專利名稱：導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方法
技術領域：
本發明涉及大豆根瘤菌工程菌株的構建方法。
背景技術：
氮是自然界中動物、植物、微生物不可缺少的生命元素，在活細胞內，氮是所有氨 基酸、核酸及其他許多重要分子的主要組成部分。大氣中的氮，必須通過以生物固氮為主的 固氮作用，才能被植物吸收利用，動物直接或間接地以植物為食物才能吸收利用氮素。生物 固氮是指某些種類的固氮微生物利用體內的固氮酶在常溫常壓下將大氣中的氮還原成氨 的過程。根據固氮微生物的固氮特點以及與植物的關系，可以將生物固氮作用分為自生固 氮、共生固氮和聯合固氮三類。大豆根瘤菌是共生固氮微生物中的一類，與宿主植物形成共 生固氮體系后進行生物固氮，為宿主植物提供生長所必需的氮元素。統計表明，在3種固氮 形式中，共生固氮效率最高，固氮量最多。長期以來，人們把豆科植物根瘤的固氮作用視為 糧食生產的基礎，它既可保持土壤肥力，又可提高糧食作物的產量。生物固氮仍然是生命科學研究中的重大課題，而且在農業生產中也具有重要的應 用價值。生物固氮不僅固氮量大，而且還可以提高土壤肥力，改善土壤板結情況，減少化肥 的使用量，不污染環境；更為重要的是它有取之不盡，用之不竭的廉價氮源，常溫常壓下可 以固氮，成本低，利用率高，因此，生物固氮是今后肥料發展的主要方向之一。黑龍江省是我 國大豆的主產區，年播種面積、總產量和出口量均居全國首位，加強生物固氮作用的研究及 應用對提高我省大豆的產量有重要意義。目前，大豆根瘤菌工程菌株在接種到大豆幼苗后，對大豆植株結瘤數量少，根瘤菌 的固氮能力差，對大豆產量增幅小。

發明內容
本發明的目的是為了解決現有大豆根瘤菌工程菌株在接種到大豆幼苗后，對大豆 植株結瘤數量少，根瘤菌的固氮能力差，對大豆產量增幅小的問題，而提供導入nodD基因 的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方法。導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方法按以下步驟進 行一、對快生型大豆根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取基因組DNA;二、采用同源 序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目的基 因nodD，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit進行純化，再將純化后 的目的基因nodD與TA克隆載體pMD 18-T進行連接，獲得連接產物；三、將連接產物轉 化大腸桿菌DH5 α及陽性克隆子的篩選與鑒定，然后采用堿裂解法提取質粒載體PUC19， 再進行PCR擴增，獲得Iac啟動子，然后Iac啟動子和質粒載體pET-28a分別經Bgl II 和Nco I進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組質粒載體PET-Plae ；四、將目 的基因nodD與重組質粒載體PET-Plae分別經Nco I和Xho I進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組載體pET-Pla。-nodD;五、以重組載體pET-Pla。-nodD為模板進行 PCR擴增，獲得Pla。-nodD-T7片段，然后將Pla。-nodD-T7片段與pTR102質粒載體分別經 KpnI進行單酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組原核生物表達載體pTR-Pla。-nodD ； 六、采用三親本雜交技術將原核生物表達載體pTR-Pla。-nodD轉化到大豆土著根瘤菌中， 即完成導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-Sra-02的構建；其中步驟二中PCR擴 增所用上游引物為 5，CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3’,下游引物為 5，-GCGCTCGAGTTGCGGGC TCAAGGGTG-3，；步驟三中 PCR 擴增所用上游引物為 5，CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT-3’, 下游引物為5 ’ -GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG-3 ’ ；步驟五中PCR擴增所用上游引物為 5，-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3，，下游引物為 5，-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3 ’。在根瘤菌中，結瘤基因在根瘤菌與植物形成互利共生關系的過程中起到重要的作 用。結瘤基因從功能上可分為調節基因和結構基因兩大類，其中，nodD基因即是根瘤菌共 生結瘤過程重要的調節基因，其編碼的NodD蛋白調節其它nod結構基因表達，合成結瘤因 子(nodulation factor)。NodD蛋白起到連接植物信號(主要是黃酮類化合物)和細菌信 號(結瘤因子)的作用。本發明中所構建的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02，在接種到大 豆幼苗后，大豆植株結瘤數量增加23. 73%，根瘤菌的固氮能力高，對大豆產量增幅大；本 發明所構建的工程菌株HD-SFH-2對黑龍江省大豆生產的實際需求有很大的現實意義。


圖1是具體實施方式
一中大豆土著根瘤菌的系統發育樹狀圖；圖2是具體實施方 式一中導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的菌落發光性檢測圖；圖3是具體 實施方式一中采用轉空載體的菌株的菌落發光性檢測圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的 任意組合。
具體實施方式
一本實施方式導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02 的構建方法按以下步驟進行一、對快生型大豆根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取 基因組DNA ；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因組DNA為模板進行 PCR 擴增，獲得目的基因 nodD，然后采用 TaKaRa Agarose GeL DNA Purification Kit 進行 純化，再將純化后的目的基因nodD與TA克隆載體pMDIS-T進行連接，獲得連接產物；三、 將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α及陽性克隆子的篩選與鑒定，然后采用堿裂解法提取質 粒載體pUC19，再進行PCR擴增，獲得Iac啟動子，然后Iac啟動子和質粒載體pET_28a分 別經Bgl II和Nco I進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組質粒載體PET-Pla。； 四、將目的基因nodD與重組質粒載體PET-Plae分別經Nco I和Xho I進行雙酶切，回收所 需目的片段，連接并構建重組載體pET-Pla。-nodD ；五、以重組載體pET-Pla。-nodD為模板進 行PCR擴增，獲得Pla。-nodD-T7片段，然后將Pla。-nodD-T7片段與pTR102質粒載體分別經 KpnI進行單酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組原核生物表達載體pTR-Pla。-nodD ； 六、采用三親本雜交技術將原核生物表達載體pTR-Pla。-nodD轉化到大豆土著根瘤菌中，即完成導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建；其中步驟二中PCR擴 增所用上游引物為 5，-CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3，，下游引物為 5，-GCGCTCGAGTTGCGGG CTCAAGGGTG-3，；步驟三中 PCR 擴增所用上游引物為 5，CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT-3，， 下游引物為5’ GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG-3，；步驟五中PCR擴增所用上游引物為 5，-CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3，，下游引物為 5，-CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3 ’。本實施方式步驟一中快生型大豆根瘤菌15067取自中科院微生物所菌種保藏中 心。本實施方式步驟一中的具體操作將4°C保存的快生型大豆根瘤菌15067三區劃 線接種到YMA固體培養基(IOg的甘露醇、0. 2g的KH2P04、0. 2g的MgSO4 ·7Η20、0· 2g的NaCl、 0. Ig的酵母膏、5g的CaCl2、18. 0 20. Og的瓊脂粉加入蒸餾水并定容至IOOOmL)，放入恒 溫培養箱中，在28°C下培養72h ；挑取單菌落接種到YMA液體培養基，置于空氣搖床上，在 28°C，180r/min振蕩培養72h進行菌株擴培，然后用CTAB法提取快生型大豆根瘤菌15067 的基因組DNA并用瓊脂糖凝膠電泳檢測。本實施方式步驟二中獲得目的基因nodD，進行生物信息學分析利用NCBI網站中 的BLASTn程序對測序獲得目的基因nodD的核苷酸序列進行在線分析，獲得目的基因nodD 的序列與Sinorhizobium fredii (費氏中華根瘤菌)和R. japonicum(大豆根瘤菌)的 nodDl基因的序列相似性高達98%，與Rhizobium fredii (中華根瘤菌)的nodD基因的序 列相似性高達98%，推定該基因為快生型大豆根瘤菌15067中nodD基因。本實施方式步驟三中連接是將pET_28a的T7啟動子替換為pUC質粒載體上的Iac 啟動子本實施方式步驟三中的具體操作采用CaCl2法制備大腸桿菌DH5 α感受態細胞； 將連接產物和大腸桿菌DH5 α感受態細胞在無菌條件下混勻，采用冰浴而后突然溫浴的方 式使其轉化，加入SOC液體培養基(20g的蛋白胨、5g的酵母提取物、5g的NaClUOmL的 0. 25MKCl、5mL的2M MgCl2、20mL的IM葡萄糖加入蒸餾水并定容至IOOOmL)，37°C搖床180r/ min振蕩培養lh，將菌液按不同梯度的量涂布于含Amp、IPTG、X-Gal的LB平板上進行藍白 篩選；用無菌牙簽挑取平板上白色菌落于ImL LB液體培養基中，置于搖床中37°C，180r/ min過夜培養，然后以菌液為模板，進行陽性克隆子的PCR鑒定，反應結束后取5μ L PCR產 物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；將鑒定結果為陽性的菌液活化，送至測序公司進行測序。本實施方式步驟六中大豆土著根瘤菌是從黑龍江省哈爾濱周邊大豆種植區域分 離得到；采用通用引物 PCR(P9 :5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'禾口 P10:5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')擴增土著根瘤菌16S rDNA，獲得其16S rDNA序列；將獲 得的土著根瘤菌的16S rDNA序列與GenBank數據庫中16S rDNA序列進行同源比對分 析，并構建系統發育樹(圖1)，根據同源性分析結果推知此土著根瘤菌屬于中華根瘤菌屬 (Sinorhizobium)。本實施方式中導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02與采用轉空載體 的菌株(TC 將PTR102空載體轉化土著根瘤菌)進行對比在培養好的單菌落平板蓋上滴加癸醛溶液50mL，然后將平板倒置于暗室，再把膠 片放置在平板上約lmin，然后放在顯影液中顯影至觀察到黑斑顯現(中間應移動膠片以使 其與顯影液充分均勻接觸)，快速將膠片放入清水中，充分洗掉顯影液，再放于定影液中定影lOmin，最后用清水沖洗30min，至此X光片就已制作完成；X光片的結果見圖2和3，可知 的本實施方式中導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02構建成功。
本實施方式步驟五中所得重組原核生物表達載體pTR-Pla。-nodD的遺傳穩定性的 測定，并轉到植物盆栽中做進一步的驗證，具體步驟如下
1、自生條件下遺傳穩定性檢測轉移接合子經純化后，隨機挑取5個，在不加抗生素的YMA培養基上連續轉接10 次，最后挑取數個單菌落分別點種在加抗生素的YMA和不加抗生素的YMA培養基上，28°C培 養至長出菌落，檢查菌落的發光性；2、共生條件下遺傳穩定性檢測將標記后的菌株制成菌懸液，接種于大豆植株根部，并以土著根瘤菌和不接種作 對照，光照培養至40d左右收獲，將收獲的根瘤切成兩半，倒扣于培養皿底部，在培養皿中 滴加50 μ L癸醛溶液，在暗室中即可觀察到發光，顯影并用X光片曝光記錄，由此計算發光 根瘤占所有根瘤的百分率；HD-SFH-02，TC的重組質粒經連續轉接后的保持率見表1所示；表 1
供試菌株12345678HD-SFH-02100100100100100100100100TC100100100100100100100100大豆盆栽條件下分別接種大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02和TC培養至大豆植株 根瘤出現，采集大豆植株根系上的根瘤，經表面滅菌后，用解剖刀切開根瘤，倒扣于培養皿 底部，觀察發光活性，以X-光片曝光記錄根瘤的發光活性；結果如表2所示，可見從根瘤的 發光性檢測結果來看，標記菌株在與植株相互侵染結瘤的過程中，標記基因是穩定的。表2
工程菌株檢測根瘤數(個)發光根瘤數(個)穩定性(％ )HD-SFH-026969100TC5555100植物盆栽實驗挑選形狀飽滿色澤均勻的大豆種子，經處理，種子在無菌水中充分吸漲后，于28°C 催芽2d ；催芽后播種無菌土中，每天澆灌無氮培養液，待大豆長出第一片子葉后，接種大豆 根瘤菌工程菌株，培養45d后，隨機挑取30株大豆植株平均分為3組；測量每組的10株大 豆植株的地上部分根瘤數；接種不同菌株對大豆植株生長情況的影響見表3 ；顯著性結果 分析見表4 ；表3
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權利要求
導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD SFH 02的構建方法，其特征在于導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD SFH 02的構建方法按以下步驟進行一、對快生型大豆根瘤菌15067進行活化和擴培，然后提取基因組DNA；二、采用同源序列克隆法，以快生型大豆根瘤菌15067基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得目的基因nodD，然后采用TaKaRa Agarose GeL DNAPurification Kit進行純化，再將純化后的目的基因nodD與TA克隆載體pMD18 T進行連接，獲得連接產物；三、將連接產物轉化大腸桿菌DH5α及陽性克隆子的篩選與鑒定，然后采用堿裂解法提取質粒載體pUC19，再進行PCR擴增，獲得lac啟動子，然后lac啟動子和質粒載體pET 28a分別經BglII和Nco I進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組質粒載體pET Plac；四、將目的基因nodD與重組質粒載體pET Plac分別經Nco I和Xho I進行雙酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組載體pET Plac nodD；五、以重組載體pET Plac nodD為模板進行PCR擴增，獲得Plac nodD T7片段，然后將Plac nodD T7片段與pTR102質粒載體分別經KpnI進行單酶切，回收所需目的片段，連接并構建重組原核生物表達載體pTR Plac nodD；六、采用三親本雜交技術將原核生物表達載體pTR Plac nodD轉化到大豆土著根瘤菌中，即完成導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD SFH 02的構建；其中步驟二中PCR擴增所用上游引物為5’ CGGCCATGGGTTTTAAGGG 3’，下游引物為5’ GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG 3’；步驟三中PCR擴增所用上游引物為5’ CGCAGATCTAAACGCCTGGTAT 3’，下游引物為5’ GCGCCATGGCTGTTTCCTGTGTG 3’；步驟五中PCR擴增所用上游引物為5’ CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG 3’，下游引物為5’ CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA 3’。
2.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟二中PCR擴增的反應體系為20 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量400ng/ μ L快生型大豆根瘤菌15067基因組DNA0. 5 μ L0. 2μΜ 引物 Pll.OyL5’ -CGGCCATGGGTTTTAAGGG-3’0. 2μΜ 引物 Ρ2LOyL5' -GCGCTCGAGTTGCGGGCTCAAGGGTG-3’IOXEx Taq Buffer2. O μ L10mmol/L dNTP1. 5μ LEx Taq DNA 聚合酶0. 5 μ L無菌水13. 5yLPCR擴增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸90s，共35個 循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。
3.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟三中PCR擴增的反應體系為20 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量400ng/ μ L 質粒載體 pUC190. 5 μ L，0. 2μΜ 引物 Ρ3l.OyL，5 ‘ -CGCAGATCTAAACGCCTGGTATAT-3‘PCR擴增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸90s，共35個 循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。
4.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟三中雙酶切的體系如下成分Iac啟動子、質粒載體pET-28a 限制性核酸內切酶 10XT Buffer BSA(牛血清白蛋白)0. 2yL無菌水5.8yL。
5.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟三中連接的體系如下成分用量10 X T4DNA連接酶緩沖液2. 5 μ L酶切后的Iac啟動子10. OyL酶切后的質粒載體pET-28a2. OyLT4DNA連接酶LOyL無菌水9.5yL。
6.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟四中雙酶切的體系如下成分目的基因nodD與重組質粒載體PET-Plac 限制性核酸內切酶 10XT buffer BSA 無菌水用量 10. 0μ LNco Il.OyL ；Xho I LOyL 2. 0μ L 0. 2μ L 5· 8 μ L0
7.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟四中連接的體系如下 成分用量(10 X T4DNA連接酶緩沖液2. 5 μ L酶切后的目的基因nodD10. OyL酶切后的重組質粒載體PET-Plae 2. OyL T4DNA連接酶LOyL無菌水9. 5 μ Lc
8.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟五中PCR擴增的反應體系為20 μ L反應體系，由下列成分組成成分用量400ng/ μ L 重組載體 pET-Pla。-nodD 0. 5 μ L 0. 2μΜ 引物 Ρ5l.OyL5 ‘ -CGCGGTACCAGATCTAAACGCCTGG-3‘ 0. 2μΜ 引物 Ρ6l.OyL5 ‘ -CGCGGTACCCAAAAAACCCCTCAAGA-3‘ IOXEx Taq Buffer2. 0 μ L10mmol/L dNTP1. 5μ LEx Taq DNA 聚合酶0. 5 μ L無菌水13. 5yLPCR擴增條件為94°C變性5min，94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸90s，共35個 循環，再72 °C延伸7min，4°C保溫。
9.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟四中單酶切的體系如下成分用量Plac-nodD-T7 片段、pTR102 質粒載體10. 0 μ L限制性核酸內切酶KpnI LOyLIOXL buffer2. 0 μ L無菌水7.0yL。
10.根據權利要求1所述的導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方 法，其特征在于步驟三中連接的體系如下成分用量10 X T4DNA連接酶緩沖液2. 5 μ L酶切后的Pla。-nodD-T7片段 10. 0 μ L 酶切后的PTR102質粒載體2. 0 μ LT4DNA連接酶LOyL無菌水9.5yL。
全文摘要
導入nodD基因的大豆根瘤菌工程菌株HD-SFH-02的構建方法，它涉及大豆根瘤菌工程菌株的構建方法。它解決了現有大豆根瘤菌工程菌株在接種到大豆幼苗后，對大豆植株結瘤數量少，對大豆產量增幅小的問題。方法提取大豆根瘤菌基因組DNA，進行PCR擴增，得目的基因nodD，純化后與TA克隆載體pMD18-T進行連接，得連接產物，再轉化大腸桿菌；經過多次酶切、連接和驗證，獲得重組原核生物表達載體pTR-Plac-nodD；將原核生物表達載體pTR-Plac-nodD轉化到大豆土著根瘤菌中即完成。本發明中菌株HD-SFH-02，在接種到大豆幼苗后，結瘤數量增加23.73％，大豆產量增幅大。
文檔編號C12N15/74GK101942461SQ201010178259
公開日2011年1月12日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者于冰, 于海鵬, 劉金玲, 吳川, 季琳, 張喜波, 李海英, 楊樂, 王宇光, 管成成, 蒙明明, 賈珊珊, 郭錫偉, 陳思學, 馬春泉 申請人:黑龍江大學