一種黃麻的組織培養快繁方法
【專利摘要】本發明公開了一種黃麻的組織培養快繁方法，即以莖尖為外植體建立了黃麻離體快繁體系，為黃麻轉基因育種提供實驗材料。本發明以莖尖為外植體，通過愈傷組織誘導、分化培養、不定芽誘導、根苗誘導以及試管苗馴化移栽等過程實現了黃麻的組織培養快速繁殖，對黃麻轉基因研究具有重要的應用價值。
【專利說明】 一種黃麻的組織培養快繁方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及農業生物技術中植物組織培養的方法，具體地說，涉及一種黃麻的組織培養快繁方法。

【背景技術】
[0002]黃麻是椴樹科黃麻屬一年生草本韌皮纖維作物，也是世界上重要的長纖維作物之一，是麻紡工業的重要原料，世界上黃麻的產量和種植面積僅次于棉花。黃麻具纖維產量高，吸濕性強、透氣性好等優點。
[0003]在其他麻類作物的離體快速繁殖、原生質體質分離培養、體細胞胚發生和器官發生等組織培養方面已取得了較大的突破，但由于過去黃麻韌皮纖維應用范圍僅限于編制麻袋、經濟效益低下，導致對黃麻作物的研究較為滯后，至今為止，尚未見有關黃麻離體再生體系系統的所道，這嚴重制約著黃麻遺傳育種研究的發展。因此，非常有必要建立系統的黃麻離體快繁體系，為今后對黃麻進行品質遺傳改良奠定基礎。


【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種黃麻的組織培養快繁方法，本發明以莖尖為外植體，通過愈傷組織誘導、分化培養、不定芽誘導、根苗誘導以及試管苗馴化移栽等過程實現了黃麻的組織培養快速繁殖，對黃麻轉基因研究具有重要的應用價值。
[0005]本發明的一種黃麻的組織培養快繁方法，包括以下的工藝步驟:
(I)外植體的處理:選取當年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗10?30min，于超凈工作臺中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無菌水沖洗3?5次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發培養基中于每天光照10?11小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至得到無菌苗。
[0006](2)愈傷組織誘導:剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養5?10天，然后置于每天光照10?16小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織。
[0007](3)增殖培養:愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至增殖培養基中進行增殖培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，15?20天轉接一次。
[0008](4)分化培養:將培養至15?20天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在25?28°C條件下全暗培養2?5天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽。
[0009](5)生根培養:將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至長出根。
[0010](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中。
[0011]上述步驟(I)所述的種子萌發培養基為:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0012]上述步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.1?1.0mg/L TDZ+1.0?2.0mg/LNAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0013]上述步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1?1.0mg/L NAA+1.0?2.0mg/L6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0014]上述步驟(4)所述的分化培養基為:MS+1?2mg/L 6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH值為5.4?5.8。
[0015]上述步驟(5)所述的生根培養基為:MS+0.1?0.5mg/L 6-BA+1?2mg/LNAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6% 瓊脂 +0.05% ?0.1% 活性炭，pH 值為 5.4 ?5.8。
[0016]目前尚未見有關黃麻離體再生體系系統的所道，這嚴重制約著黃麻遺傳育種研究的發展。因此，本發明的實施可為今后對黃麻進行品質遺傳改良奠定基礎。

【具體實施方式】
[0017]以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。
[0018]實施例1
(I)外植體的處理:選取當年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗lOmin，于超凈工作臺中以75%乙醇溶液浸泡10s，無菌水沖洗3次，再用含有0.01%吐溫-20的0.1%升汞溶液消毒5min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發培養基中于每天光照10小時，光照強度為1500x，培養溫度為25°C的條件下培養直至得到無菌苗，所述的萌發培養基為:MS+ 0.lmg/LGA3+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，PH值為5.8。
[0019](2)愈傷組織誘導:剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照10小時，光照強度為15001x，培養溫度為25°C的條件下培養35天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導率為85%。所述的誘導培養基為:MS+0.lmg/L TDZ+1.0mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0020](3)增殖培養:愈傷組織生長至15天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至增殖培養基中進行增殖培養，接種后先在25°C條件下全暗培養5天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養，15天轉接一次。所述的增殖培養基為:MS+0.lmg/L NAA+1.0mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0021](4)分化培養:將培養至15天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在25°C條件下全暗培養3天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為25V的條件下培養18天即可形成不定芽。所述的分化培養基為:MS+lmg/L 6-BA+0.lmg/L NAA+100mg/L HC+2.0% 蔗糖+0.4% 瓊脂+0.05% 活性炭，pH 值為
5.8。
[0022](5)生根培養:將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在25°C條件下全暗培養9天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為25°C的條件下培養14天即長出根。
[0023](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中，移栽成活率達91%。
[0024]實施例2
(I)外植體的處理:選取當年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗20min，于超凈工作臺中以80%乙醇溶液浸泡15s，無菌水沖洗4次，再用含有0.03%吐溫-20的0.5%升汞溶液消毒7min，無菌水沖洗3次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發培養基中于每天光照11小時，光照強度為2000x，培養溫度為28°C的條件下培養直至得到無菌苗，所述的萌發培養基為:MS+ 0.4mg/LGA3+2.5%蔗糖+0.38%瓊脂+0.1%活性炭，pH值為5.8。
[0025](2)愈傷組織誘導:剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在28°C條件下全暗培養7天，然后置于每天光照12小時，光照強度為20001x，培養溫度為28°C的條件下培養37天即可形成愈傷組織，愈傷組織誘導率為88%。所述的誘導培養基為:MS+0.2mg/L TDZ+1.3mg/L NAA+2.5%蔗糖+0.35%瓊脂+0.05%活性炭，pH值為5.8。
[0026](3)增殖培養:愈傷組織生長至15天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至增殖培養基中進行增殖培養，接種后先在28°C條件下全暗培養6天，然后置于每天光照13小時，光照強度為25001x，培養溫度為28°C的條件下培養，18天轉接一次。所述的增殖培養基為:MS+0.5mg/L NAA+1.2mg/L 6-BA+2.5% 蔗糖 +0.35% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為 5.8。
[0027](4)分化培養:將培養至15天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在28°C條件下全暗培養4天，然后置于每天光照15小時，光照強度為25001x，培養溫度為25V的條件下培養20天即可形成不定芽。所述的分化培養基為:MS+1.2mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA+180mg/L HC+2.0% 蔗糖 +0.4% 瓊脂 +0.05% 活性炭，pH 值為5.8。
[0028](5)生根培養:將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在28°C條件下全暗培養10天，然后置于每天光照12小時，光照強度為25001x，培養溫度為28°C的條件下培養17天即長出根。
[0029](6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中，移栽成活率達93%。
【權利要求】
1.一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于包括以下工藝步驟: (1)外植體的處理:選取當年收飽滿的黃麻種子，以洗潔精水輕輕刷洗，置于自來水中沖洗10?30min，于超凈工作臺中以75?80%乙醇溶液浸泡10?30s，無菌水沖洗3?5次，再用含有0.01?0.05%吐溫-20的0.1?0.5%升汞溶液消毒5?lOmin，無菌水沖洗3?5次后用無菌濾紙吸干表面的水分，并接種于種子萌發培養基中于每天光照10?11小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至得到無菌苗； (2)愈傷組織誘導:剪取無菌苗莖尖部分約0.2?0.3cm,并接種到誘導培養基上進行愈傷組織誘導培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養5?10天，然后置于每天光照10?16小時，光照強度為1500?25001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成愈傷組織； (3)增殖培養:愈傷組織生長至15?25天后，將長勢良好的愈傷組織轉接至增殖培養基中進行增殖培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養3?7天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養，15?20天轉接一次； (4)分化培養:將培養至15?20天的長勢良好的愈傷組織轉接至分化培養基中進行不定芽誘導，接種后先在25?28°C條件下全暗培養2?5天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至形成不定芽； (5)生根培養:將分化出的不定芽長至2?3cm接種至生根培養基中進行生根培養，接種后先在25?28°C條件下全暗培養7?14天，然后置于每天光照12?16小時，光照強度為2000?30001x，培養溫度為25?28°C的條件下培養直至長出根； (6)試管苗移栽:將長至8?1cm的生根試管苗的培養瓶瓶蓋打開并置于自然光照下煉苗5?7天后，將試管苗從培養瓶中取出，洗掉根部培養基，盡量不傷害根部，栽入由黃沙土和火碳泥(I:1)混合成的基質中并定植于大田中。
2.根據權利要求1所述的一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(I)所述的種子萌發培養基為:MS+ 0.1?0.3mg/LGA3+2.5%?3.5%蔗糖+0.35%?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
3.根據權利要求1所述的一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(2)所述的誘導培養基為:MS+0.1 ?L Omg/L TDZ+1.0 ?2.0mg/L NAA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
4.根據權利要求1所述的一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(3)所述的增殖培養基為:MS+0.1 ?1.0mg/L NAA+1.0 ?2.0mg/L 6-BA+2.5% ?3.5% 蔗糖 +0.35% ?0.5%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
5.根據權利要求1所述的一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(4)所述的分化培養基為:MS+1 ?2mg/L 6-BA+0.1 ?0.5mg/L NAA+100 ?200mg/L HC+2.0% ?2.5%蔗糖+0.4%?0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
6.根據權利要求1所述的一種黃麻的組織培養快繁方法，其特征在于步驟(5)所述的生根培養基為:MS+0.1 ?0.5mg/L 6-BA+1 ?2mg/L NAA+2.0% ?2.5% 蔗糖 +0.4% ?0.6%瓊脂+0.05%?0.1%活性炭，pH值為5.4?5.8。
【文檔編號】A01H4/00GK104285817SQ201410607817
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月3日 優先權日:2014年11月3日
【發明者】楊業容 申請人:楊業容