為不同時(shí)期收集的根系分泌物對(duì)菌株B. diazoefficiens USDA 110中nod 基因的誘導(dǎo)表達(dá)差異；
[0019] 6、圖6為不同時(shí)期收集的根系分泌物對(duì)菌株B. japonicum USDA 6中nod基因的 誘導(dǎo)表達(dá)差異。

【具體實(shí)施方式】：
[0020] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明一種高效促進(jìn)大 豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法作進(jìn)一步的說明。
[0021] 實(shí)施例1 :一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法:
[0022] (1)、對(duì)大豆種子先用蒸餾水洗凈，放入95%的酒精中浸泡lmin，轉(zhuǎn)至5%次氯酸 納溶液浸泡5min進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水沖洗至少10次；
[0023](2)、將經(jīng)過表面滅菌的大豆種子在無菌條件下移至YM瓊脂表面皿中催芽，待種 子發(fā)芽后，移至滅菌的濃度為30 %的無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第12天收 集大豆根系分泌物，即得高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物；其中培養(yǎng)條件 為：白天30°C、16h光照，光照強(qiáng)度為960iimol?JiT2 ?S4 ;夜間15°C、8h黑暗。
[0024] 以下通過具體試驗(yàn)例來說明本發(fā)明的一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆 根系分泌物的制備方法所具有的有益效果：
[0025]試驗(yàn)例1 :大豆根系分泌物的制備方法中營養(yǎng)液濃度和收集時(shí)間的確定:
[0026] -、大豆根系分泌物的收集：
[0027] 1、大豆根系分泌物收集裝置：
[0028] 選擇圓柱形容器，在距離容器底部一定高度處放置帶孔圓板用于支撐大豆植株， 容器用無菌過濾透氣封口膜密封。上述容器及支撐圓板材質(zhì)不限，但須耐12rC，30min高 溫滅菌。本發(fā)明選用的是圓柱形玻璃容器（小150mmX250mm)，在距離容器底部約1/4高度 設(shè)置聚丙烯圓板，勻布設(shè)圓孔（小8mm)約80個(gè)，裝置如圖1所示。容器內(nèi)置500ml不同濃 度無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液，成分見表1，12rC，30min滅菌待用。
[0029] 表1無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液成分
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制備方法，包括下述步驟： (1) 、對(duì)大豆種子先用蒸餾水洗凈，放入95 %的酒精中浸泡lmin，轉(zhuǎn)至5 %次氯酸納溶 液浸泡5min進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水沖洗至少10次； (2) 、將經(jīng)過表面滅菌的大豆種子在無菌條件下移至YMA瓊脂表面皿中催芽，待種子發(fā) 芽后，移至滅菌的濃度為30%的無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)第12天收集 大豆根系分泌物，即得高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物；其中培養(yǎng)條件為： 白天30°C、16h光照，光照強(qiáng)度為960 y mol ? nT2 ? s4 ;夜間15°C、8h黑暗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的制 備方法，其特征在于，YMA培養(yǎng)基組成為：甘露糖醇10. 0g、K2HP040. 5g、MgS04 *711200. 2g、NaCl 〇.18、酵母粉〇.88工&0)31.58、濃度為0.5%的剛果紅51111、瓊脂15-2(^、11 20 100〇1111;￥麻培 養(yǎng)基pH值為6. 8?7.0。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高效促進(jìn)大豆根瘤菌競爭結(jié)瘤的大豆根系分泌物的 制備方法，其特征在于，無氮Rigaud-Puppo營養(yǎng)液中的成分為：CoCl2 ? 6H200. 004mg/L、 H3B032. 86mg/L、MnCl2 ? 4H20 1. 81mg/L、ZnS04 ? 7H20 0? 22mg/L、CuS04 ? 5H20 0? 102mg/L、 Na2Mo04 ? 2H20 0? 122mg/L、MgS04 ? 7H20 492. 96mg/L、K2HP04174. 18mg/L、KH2P04136 . 886mg/ L、CaCl2 ? 2H20 110. 99mg/L 和 FeC6H507 ? 5H20 5. 62mg/L。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104351047SQ201410439069
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月28日
【發(fā)明者】李俊, 馬鳴超, 姜昕, 關(guān)大偉, 劉堯, 曹鳳明, 陳慧君, 沈德龍, 楊小紅, 李力 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所