本發明屬于多倍體育種領域，具體涉及一種離體誘導百合異源四倍體的方法。
背景技術：
：百合屬于百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)植物，是世界上重要的球根類花卉。種間遠緣雜交是培育百合新品種的重要手段。然而大部分遠緣雜種，由于減數分裂過程中染色體不能正常的配對和分離，種間雜種往往表現高度的不育；限制了其進一步的改良和百合的漸滲育種。多倍化能解決這一問題，通過有性多倍體(2n配子誘導)和無性多倍化(體細胞染色體加倍)，已成功培育出大量的百合種間雜種，如LA(Longiflorum×Asiatic)、OT(Oriental×Trumpet)和LO(Longiflorum×Oriental)雜種系等(Barba-GonzalezR,LimK-B，VanTuylJM.MolecularCytogeneticsinLiliumBreeding.In:IIIInternationalSymposiumontheGenusLilium1027.2014,129-142)。絕大多數的百合，從播種到開花需要2-3年的時間。目前栽培的品種通過鱗片扦插或組培繁殖形成的小籽球開花也需要2-3年(KhanN.Amolecularcytogeneticstudyofintergenomicrecombinationandintrogressionofchromosomalsegmentsinlilies.PhD-thesis,WageningenUniversityandResearchCentre.2009,2-3)。新鐵炮百合與其他的百合品種相比，具有生育期短，早花的特性(即從播種到開花僅需6-8個月)，種球繁育周期短、并具有耐熱的特點；但其花色單一，為白色；花型為喇叭型(SatoT,MiyoshiKandOkazakiK.Inductionof2ngametesand4nembryoinLilium(Lilium×formolongihort.)byNitrousOxideGasTreatment).In:XXIIIInternationalEUCARPIASymposium,SectionOrnamentals,ColourfulBreedingandGenetics-PartII855.2009,243-248)。而東方百合雜種系花大，艷麗，花香濃郁，抗灰霉病，但其種球繁育周期較長。因此，進行新鐵炮百合和東方百合雜種系間的雜交，是培育生育期短、抗熱、花色和花型豐富百合新品種的重要途徑。本課題組通過受精前障礙克服和胚拯救技術獲得了這兩大雜種系間的雜種苗，具體獲得雜種材料的方法參見公開號為105123528A的中國專利申請《新鐵炮百合遠緣雜交早期不同發育階段胚拯救方法》，經選擇后所獲得雜種優株‘回歸’(已具有品種名登錄權)遺傳了雙親的優良特性，即具有新鐵炮百合的早花特性，直徑為1cm左右的組培鱗莖種植8-9個月就能正常開花，且花大，具有淡香。但其配子完全不育，為進一步改良，需要恢復其育性。已有研究表明，秋水仙素、氨磺靈和氟樂靈成功地用于百合屬離體染色體加倍(VanTuylJM,MeijerBandVanDienMP.TheuseoforyzalinasanalternativeforcolchicineinvitrochromosomedoublingofLiliumandNerine.In:VIInternationalSymposiumonFlowerBulbs325.1992,625-630；TakamuraT,LimKBandVanTuylJM.EffectofanewcompoundonthemitoticpolyploidizationofLiliumlongiflorumandorientalhybridlilies.In:XXInternationalEucarpiaSymposium,SectionOrnamentals,StrategiesforNewOrnamentals-PartII572.2001,37-42.)。但目前存在加倍過程中污染嚴重、嵌合體和誘導率低等問題(VanTuylJ.Researchonmitoticandmeioticpolyploidizationinlilybreeding[J].Herbertia.1989,45:97-103；池堅等.東方百合Siberia多倍體誘導及其細胞學鑒定[J].分子植物育種,2008,6(2)：291-296.)。因此，結合百合鱗片不定芽分化特性，創建了秋水仙素離體誘導多倍體的技術體系。該發明對百合遠緣雜種育性恢復、遺傳改良和短生育期新品種培育具有重要的作用。技術實現要素：建立一套完整、高效的百合遠緣雜種離體誘導染色體加倍技術，本發明的目的在于提供一種新鐵炮百合遠緣雜種離體誘導異源四倍體的方法，具體步驟如下：1)預培養：組培新鐵炮百合遠緣雜種得到小鱗莖，將小鱗莖的鱗片切片，接種到不定芽誘導培養基上預培養，得到預培養后的鱗片切片；2)秋水仙素溶液配制：將秋水仙素用二甲基亞砜(DMSO)助溶后配制成質量百分含量0.05-0.1％的溶液，高壓滅菌，得到秋水仙素溶液；3)多倍體誘導：將1)所述預培養后的鱗片切片清洗后浸泡于2)所述秋水仙素溶液中進行誘導處理，得到誘導后的鱗片切片；4)純合四倍體的誘導和培養：將3)所述誘導后的鱗片切片清洗后，接種于不定芽誘導培養基中循環繼代培養得到再生植株，轉入叢生芽生長培養基中培養，得到長大的再生植株；5)鱗莖膨大培養：將4)所述長大的再生植株接種于高糖培養基培養，得到鱗莖膨大植株；6)生根培養：將5)所述鱗莖膨大植株接種到生根培養基上培養，得到生根的鱗莖膨大植株；7)倍性鑒定：鑒定染色體倍性挑選四倍體，至此得到完整的百合異源四倍體。所述的不定芽誘導培養基為現有技術已公開的百合不定芽誘導培養基，優選為：以MS培養基為基本培養基，6-BA濃度為2.0mg/L、NAA濃度為0.1mg/L、蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所述的叢生芽生長培養基為現有技術已公開的百合叢生芽生長培養基，優選為：以MS培養基為基本培養基，6-BA濃度為1.0mg/L、NAA濃度為0.2mg/L、蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所述的高糖培養基為現有技術已公開的百合高糖培養基，優選為：以MS培養基為基本培養基，蔗糖的質量百分含量為8％、活性炭濃度為1g/L、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所述生根培養基為現有技術已公開的百合生根培養基，優選為：以MS培養基為基本培養基，NAA濃度為0.2mg/L，蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。其中，步驟1)所述新鐵炮百合遠緣雜種，為新鐵炮百合遠緣雜交后進行胚拯救得到雜交組培苗，具體獲得方式參見公開號為105123528A的中國專利申請《新鐵炮百合遠緣雜交早期不同發育階段胚拯救方法》。所述新鐵炮百合遠緣雜種優選為‘回歸’(已具有品種名登錄權)，該品種具有新鐵炮百合的早花特性，直徑為1cm左右的組培鱗莖種植8-9個月就能正常開花，且花大，具有淡香。其中，所述秋水仙素溶液優選質量百分含量0.05％。其中，步驟1)所述組培新鐵炮百合遠緣雜種得到小鱗莖，為在高糖培養基中22±2℃，暗培養至得到直徑為1.6-1.8cm的小鱗莖。暗培養時間優選6周。其中，步驟1)所述小鱗莖的鱗片，為剝取小鱗莖外層和中層鱗片。其中，所述切片，為橫切成寬5-7mm的切片。其中，步驟1)所述預培養的時間為7-25天，優選7天。其中，步驟2)所述秋水仙素用二甲基亞砜助溶，秋水仙素粉末用質量百分含量2％的二甲基亞砜溶液助溶。其中，步驟2)所述配制成質量百分含量0.05-0.1％的溶液，先配制成質量百分含量1％的母液，存放在棕色瓶4℃保存，使用時稀釋母液至使用濃度。其中，步驟2)所述高壓滅菌為118℃滅菌18分鐘。其中，步驟3)所述誘導處理為在組培室內靜置培養。其中，步驟3)所述誘導處理的時間為18-36小時，優選24小時。其中，步驟4)所述循環繼代培養，每代培養6周，優選繼代3次。其中，步驟4)所述叢生芽生長培養基中培養，培養時間為6周。其中，步驟4)所述高糖培養基培養，培養時間為6周。其中，步驟3)、步驟5)的環境條件為22±2℃暗培養。其中，步驟1)、步驟4)、步驟6)的環境條件為溫度22±2℃，光照強度35μmolm-2s-1，光照時間16小時/天。本發明的離體誘導百合異源四倍體的方法，優選為具體步驟如下：1)預培養：組培新鐵炮百合遠緣雜種得到小鱗莖，將小鱗莖的鱗片切片，接種到不定芽誘導培養基上預培養7天，得到預培養后的鱗片切片；2)秋水仙素溶液配制：將秋水仙素用二甲基亞砜助溶后配制成質量百分含量0.05％的溶液，高壓滅菌，得到秋水仙素溶液；3)多倍體誘導：將1)所述預培養后的鱗片切片清洗后浸泡于2)所述秋水仙素溶液中進行誘導處理24小時，得到誘導后的鱗片切片；4)純合四倍體的誘導和培養：將3)所述誘導后的鱗片切片清洗后，接種于不定芽誘導培養基中循環繼代培養得到再生植株，轉入叢生芽生長培養基中培養，得到長大的再生植株；5)鱗莖膨大培養：將4)所述長大的再生植株接種于高糖培養基培養，得到鱗莖膨大植株；6)生根培養：將5)所述鱗莖膨大植株接種到生根培養基上培養，得到生根的鱗莖膨大植株；7)倍性鑒定：鑒定染色體倍性挑選四倍體，至此得到完整的百合異源四倍體。本發明還提供所述的離體誘導百合異源四倍體的方法在百合育種中的應用。本發明針對百合鱗片不定芽分化特性，首先在誘導前對材料進行預培養；改進常規的多倍體離體誘導流程，包括用低濃度二甲基亞砜(2％)助溶秋水仙素并高壓滅菌，秋水仙素處理后的材料在不定芽誘導培養基上進行3個循環的繼代培養，將嵌合體加以分離；之后轉接到6-BA濃度降低的生長培養基中，促使叢生芽生長；經過養球和生根培養階段，獲得大量的純合四倍體。本發明克服一般多倍體離體誘導過程中污染嚴重、嵌合體和誘導率低的缺陷；誘導方法操作簡易，誘導成功率高；獲得的四倍體植株經栽培生長正常，倍性穩定；本發明可作為百合遠緣雜種育性恢復、遺傳改良和異源四倍體新品種培育的重要方法。本發明的有益效果在于：1.本發明以新鐵炮百合雜種無菌試管小鱗莖分化不定芽能力較強的外層和中層鱗片基部為材料，鱗片經預培養后，直接浸泡于用2％二甲基亞砜(DMSO)助溶、高壓滅菌的秋水仙素溶液中，靜置，暗培養。不同于傳統秋水仙素直接處理鱗片，秋水仙素無菌水溶解和抽濾滅菌，培養于液體培養基進行搖床震蕩培養。此方法可增加秋水仙素的滲透性，提高誘導效果，并降低誘導過程中材料的污染。2.進行預培養同步了細胞有絲分裂，秋水仙素處理后的材料在不定芽誘導培養基上進行3個循環的培養，分離了嵌合體；再經過叢生芽生長(叢生芽生長培養基培養)、養球(高糖培養基培養)和生根培養(生根培養基培養)階段，獲得純合異源四倍體。3.誘導成功的四倍體植株，經馴化移栽生長正常，為培育早花和種球繁育周期短的新品種創造新種質。附圖說明圖1從左至右分別是預實驗中小鱗莖鱗片切片預培養7天、15天和25天的照片；圖2從左至右分別是實施例1中二倍體的流式細胞圖、根尖染色體光學顯微鏡照片及下表皮氣孔光學顯微鏡照片。圖3從左至右分別是實施例1中四倍體的流式細胞圖、根尖染色體光學顯微鏡照片及下表皮氣孔光學顯微鏡照片。圖4從左至右分別是二倍體鱗片切片增殖生長，高糖培養植株和溫室移栽4月齡苗的照片。圖5從左至右分別是四倍體鱗片切片增殖生長，高糖培養植株和溫室移栽4月齡苗的照片。具體實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。預實驗以公開號為105123528A的中國專利申請《新鐵炮百合遠緣雜交早期不同發育階段胚拯救方法》中的方法選育，品種登錄名稱為‘回歸’，具有新鐵炮百合的早花特性，直徑為1cm左右的組培鱗莖種植8-9個月就能正常開花，且花大，具有淡香。預實驗通過對無菌試管小鱗莖鱗片切片不同預培養時間，不同秋水仙素濃度及不同處理時間三個因素的三個水平設計正交試驗(見表1)。表1預培養時間、秋水仙素濃度和處理時間對誘導效果的影響為比較各因素對存活植株數和四倍體誘導率的影響程度，對統計結果進行多變量多因素方差分析，結果如表2所示：鱗片切片預培養時間、秋水仙素濃度與浸泡時間對成活植株數影響較小，不存在顯著性差異(p>0.05)，對四倍體誘導率的影響均具有極顯著差異(p<0.01)。表2預培養時間、秋水仙素濃度和處理時間對再生存活植株數和四倍體誘導率的影響注：a.R方＝.330(調整R方＝.082)b.R方＝.848(調整R方＝.803).**表示p<0.01差異極顯著。進一步對各因素加以多重比較分析，結果如表3所示。各預培養時間(7天，15天和25天)之間存在顯著差異，預培養7天所得的誘導率最高。對于秋水仙素濃度，0.00％與0.05％或0.1％之間存在顯著性差異，0.05％和0.1％之間差異不顯著，考慮到經濟效益，選擇0.05％秋水仙素為佳。不同秋水仙素處理時間(18h,24h和36h)對四倍體誘導率存在顯著差異，以處理24h誘導率最高。表3預培養時間、秋水仙素濃度和處理時間對四倍體誘導率的顯著水平比較注：同列數據小寫字母表示p<0.05顯著水平，相同字母之間表示差異不顯著，不同字母之間表示差異顯著。綜上所述，新鐵炮百合遠緣雜種無菌鱗片切片異源四倍體誘導的最佳處理組合為：鱗片切片預培養7天、0.05％的秋水仙素處理24h。正交試驗篩選的最佳組合正好為正交表中的處理組合2。實施例1一種離體誘導百合異源四倍體的方法本實施例用于說明本發明中通過正交試驗篩選出的最佳四倍體誘導組合，即百合鱗片切片預培養7天、0.05％的秋水仙素處理24h。1.材料與方法以公開號為105123528A的中國專利申請《新鐵炮百合遠緣雜交早期不同發育階段胚拯救方法》中的方法選育，品種登錄名‘回歸’。所用的不定芽誘導培養基為：以MS培養基為基本培養基，6-BA濃度為2.0mg/L、NAA濃度為0.1mg/L、蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所用的叢生芽生長培養基為：以MS培養基為基本培養基，6-BA濃度為1.0mg/L、NAA濃度為0.2mg/L、蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所用的高糖培養基為：以MS培養基為基本培養基，蔗糖的質量百分含量為8％、活性炭濃度為1g/L、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。所用生根培養基為：以MS培養基為基本培養基，NAA濃度為0.2mg/L，蔗糖的質量百分含量為3％、瓊脂的質量百分含量為0.7％、pH值為5.8的培養基。1)預培養：高糖培養基培養新鐵炮百合遠緣雜種‘回歸’得到直徑為1.6-1.8cm的無菌百合試管小鱗莖，剝取鱗莖外層和中層鱗片，橫切成5-7mm寬的切片，用無菌水清洗2-3次，每次浸泡2min，滅菌濾紙吸干水分，接種到不定芽誘導培養基上預培養7天，得到預培養后的鱗片切片；培養條件：溫度為(22±2)℃，光照強度為35μmol·m-2·s-1，光照時間為16小時/天。2)秋水仙素溶液配制：將秋水仙素粉末用質量百分含量2％的二甲基亞砜溶液助溶，以無菌水配制成質量百分含量為1％母液，存放在棕色瓶4℃保存。稀釋母液至質量百分含量為0.05％，取50ml至培養瓶，高壓滅菌，溫度為118℃，時間為18min，得到秋水仙素溶液；3)多倍體誘導：將1)所述預培養后的鱗片切片，無菌水清洗2-3次，每次清洗浸泡2min以去除其上附著的培養基，滅菌濾紙吸干水分，浸泡于質量百分含量為0.05％的秋水仙素溶液中，靜置于組培室暗培養24h進行誘導處理，每次處理10塊鱗片切片，重復3次。培養條件：溫度為(22±2)℃，暗培養(用黑布覆蓋)，得到誘導后的鱗片切片；4)純合四倍體的誘導和培養：將3)所述誘導后的鱗片切片用無菌水清洗2-3次，每次浸泡2min，滅菌濾紙吸干水分，接種于不定芽誘導培養基中循環繼代培養，培養條件：溫度為(22±2)℃，光照強度為35μmol·m-2·s-1，光照時間為16小時/天。繼代增殖培養3次，每次間隔時間為6周得到再生植株，轉入叢生芽生長培養基中培養，培養條件：溫度為(22±2)℃，光照強度為35μmol·m-2·s-1，光照時間為16小時/天。培養6周得到長大的再生植株；5)鱗莖膨大培養：將4)所述長大的再生植株接種于高糖培養基培養，培養溫度為(22±2)℃，暗培養(無燈管照明的狀態下)6周，得到鱗莖膨大植株；6)生根培養：將5)所述鱗莖膨大植株接種到生根培養基上培養，培養條件：溫度為(22±2)℃，光照強度為35μmol·m-2·s-1，光照時間為16小時/天。7)倍性鑒定：將步驟6)所述生根培養1周的生根的鱗莖膨大植株利用流式細胞分析儀結合根尖染色體計數法鑒定倍性，圖2是二倍體的流式細胞圖、根尖染色體(染色體數2n＝2x＝24)及下表皮氣孔在光學顯微鏡下的照片。圖3是四倍體的流式細胞圖、根尖染色體(染色體數2n＝4x＝48)及下表皮氣孔在光學顯微鏡下的照片。統計鱗片秋水仙素浸泡處理31周后再生的存活植株數及四倍體誘導率。統計結果不包含嵌合體和八倍體植株數。圖4為二倍體鱗片切片增殖生長，高糖培養植株和溫室移栽4月齡苗的照片。圖5為四倍體鱗片切片增殖生長，高糖培養植株和溫室移栽4月齡苗的照片統計結果顯示，存活植株數均值為36株，四倍體誘導率均值為51％。經所述鑒定為四倍體的植株轉接至高糖培養基再培養6周。培養溫度(22±2)℃，暗培養(無燈管照明的狀態下)。將所述高糖培養的試管鱗莖(直徑1-2cm)放置于4℃條件下兩個月(一般為9周)打破休眠。試管鱗莖煉苗移栽：試管鱗莖在室溫條件下煉苗3天，前兩天瓶蓋關閉，第三天打開，洗去根部附著培養基，質量百分含量0.2％多菌靈浸泡20min，種植于溫室，進行種苗正常管理，移栽成活率95％。基生葉表型比較：選取溫室栽培4月齡的二倍體和四倍體植株，比較初期基生葉表型差異和下表皮氣孔長度。由于四倍體基因組DNA的復制，四倍體基生葉在形態和組織結構表現出明顯差異(見表4)，四倍體比二倍體表現出葉長變短，葉寬變長，導致葉型指數變小，葉片肥厚濃綠，葉表明粗糙，氣孔變長，株型緊湊。表4雜種苗二倍體和四倍體基生葉表型比較倍性葉長/cm葉寬/cm葉厚/mm葉長/葉寬氣孔長/μm二倍體18.81±0.46a2.18±0.06b0.45±0.01b8.71±0.27a69.94±0.51b四倍體17.11±0.39b2.39±0.06a0.58±0.02a7.19±0.17b104.53±0.87a注：每一數值代表溫室種植4個月，二倍體和四倍體各測量30株，每株從外到內第7片葉的平均值±標準誤，同列數據小寫字母表示p<0.05顯著水平，不同字母之間表示差異顯著。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。當前第1頁1 2 3