一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法
【專利摘要】一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其操作步驟包括：采集目標(biāo)煙草煙堿轉(zhuǎn)化株上處于單核靠邊發(fā)育時(shí)期的花蕾，先用酒精對(duì)剝離出的花藥進(jìn)行短時(shí)間消毒，然后浸入飽和次氯酸鈣溶液中進(jìn)行消毒處理，無(wú)菌水沖洗后迅速轉(zhuǎn)移到H培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，維持室內(nèi)溫度和光照，待煙苗長(zhǎng)到5-6片真葉時(shí)轉(zhuǎn)移到秋水仙素中浸泡進(jìn)行染色體加倍，在無(wú)菌水浸泡清洗后轉(zhuǎn)植到MS培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)，流式細(xì)胞儀鑒定染色體倍性為雙單倍體的煙苗在移栽季節(jié)經(jīng)煉苗后進(jìn)行移栽，套袋自交留種，次年團(tuán)棵期取樣檢測(cè)煙堿和降煙堿含量以計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率，其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。該方法特別適用于以減少煙草特有亞硝胺為目標(biāo)的低煙堿轉(zhuǎn)化率性狀的提純。
【專利說(shuō)明】一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及煙草組織培養(yǎng)領(lǐng)域，特別涉及一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 降煙堿是煙草中的四種生物堿之一，正常情況下含量為3. 5%，極易在調(diào)制和陳化 等處理環(huán)節(jié)中發(fā)生亞硝化和?；壬磻?yīng)而產(chǎn)生致癌物質(zhì)-煙草特有亞硝胺（TSNAs)， 從而影響煙葉品質(zhì)，損害煙草消費(fèi)者身體健康，因此，降低煙草中降煙堿含量一直是國(guó)際煙 草減害研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。
[0003] 煙草（Nicotiana tabacum L, ·)是異源四倍體植物（2n=48)，目前的煙草基因組 計(jì)劃研究結(jié)果表明，其基因組結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，基因雜合度較高，拷貝數(shù)豐富，因此，控制性狀 的基因位點(diǎn)的純合度受到較大影響，在實(shí)際育種工作中表現(xiàn)為煙草品種使用一段年限后往 往出現(xiàn)性狀分離、種性退化等不良現(xiàn)象。對(duì)于煙草轉(zhuǎn)化性狀的純化或提純，傳統(tǒng)的方法是定 向選擇和多代自交結(jié)合使用，栽培種煙草為一年生植物，根據(jù)基因自交純合速度，在具備豐 富育種經(jīng)驗(yàn)保證單株選擇正確的前提下，一般也至少需要自交5-6代才能達(dá)到育種上可用 的遺傳純合度，即需要耗費(fèi)5-6年時(shí)間，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，嚴(yán)重影響了煙草減害品種的育種進(jìn)程和 準(zhǔn)確度。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)傳統(tǒng)純化方法的不足，提供一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的可靠方 法，即采用花藥培養(yǎng)結(jié)合染色體加倍技術(shù)，用流式細(xì)胞儀鑒定染色體倍性，大幅提高加倍效 率，次年后代團(tuán)棵期性狀鑒定，此技術(shù)只需1. 5代即1年半時(shí)間便可實(shí)現(xiàn)高度純化煙草煙堿 轉(zhuǎn)化株，相比傳統(tǒng)自交純化技術(shù)大大節(jié)省了時(shí)間和人力物力，而且后代性狀高度穩(wěn)定，較適 合于親本和雜交后代的純化處理，為優(yōu)良煙堿轉(zhuǎn)化品種選育提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。
[0005] 本發(fā)明所稱的煙堿轉(zhuǎn)化率（%) =[降煙堿含量/ (煙堿含量+降煙堿含量）]，表示 煙堿轉(zhuǎn)化能力的大小。
[0006] 本發(fā)明所稱的煙堿轉(zhuǎn)化株即具有煙堿向降煙堿轉(zhuǎn)化能力的煙株。一般按煙堿轉(zhuǎn)化 率大小對(duì)煙株進(jìn)行煙堿轉(zhuǎn)化屬性分類： (1)非轉(zhuǎn)化株：煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%的煙株。
[0007] (2)低轉(zhuǎn)化株：煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%至20%的煙株。
[0008] (3)高轉(zhuǎn)化率：煙堿轉(zhuǎn)化率大于50%。
[0009] 所述一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于依次按以下操作步驟進(jìn) 行： (1) 花蕾采集和保存：采集煙草植株主花序或側(cè)花序上健康的適齡花蕾，用冰盒迅速密 封保存； (2) 消毒：在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)〔襟E1花蕾中的花藥，用無(wú)菌紗布或無(wú)菌市售絲襪包裹 花藥并浸入70-75%濃度的酒精中消毒10-15 s，快速取出且立即浸入飽和Ca(ClO) 2溶液 中，輕輕晃動(dòng)燒杯以使消毒充分，最后用無(wú)菌水沖洗多次； (3 )花藥接種與培養(yǎng)：將清洗后的花藥置于無(wú)菌的玻璃皿內(nèi)，用消毒后的鑷子輕取花藥 接種到H培養(yǎng)基上，消毒、封口后置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，要求室內(nèi)溫度維持在25-27°C，每天光 照8-10 hr，利用電腦時(shí)控器來(lái)控制光照時(shí)間，用加濕器維持室內(nèi)一定的濕度以免培養(yǎng)基失 水過(guò)快影響花藥萌發(fā)； (4) 幼苗轉(zhuǎn)植：將萌發(fā)且長(zhǎng)到2-3葉期的幼苗轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上集中生長(zhǎng)（150 ml的 三角瓶)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)以快速生根長(zhǎng)葉，每瓶放置5-6株幼苗，未萌發(fā)花粉繼續(xù)在原H培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基不夠時(shí)則及時(shí)將幼苗轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上； (5) 幼苗加倍：將生長(zhǎng)至5-6真葉期、高為1-2 cm左右的幼苗連根(大于此標(biāo)準(zhǔn)的苗子 則可用剪刀去根留莖)浸入到濃度為〇. 4-0. 5%的秋水仙素溶液中，48-72 hr后取出浸入無(wú) 菌水中3-5 min，不時(shí)晃動(dòng)燒杯以清洗徹底，然后轉(zhuǎn)植到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)成苗； (6) 染色體倍性檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀鑒定煙苗的染色體倍性，檢測(cè)為雙單倍體的煙苗才 進(jìn)行大田移栽，加倍未成功的煙苗重復(fù)以上的加倍處理步驟； (7) 煙苗移栽：待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12 cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗3-5 d，然后 將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直 接栽種于大田中； (8) 套袋留種：花期對(duì)煙株進(jìn)行套袋以自交留種。
[0010] (9)純化煙株鑒定：次年播種上年收獲的種子，團(tuán)棵期取樣檢測(cè)煙堿和降煙堿含量 以計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率，其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
[0011] 所述方法還包括染色體倍性的檢測(cè)步驟，其具體操作如下：從步驟5中獲得的煙 株上采取小面積的無(wú)菌苗葉片放置在無(wú)菌試驗(yàn)臺(tái)或是玻璃器皿中，向葉片滴加細(xì)胞裂解 液，之后，立即將其切碎，然后將切碎的葉片置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)染色體倍性；或者從步 驟5中獲得六片真葉以上的煙株上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一滴 1%碘一碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40X的顯微鏡下觀察 其染色體倍性。
[0012] 步驟1中所述的適齡花蕾指發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期即花萼與花冠等長(zhǎng)的花蕾，其 蕾長(zhǎng)范圍在2. 0-2. 4 cm之間； 步驟2中飽和Ca (ClO) 2溶液濃度為10%，其消毒時(shí)間為8-10 min ;無(wú)菌水沖洗2-3次， 每次為3-5 min ; 步驟3中花藥接種到H培養(yǎng)基上，溫度維持在25-27°C，每天光照時(shí)間為8-10 hr ; 步驟5中用于染色體加倍的秋水仙素溶液濃度為0. 4-0. 5%，加倍處理時(shí)間為48-72 hr ； 步驟6中只有流式細(xì)胞儀鑒定其染色體倍性為雙單倍體的煙苗才可在后續(xù)移栽中進(jìn) 行大田移栽； 步驟9中其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
[0013] 本發(fā)明所涉及的一種快速純合煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，具有構(gòu)思新穎、設(shè)計(jì)巧妙、 科學(xué)實(shí)用、節(jié)約時(shí)間等特點(diǎn)，適用于所有煙草類型，特別適用于白肋煙低煙堿轉(zhuǎn)化株的快速 純化。在白肋煙低危害（TSNAs)新品種選育過(guò)程中，此方法可有效用于親本和雜交后代的 快速純化，比傳統(tǒng)自己純化方法大大節(jié)省了時(shí)間，減少了材料后代性狀分離的比例，為減害 育種提供了一條新的有效途徑，有較大的應(yīng)用推廣價(jià)值。
[0014] 附表說(shuō)明（培養(yǎng)基配方均為公開配方） 表I :H和MS培養(yǎng)基母液配方； 表2 :H和MS培養(yǎng)基（1000 ml)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為已知普通栽培種白肋煙流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖； 圖2為單倍體流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖； 圖3為雙單倍體流式細(xì)胞儀倍性檢測(cè)圖； 圖4為單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖； 圖5為雙單倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖； 圖6為多倍體氣孔葉綠體數(shù)檢測(cè)示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0016] 實(shí)施例1、白肋煙高煙堿轉(zhuǎn)化株的純化，具體步驟依次如下： (1) 花蕾采集和保存：于晴天采集已經(jīng)鑒定為高煙堿轉(zhuǎn)化株的白肋煙煙株側(cè)花序上 無(wú)病蟲、生長(zhǎng)良好的、處于單核靠邊期的花蕾，其外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長(zhǎng)，蕾長(zhǎng)在 2. 0-2. 2 cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4-7 °C保存； (2) 消毒：在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)〔襟E1花蕾中的花藥，用無(wú)菌紗布包裹花藥并浸入70% 濃度的酒精中消毒15 s，快速取出且立即浸入濃度為10%的飽和Ca(ClO) 2溶液中，消毒8 min，輕輕晃動(dòng)燒杯以使消毒充分，最后用無(wú)菌水沖洗2次，每次5 min ; (3 )花藥接種與培養(yǎng)：將清洗后的花藥置于無(wú)菌的玻璃皿內(nèi)，用消毒后的鑷子輕取花藥 接種到H培養(yǎng)基上，消毒、封口后置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，室內(nèi)溫度設(shè)置為25°C，光照時(shí)間設(shè)定 為10 hr,利用電腦時(shí)控器來(lái)控制光照時(shí)間，用加濕器維持室內(nèi)一定的濕度以免培養(yǎng)基失水 過(guò)快影響花藥萌發(fā)； (4) 幼苗轉(zhuǎn)植：將萌發(fā)且長(zhǎng)到3葉期的幼苗轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上集中生長(zhǎng)（150 ml三角 瓶)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)以快速生根長(zhǎng)葉，每瓶放置5株幼苗，未萌發(fā)花粉繼續(xù)在原H培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基不夠時(shí)則及時(shí)將幼苗轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上； (5) 幼苗加倍：將生長(zhǎng)至5葉真葉期、高為2 cm左右的幼苗連根(大于此標(biāo)準(zhǔn)的苗子則 可用剪刀去根留莖）浸入到濃度為〇. 4%的秋水仙素溶液中，72 hr后取出浸入無(wú)菌水中4 min，不時(shí)晃動(dòng)燒杯以清洗徹底，然后轉(zhuǎn)植到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)成苗； (6) 染色體倍性檢測(cè)：取出步驟5中獲得煙株的上層葉片，葉片面積大小為2 cmX2 cm左右，放入細(xì)胞裂解液后，立即用鋒利的刀片切碎，然后將該混合液置于流式細(xì)胞儀 (BECKMAN，美國(guó)）中檢測(cè)染色體倍性，上樣后流式細(xì)胞儀自動(dòng)生成代表該樣品染色體倍性的 DNA含量分布圖（如圖2、3)。以已知普通栽培種白肋煙（圖1)作為對(duì)照來(lái)調(diào)整流式細(xì)胞儀， 使對(duì)照樣品DNA含量的波峰位于100道附近。然后測(cè)定待測(cè)樣本的波峰，出現(xiàn)在50道和 100道附近的峰值分別代表單倍體和雙單倍體，從而確定各煙苗的染色體倍性，只有染色 體倍性檢測(cè)為雙單倍體的煙苗才進(jìn)行大田移栽，加倍未成功的煙苗重復(fù)以上的加倍處理步 驟； (7) 煙苗移栽：待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12 cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗3-5 d，然后 將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直 接栽種于大田中； (8) 套袋留種：花期對(duì)煙株進(jìn)行套袋以自交留種。
[0017] (9)純化煙株鑒定：次年播種上年收獲的種子，團(tuán)棵期取樣檢測(cè)煙堿和降煙堿含 量，計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率，其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
[0018] 本實(shí)例中用于花藥培養(yǎng)的白肋煙高煙堿轉(zhuǎn)化材料其原始煙堿轉(zhuǎn)化率為60. 5%，屬 高煙堿轉(zhuǎn)化材料，但由于遺傳背景不純，正常自交一代后分離比較嚴(yán)重。只從同一株煙株上 取花藥進(jìn)行培養(yǎng)和染色體加倍試驗(yàn)，收獲種子后于次年播種，團(tuán)棵期隨機(jī)選取了 156株煙 株進(jìn)行乙烯處理和取樣檢測(cè)，結(jié)果表明，有2株的煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%，屬非轉(zhuǎn)化株，比例為 1. 28%，由自然突變引起；有6株的煙堿轉(zhuǎn)化率在5-20%之間，屬低轉(zhuǎn)化株，比例為3. 85%，由 不完全自然突變引起；其余148株的煙堿轉(zhuǎn)化率高于50%，屬高轉(zhuǎn)化株，比例為94. 87%，高煙 堿轉(zhuǎn)化株純化成功，高煙堿轉(zhuǎn)化特性得到了穩(wěn)定遺傳，這148株高轉(zhuǎn)化株可用于基礎(chǔ)理論 研究或者作為高轉(zhuǎn)化特別資源保存。
[0019] 實(shí)施例2、白肋煙非煙堿轉(zhuǎn)化株的純化，具體步驟依次如下： (1) 花蕾采集和保存：于陰天采集已經(jīng)鑒定為非煙堿轉(zhuǎn)化株的白肋煙煙株主花序上 無(wú)病蟲、生長(zhǎng)良好的、處于單核靠邊期的花蕾，其外觀表現(xiàn)為花萼與花冠大致等長(zhǎng)，蕾長(zhǎng)在 2. 2-2. 4 cm之間，取好的花蕾迅速用冰盒4-7 °C保存； (2) 消毒：在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)〔襟E1花蕾中的花藥，用無(wú)菌市售絲襪包裹花藥并浸入 75%濃度的酒精中消毒10 s，快速取出且立即浸入濃度為10%的飽和Ca(ClO) 2溶液中，消 毒10 min，輕輕晃動(dòng)燒杯以使消毒充分，最后用無(wú)菌水沖洗3次，每次3 min ; (3) 花藥接種與培養(yǎng)：將清洗后的花藥置于無(wú)菌的玻璃皿內(nèi)，用消毒后的鑷子輕取花藥 接種到H培養(yǎng)基上，消毒、封口后置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，室內(nèi)溫度設(shè)置為27°C，光照時(shí)間設(shè)定 為8 hr,利用電腦時(shí)控器來(lái)控制光照時(shí)間，用加濕器維持室內(nèi)一定的濕度以免培養(yǎng)基失水 過(guò)快影響花藥萌發(fā)； (4) 幼苗轉(zhuǎn)植：將萌發(fā)且長(zhǎng)到2葉期的幼苗轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上集中生長(zhǎng)（150 ml三角 瓶)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)以快速生根長(zhǎng)葉，每瓶放置6株幼苗，未萌發(fā)花粉繼續(xù)在原H培養(yǎng)基上培養(yǎng)， 若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基不夠時(shí)則及時(shí)將幼苗轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上； (5) 幼苗加倍：將生長(zhǎng)至6葉真葉期、高為3 cm左右的幼苗連根(大于此標(biāo)準(zhǔn)的苗子則 可用剪刀去根留莖）浸入到濃度為〇. 5%的秋水仙素溶液中，48 hr后取出浸入無(wú)菌水中5 min，不時(shí)晃動(dòng)燒杯以清洗徹底，然后轉(zhuǎn)植到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)成苗； (6) 染色體倍性檢測(cè)：取步驟5中六片真葉以上的煙株葉片，用手小心地撕下葉片的下 表皮并置于載玻片上，滴一滴1 %碘一碘化鉀溶液染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切 片放在40X的顯微鏡下，每切片隨機(jī)選取5個(gè)氣孔觀察計(jì)數(shù)(如圖4、5、6)，以每個(gè)氣孔葉綠 體平均個(gè)數(shù)在14個(gè)以下的為單倍體(如圖4)，14 一 24個(gè)的為雙單倍體(如圖5)，24個(gè)以上 的為多倍體(如圖6)。只有染色體倍性檢測(cè)為雙單倍體的煙苗才進(jìn)行大田移栽，加倍未成功 的煙苗重復(fù)以上的加倍處理步驟； (7) 煙苗移栽：待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12 cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗3-5 d，然后 將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季節(jié)直 接栽種于大田中； (8)套袋留種：花期對(duì)煙株進(jìn)行套袋以自交留種。
[0020] (9)純化煙株鑒定：次年播種上年收獲的種子，團(tuán)棵期取樣檢測(cè)煙堿和降煙堿含 量，計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率，其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
[0021] 本實(shí)例中用于花藥培養(yǎng)的白肋煙非煙堿轉(zhuǎn)化材料其原始煙堿轉(zhuǎn)化率為3. 5%，屬 非煙堿轉(zhuǎn)化材料，復(fù)雜的遺傳背景導(dǎo)致自交后代煙堿轉(zhuǎn)化性狀嚴(yán)重分離。只選定一棵煙株 作為取樣株以開展培養(yǎng)和染色體加倍試驗(yàn)。收獲種子后于次年播種，團(tuán)棵期隨機(jī)選取了 149株煙株進(jìn)行乙烯處理和取樣檢測(cè)，結(jié)果表明，有3株的煙堿轉(zhuǎn)化率高于50%，屬高轉(zhuǎn)化 株，比例為2. 0%，由自然突變引起；有4株的煙堿轉(zhuǎn)化率在5-20%之間，屬低轉(zhuǎn)化株，比例 為2. 68%，由不完全自然突變引起；其余142株的煙堿轉(zhuǎn)化率低于5%，屬非轉(zhuǎn)化株，比例為 95. 3%，非煙堿轉(zhuǎn)化株純化成功，非煙堿轉(zhuǎn)化特性得到了穩(wěn)定遺傳，這142株非轉(zhuǎn)化株直接 可用于低煙堿轉(zhuǎn)化白肋煙新品種選育或非轉(zhuǎn)化資源保存。
[0022] 表I :H和MS培養(yǎng)基母液配方：

【權(quán)利要求】
1. 一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于依次按以下操作步驟進(jìn)行： 步驟1 :花蕾采集和保存：采集煙草植株主花序或側(cè)花序上健康的適齡花蕾，用冰盒迅 速密封保存； 步驟2 :消毒：在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)〔襟E1花蕾中的花藥，用無(wú)菌紗布或無(wú)菌市售絲襪 包裹花藥并浸入70-75%濃度的酒精中消毒10-15 s，快速取出且立即浸入飽和Ca (CIO) 2溶 液中，輕輕晃動(dòng)燒杯以使消毒充分，最后用無(wú)菌水沖洗多次； 步驟3 :花藥接種與培養(yǎng)：將清洗后的花藥置于無(wú)菌的玻璃皿內(nèi)，用消毒后的鑷子輕取 花藥接種到Η培養(yǎng)基上，消毒、封口后置于培養(yǎng)架上培養(yǎng)，要求室內(nèi)溫度維持在25-27°C，每 天光照8-10 hr，利用電腦時(shí)控器來(lái)控制光照時(shí)間，用加濕器維持室內(nèi)一定的濕度以免培養(yǎng) 基失水過(guò)快影響花藥萌發(fā)； 步驟4 :幼苗轉(zhuǎn)植：將萌發(fā)且長(zhǎng)到2-3葉期的幼苗轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基上集中生長(zhǎng)（150 ml 三角瓶)，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)以快速生根長(zhǎng)葉，每瓶放置5-6株幼苗，未萌發(fā)花粉繼續(xù)在原Η培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基不夠時(shí)則及時(shí)將幼苗轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上； 步驟5 :幼苗加倍：將生長(zhǎng)至5-6真葉期、高為1-2 cm左右的幼苗連根(大于此標(biāo)準(zhǔn)的 苗子則可用剪刀去根留莖)浸入到濃度為〇. 4-0. 5%的秋水仙素溶液中，48-72 hr后取出浸 入無(wú)菌水中3-5 min，不時(shí)晃動(dòng)燒杯以清洗徹底，然后轉(zhuǎn)植到MS培養(yǎng)基上，繼續(xù)培養(yǎng)成苗； 步驟6 :染色體倍性檢測(cè)：用流式細(xì)胞儀鑒定煙苗的染色體倍性，檢測(cè)為雙單倍體的煙 苗才可后續(xù)進(jìn)行大田移栽，加倍未成功的幼苗重復(fù)以上的加倍處理步驟； 步驟7:煙苗移栽：待煙苗健壯且有8-9片真葉、10-12 cm高時(shí)，敞開瓶口煉苗3-5 d， 然后將煙苗根系上附帶的培養(yǎng)基徹底清洗掉，移栽到溫室的花缽中假植或者于煙苗移栽季 節(jié)直接栽種于大田中； 步驟8 :套袋留種：花期對(duì)煙株進(jìn)行套袋以自交留種； 步驟9 :純化煙株鑒定：次年播種上年收獲的種子，團(tuán)棵期取樣檢測(cè)煙堿和降煙堿含量 以計(jì)算煙堿轉(zhuǎn)化率，其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：所述方 法還包括染色體倍性的檢測(cè)步驟，其具體操作如下：從步驟5中獲得的煙株上采取小面積 的無(wú)菌苗葉片放置在無(wú)菌試驗(yàn)臺(tái)或是玻璃器皿中，向葉片滴加細(xì)胞裂解液，之后，立即將其 切碎，然后將切碎的葉片置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)染色體倍性；或者從步驟5中獲得六片真 葉以上的煙株上采取葉片，取葉片的下表皮并置于載玻片上，滴入一滴1%碘一碘化鉀溶液 染色，蓋上載玻片，制成切片，把制好的切片放在40 X的顯微鏡下觀察其染色體倍性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征是：步驟1 中所述的適齡花蕾指發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期即花萼與花冠等長(zhǎng)的花蕾，其蕾長(zhǎng)范圍在 2·0 _2·4 cm 之間。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：步驟2 中飽和Ca (C10) 2溶液濃度為10%，其消毒時(shí)間為8-10 min ;無(wú)菌水沖洗2-3次，每次為3-5 min〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：步驟3 中花藥接種到Η培養(yǎng)基上，溫度維持在25-27°C，每天光照時(shí)間為8-10 hr。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：步驟5 中用于染色體加倍的秋水仙素溶液濃度為0. 4-0. 5%，加倍處理時(shí)間為48-72 hr。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：步驟6 中只有流式細(xì)胞儀鑒定其染色體倍性為雙單倍體的煙苗才可在后續(xù)移栽中進(jìn)行大田移栽。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速純化煙草煙堿轉(zhuǎn)化株的方法，其特征在于：步驟9 中其煙堿轉(zhuǎn)化屬性與原始材料一致的即為純化成功的煙株。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104285789SQ201410488974
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】蔡長(zhǎng)春, 程玲, 馮吉, 余君 申請(qǐng)人:湖北省煙草科學(xué)研究院