專利名稱：慢生大豆根瘤菌提高萊茵衣藻產氫量的方法
技術領域：
本發明涉及生物制氫技術，具體地說是利用慢生大豆根瘤菌提高萊茵衣藻產氫量的方法。
背景技術：
能源危機與環境污染都是當今世界面臨的突出問題，氫氣是一種清潔、燃燒值高、利用形式多樣的可再生生物能源[1]。光合生物制氫技術能直接轉化太陽能為氫能，特別是微藻光合制氫的底物是水，來源豐富，是利用太陽能生產氫氣的理想模式。而且微藻培養容易，不占用可耕地，是目前國際上生物制氫領域的研究熱點[2]。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)因為其氫化酶活性高、培養容易、生長速度快、遺傳學背景清晰和轉化容易等原因被選為生物制氫研究的模式物種[3]。但是，衣藻的氫化酶活性很容易受氧氣的抑制 而失去活性[3’4]，而氧氣又是衣藻光合作用的主要產物，是導致了衣藻產氫效率低的主要原因，所以要提高衣藻氫氣產量就要降低其細胞內氧氣的含量。目前降低衣藻細胞內氧氣含量的方法主要是通過去除培養基中硫元素來抑制光合系統II活性、進而降低光解水產生的氧氣、提高氫化酶的活性和延長產氫時間[5]。應用該方法發展而來的兩步法萊茵衣藻產氫技術是目前產氫效率最高的技術，該技術是在第一階段使用正常TAP培養基，進行萊茵衣藻的營養生長，以獲得最大生物量的積累，在第二階段更換缺硫培養基，進行產氫培養，獲得氫氣。但是該方法同時抑制了光解水所產生的電子產量，最終仍然不能滿足工業生產的需求[3_5]。因此，要提高衣藻的產氫效率就需要既降低細胞內的氧濃度又要保障電子的供應。豆科植物根瘤中的固氮酶與氫酶有相似的特性，也對氧氣敏感，但是根瘤中的固氮酶卻有很高的固氮活性，這與根瘤細胞中含有大量的豆血紅蛋白Ieghemoglobin,簡稱Lb，有著密切的關系，它對氧氣具有極高的親和力和快速的氧周轉率，能促進氧氣在細胞內的擴散并將氧氣運輸給呼吸作用，有效降低了根瘤細胞內類菌體周圍的氧濃度，保證了同樣對氧氣敏感的固氮酶的活性，同時也保障了呼吸作用需氧和固氮作用需要的大量能量[6$。中國專利CN200380107352. 7和CN02138702. 8分別公開了利用表達豆血紅蛋白改變植物貯藏儲備物含量和提高植物抗澇能力。生物發酵工程的已有技術中也有應用其它血紅蛋白體外重組表達而使產量提高的報導。豆血紅蛋白有兩個亞基構成，一個是球蛋白亞基，由豆科植物合成；另一個是血紅素輔基，由共生的根瘤菌合成，兩個亞基結合成為有活性的豆血紅蛋白[6]。本發明人曾將大豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因轉入萊茵衣藻葉綠體中表達使轉基因萊茵衣藻產氫量提高了 50% (中國發明專利申請CN201010107922. 4)；

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用根瘤菌提高轉基因萊茵衣藻產氫量的方法，并提供一種新思路，用于指導基因工程技術改造萊茵衣藻及其它具有相似代謝特征的微藻產氫代謝途徑的方法，使之更適合于在與根瘤菌共培養的兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻或其它微藻生物量的累積和進一步促進產氫量的方法。本發明將慢生大豆根瘤菌與葉綠體中轉化了大豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因萊茵衣藻Iba進行共培養，發現可以進一步提高轉基因衣藻Iba的生物量積累和顯著促進其產氫量的增加。本發明的方法為指導基因工程技術改造衣藻萊茵衣藻和在兩步法廣氫!技術中進一步提聞廣氫!量提供新思路和實驗基礎。隨著生物制氫!技術的發展，本發明將顯現出越來越大的實用性和重要性本發明一方面提供了一種在兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻產氫量的方法，其特征在于將慢生大豆根瘤菌與萊茵衣藻共培養。在一個實施方案中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849 (Chlamydomonasreinhardtii strain cc849)。優選地，所述萊茵衣藻為葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba。在最優選的實施方案中，在共培養體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為0D_ = I、萊茵衣藻的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為40 1，共培養體系的產氫
量最大。本發明的另一方面提供了慢生大豆根瘤菌在兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻產氫量的用途。在一個實施方案中，所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。優選地，所述萊茵衣藻為葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba。其中慢生大豆根瘤菌在兩步法產氫技術的第一階段促進萊茵衣藻藻株Iba的生長，以及在第二階段提高萊茵衣藻藻株Iba的產氫量。本發明具有以下優點本發明的方法可以在兩步法產氫技術中提高萊茵衣藻產氫量，在最優選的實施方案中，能夠提高萊茵衣藻藻株Iba的產氫量達17倍之多。


圖I萊茵衣藻cc849和轉基因藻Iba分別與根瘤菌共培養的生長狀況。圖2不同根瘤菌濃度對萊茵衣藻cc849和轉基因藻Iba產氫量的影響。圖3正常TAP條件下cc849和Iba及其與根瘤菌共培養的呼吸速率。圖4缺硫產氫條件下cc849和Iba及其與根瘤菌共培養時的呼吸速率。圖5最佳產氫條件下cc849和Iba及其與根瘤菌共培養體系上方的氧氣(A)和氫氣⑶含量變化。
具體實施例方式—、萊茵衣藻培養A、選取細胞壁缺欠型萊茵衣藻藻種cc849，購自美國Duke大學衣藻藻種庫；轉基因衣藻Iba為中國發明專利申請CN201010107922. 4中的方法構建B、培養萊茵衣藻藻種、
(a)萊茵衣藻培養條件溫度25± 1°C ;日光燈光照強度100 200微摩爾光量子/平方米 秒；50 IOOml三羥甲基氨基甲烷-こ酸-磷酸鹽(TAP)培養基液體培養，初始PH7. 2，水平搖床轉速100 130rpm，每5 6天I %接種繼代培養[10]；(b)固體平板TAP培養基瓊脂粉I. 5% ;挑取平板上的萊茵衣藻單克隆通過劃線方法接種在平板上保存和純化藻種，每2至3周繼代一次；C、產氫培養條件使用氯化鎂、氯化鐵、氯化銅和氯化鋅制備缺硫TAP培養基；將生長至對數期后期的萊茵衣藻3000rpm室溫離心5min,收集藻細胞并用缺硫培養基洗3次，懸浮在缺硫培養基內，分別裝入培養管，培養瓶上方留IOml的空間，用翻ロ橡皮塞密閉；黑暗條件下培養24小時；然后放在光照強度60微摩爾光量子/平方米 秒連續光照件下培養，溫度25±1°C ;姆24小時進行氣體成分和含量檢測一次；D、用氣相色譜儀測定氫氣和氧氣含量分子篩型號5X1/8,柱長2m,內徑3mm,熱 導檢測器T⑶，以氬氣作為載氣，柱溫50°C，進樣溫度200°C，熱導檢測溫度300°C;測氣體的組成和含量；ニ、慢生大豆根瘤菌培養慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)購于中國農業科學院,正常培養條件是28°C，黑暗培養，水平搖床轉速200r/min，培養基是YEM (pH 7. 2)[11]，固體培養基含2 %瓊脂，每3周繼代一次保種。三、衣藻和根瘤菌共培養方法A、正常培養條件下純凈的衣藻cc849和Iba分別在正常TAP培養基中培養至對數期中期，將藻細胞密度調整為lX107cellS/mL。將根瘤菌培養至對數后期，將其4000g離心5分鐘，用TAP培養基洗三遍去除YEM培養基，然后重懸于TAP培養基中，濃度調整至0D_為1.0。然后將30mL藻液與2mL根瘤菌分別在IOOmL的三角瓶中混合，培養條件為溫度25°C，光照強度60 UmolnT2s'以純凈的萊茵衣藻cc849作為對照，培每天取ImL藻液，觀察藻7天內的生長情況。B、缺硫產氫培養條件下分別取對數生長中后期的衣藻cc849和Iba培養液,5000r/min離心5min,收集細胞。收集后的藻細胞用全缺硫的培養基(TAP-S)洗三次，然后懸浮在TAP-S中，測定其葉綠素濃度，按照每管0. 5mg葉綠素的量分裝在50mL的培養瓶內，同時將每種細菌的濃度調整為OD6tltl為1，分別按照藻液菌液(體積比)為8 1、20 1、80 1,200 1,400 I的比例加入每管藻液中，最后用TAP-S補充至40mL，密封，黑暗24小時呼吸耗氧以誘導氫酶的表達。然后放在連續光照的條件下培養，每隔24小時用微量進樣器抽取瓶中氣體，用高壓氣相色譜儀(GC)測定氫氣和氧氣的含量。從而得出最佳產氫量的菌液和藻液的體積比例。四、衣藻的生長情況檢測每天取ImL藻液，用血細胞計數板在顯微鏡下數藻細胞數。五、光合速率和呼吸速率的檢測在衣藻培養過程中，每天取樣上下充分混勻后取2ml的藻液加入Hanstech Dff/1型氧電極儀的反應杯中，暗適應5分鐘，同時記錄反應杯中不同光照條件下的溶解氧下降的速率，即為呼吸作用耗氧的速率。然后在不同光照強度下檢測溶解氧上升的速率，即為光合放氧速率。數據分析后按照下列公式計算，即為呼吸速率V = S K 60 1000/P其中v為吸氧活性，單位是UmolO2 *mg_1Chl S為曲線的斜率，單位是mirT1，K為常數，表示25°C下水中的溶氧量，單位是iimol02/ml，P為樣品的葉綠素濃度，單位是mgChl/ml,60表示60min，1000表示記錄紙的滿量程為1000。實施例I正常條件下根瘤菌與cc849和Iba共培養的生長情況在兩步法產氫技術的第一階段，為了研究根瘤菌對衣藻生長的影響，將根瘤菌按照2ml 30ml的菌藻體積比分別與萊茵衣藻cc849和轉基因藻Iba混合培養于正常TAP 培養基中，分別以純凈cc849和Iba為對照，每天檢測培養液的藻細胞數(如圖I所示)，結果顯示cc849和Iba分別與根瘤菌共培養時，其生長的時間動態趨勢與cc849和Iba分別単獨培養時相似藻細胞均在培養的第I天進入對數生長期，在第3-4天左右達到飽和，之后趨于平穩。但是，根瘤菌與Iba共培養的藻細胞數明顯高于Iba的藻細胞數，其在第四天最大藻細胞數約為3. 86 X IO7個/mL，比Iba單獨培養的3. 06 X IO7個/mL提高了約27%，而根瘤菌與cc849共培養卻未對cc849的生長產生顯著影響，最大細胞數都約為3. 2X IO7個/mL。由此可見，正常條件下，轉基因藻Iba的生長略低于cc849，但是加入了根瘤菌共培養后，其生長速度明顯提高，并超過了 cc849的生長速度。因此，在兩步法產氫技術的第一階段，適合將根瘤菌加入到轉基因衣藻Iba中，以獲得最大生物量的積累。實施例2缺硫產氫條件下根瘤菌對cc849和Iba產氫的影響在兩步法產氫技術的第二階段，分別將根瘤菌按照不同的體積比分別與cc849和Iba混合于缺硫培養基中共培養，分別以純凈cc849和Iba單獨培養為對照，連續檢測產氫量的差別(如圖2所示)。從圖2可以看出，根瘤菌顯著促進了 cc849和Iba產氫量積累，并且促進作用與藻菌的體積比有夫。當根瘤菌的濃度為0D_ = l、cc849和Iba的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L時，根瘤菌在藻液菌液(體積比)為40 I吋，即40mL藻液中加入ImL菌液,共培養體系的產氫量最大，達到約298. 54 u mol,是Iba單獨培養產氫量的18. 2倍。根瘤菌對cc849產氫的促進作用相對較弱，在藻液菌液(體積比)為100 : I吋，SP40mL藻液中加入0. 4mL菌液，最大氫氣累積量約為82. 95 u mol,僅為cc849單獨培養的5. 5倍。此結果表明根瘤菌在適當比例范圍內能顯著提高萊茵衣藻的產氫量，尤其是對葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因衣藻Iba產氫作用具有非常顯著的促進作用，可用于兩步法產氫技術的第二階段，來大幅度提高萊茵衣藻產氫效率。實施例3藻菌共培養體系的光合放氧和呼吸耗氧在正常TAP培養基中，用氧電極法檢測了根瘤菌分別與cc849和Iba共培養對系統中光合放氧和呼吸耗氧的影響。結果表明根瘤菌與衣藻cc849和Iba共培養時均檢測不到光合放氧現象，只能檢測到呼吸耗氧(如圖3所示)。在7天連續培養的前3天中，cc849和Iba単獨培養時候的呼吸速率均呈現逐漸下降趨勢，在第三天達到最低，約為4. 22
4.30 u mol O2. mg 1Chl. h \ 之后又略有回升，但基本穩定 4. 46 4. 70 u mol O2. mg 1Chl. h 1之間。當cc849和Iba分別與根瘤菌共培養后，系統的呼吸速率均呈現一直升高趨勢，而且分別顯著高于cc849和Iba分別單獨培養時的呼吸速率，尤其是Iba與根瘤菌共培養的最大呼吸速率約為7.709 ii mol O2. Hig-1Chl. h—1，提高了 64%;而cc849與根瘤菌共培養的最大呼吸速率約為5.904 ii mol O2. H^1Chl. h—1，僅提高了 32%。此結果表明根瘤菌能顯著提高其與萊茵衣藻共培養體系的呼吸耗氧速率，尤其是對葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因衣藻Iba呼吸速率的促進作用更顯著。在缺硫產氫培養條件下，仍然檢測不到根瘤菌與cc849和Iba共培養的光合放氧現象，但是在產氫培養的第一天，根瘤菌分別與cc849和Iba共培養液的呼吸速率均非常顯著地升高(如圖4所示)，尤其是與Iba共培養的藻液的呼吸速率高達約42. 4 u mo I
O2.mg_1chl. IT1,比Iba單獨培養時提高了約7倍之多。而根瘤菌與cc849共培養的第一天的的呼吸速率約為34. 2 u mol02. Hig-1Chl. h'僅提高了 5倍。在產氫培養的第二天，藻菌共培養液的呼吸速率又迅速下降，到第三天時候降到零，只有単獨培養的cc849和Iba可以檢測到呼吸作用。由此可見，根瘤菌與萊茵衣藻共培養體系呼吸耗氧的顯著增加是其產氫量顯著提高的重要原因，尤其是根瘤菌與轉基因藻Iba共培養體系，這種作用更明顯，這個發現 為將來利用基因工程手段改造萊茵衣藻產氫代謝途徑提供了新思路，可將根瘤菌的某些代謝途徑在萊茵衣藻中表達，再結合與根瘤菌共培養的方法，進ー步提高萊茵衣藻的產氫量，將具有重要的指導意義。實施例4最佳產氫條件下藻菌混合培養體系中的氫氣和氧氣含量在兩步法產氫技術的第二階段，將根瘤菌分別與cc849和Iba以最佳產氫量的體積比混合共培養，其培養管上方的氧氣含量和氫氣含量的時間動態變化如圖5A，B所示。圖5A的結果顯示在缺硫培養基中，與根瘤菌共培養的衣藻體系上方的氧氣消耗的速度遠遠大于cc849和Iba単獨培養體系的氧氣消耗速度。黑暗培養24h后，cc849與根瘤菌共培養體系的氧氣含量急劇降至6. 2%,之后12天一直保持在4% -5%左后；而Iba與根瘤菌共培養體系的氧氣含量則急劇降至5. 0%，最低兩天甚至降到只有2%。而cc849和Iba單獨培養體系上方的氧氣含量在黑暗24h后分別僅降至約25%和17%，直到培養的第六天才逐漸降到最低，分別約為7. 6%和4%，并保持在這ー較高的水平。相應的，與cc849和Iba分別單獨培養相比，與根瘤菌共培養體系中的氫氣積累量顯著增加(如圖5B所示)，尤其是Iba與根瘤菌共培養體系的最高氫氣積累量達到約298iimol，提高了約17倍；而根瘤菌與cc849共培養體系的最大氫氣積累量約為83 y mol，提高了約4. 5倍。cc849和Iba分別單獨培養的最大產氫量約為16-17 y mol。由此可見，根瘤菌與萊茵衣藻共培養提高產氫的方法中，其根利于在葉綠體中表達了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因衣藻Iba的呼吸耗氧和產氫量的積累。這ー發現為為將來利用基因工程手段改造萊茵衣藻產氫代謝途徑提供了新思路，可將根瘤菌的某些代謝途徑在萊茵衣藻中表達，再結合與根瘤菌共培養的方法，進ー步提高萊茵衣藻的產氫量，將具有重要的指導意義。參考文獻[I]Hemschemeier A, Melis A, Thomas Happe. Analytical approaches tophotobiological hydrogen production in unicellular green algae.PhotosynthesisResearch. 2009，102 :523-540[2]韓志國，李愛芬，龍敏南，韓博平.微藻光合作用制氫-能源危機的最終出路[J].生態科學.2003，22 (2) =104-108.
[3]吳雙秀，王全喜.衣藻生物制氫的研究進展[J].中國生物工程雜志.2006，26(10) :88-92.[4]Happe T,Mosler B,Naoer J D. Induction,isolation and characterizationmetal content of hydrogenase in the green alga Chlamydomonas reinhardtn.European Journal of Biochemistry. 1994. 222 :769-774.[5]Melis，A.，Zhang, L，Forestier, M.，Ghirardi，M. L，Seibert，M.，Sustainedphotobiological hydrogen gas production upon reversible inactivation of oxygenevolution in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Plant P hysiol.2000,122 127-136.[6]Kundu S,Trent J T,Hargrove M S. Plants，humans and hemoglobins. TRENDSin Plant Science. 2003，8(8) :387-393.[7]陳義烘，馬三梅等.植物血紅蛋白的發現及其功能.生命的化學，2006，26 (5)408-410.[8]Wagner. Characteristics oi Modified Leghemogioりins Isolated fromSoybean (Glycine max Merr.) Root Nodules. Plant Physiol，1994，(104) :1231-1236.[9]趙亞蘭，尉亞輝等.豆血紅蛋白的研究進展.西北植物學報，2000，20⑷684-689[10]Harris E. H. , The Chlamydomonas sourcebook a comprehensive guideto biology and laboratory use，Academic Press, New York,1989.[II] Regensburger B.，Meyer L，FUser M.，Weber J.，Studer D.，Lamb J. W.，Fischer H. -M.，Hahn M. . and Hennecke H. . Bradyrhizobium japonicum mutantsdefective in root—nodule bacteroid development and nitrogen fixation, ArchMicrobiol. 1986，144 :355-366.
權利要求
1.一種在萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)兩步法產氫技術中提高產氫量的方法，其特征在于將慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)與萊茵衣藻共培養。
2.根據權利要求I的方法，其中所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。
3.根據權利要求I的方法，其中所述萊茵衣藻為葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba。
4.根據權利要求1-3任一項的方法，在共培養體系中慢生大豆根瘤菌的濃度為OD6tltl=I、萊茵衣藻的細胞濃度為12. 5mg葉綠素/L，藻液與菌液的體積比為40 I。
5.慢生大豆根瘤菌在萊茵衣藻兩步法產氫技術中提高產氫量的用途。
6.根據權利要求5的用途，其中所述萊茵衣藻為萊茵衣藻藻株cc849。
7.根據權利要求5的用途，其中所述萊茵衣藻為葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基Iba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba。
8.根據權利要求7的用途，其中所述慢生大豆根瘤菌在兩步法產氫技術的第一階段促進萊茵衣藻藻株Iba的生長，以及在第二階段提高萊茵衣藻藻株Iba的產氫量。
全文摘要
本發明涉及生物制氫技術，具體涉及一種利用根瘤菌提高轉基因萊茵衣藻產氫量的方法。本發明將慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japomcum)分別與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)藻株cc849和葉綠體中轉化了豆血紅蛋白球蛋白亞基lba基因的轉基因萊茵衣藻藻株lba在兩步法產氫技術的第一階段和第二階段按一定體積比混合進行共培養，結果表明慢生大豆根瘤菌不僅在第一階段促進萊茵衣藻藻株lba的生長，而且在第二階段也顯著提高了萊茵衣藻藻株lba的產氫量達17倍之多。
文檔編號C12R1/41GK102732563SQ20121000783
公開日2012年10月17日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者吳雙秀 申請人:中國科學院北京基因組研究所