本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)，尤其是涉及一種藏紅花脫毒種球的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
藏紅花又名西紅花、番紅花，屬名貴緊缺中藥材，因含有藏紅花素而備受關(guān)注，被譽(yù)為世界上最貴的藥用植物、世界上最好的染料、世界上最高檔的香料。國家中醫(yī)藥管理局列為重點(diǎn)發(fā)展的中藥材品種。近年來藏紅花在醫(yī)療、保健、化工等方面的價(jià)值被全面開發(fā)，由于用量巨大，市場供不應(yīng)求，主要依賴進(jìn)口。藏紅花為三倍體，不結(jié)實(shí)，所以采用無性繁殖，“種球”在繁殖過程中很容易感染植物病毒，一經(jīng)染毒很難去除而且會(huì)越來越嚴(yán)重，極大降低了藏紅花的產(chǎn)量和質(zhì)量。經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，藏紅花脫毒后增產(chǎn)效果明顯，但藏紅花生長點(diǎn)剝離困難，另外微型種球的生長緩慢，這成為了限制藏紅花脫毒技術(shù)大面積推廣的一個(gè)瓶頸。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種藏紅花脫毒種球的生產(chǎn)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：一種藏紅花脫毒種球的生產(chǎn)方法，包括如下步驟：
步驟一，用氯氣對藏紅花種球進(jìn)行表面消毒，然后接種到生長培養(yǎng)基中；
步驟二，種球發(fā)芽后切取只帶一個(gè)葉緣基的生長點(diǎn)進(jìn)行脫毒處理，然后接種到生長培養(yǎng)基中成苗；
步驟三，生長點(diǎn)成苗后進(jìn)行病毒檢測；
步驟四，選擇不帶病毒的植株，繼代到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，產(chǎn)生微型種球；
步驟五，將微型種球接種到含有擴(kuò)繁培養(yǎng)基的生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)繁；
步驟六，將擴(kuò)繁后得到的微型種球放4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
所述生長培養(yǎng)基為添加1-2mg/L赤霉素和0.8-1.5mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基。
所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加10-15mg/L病毒唑的MS培養(yǎng)基。
所述微型種球的擴(kuò)繁方法為：使用鼓泡式生物反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。
所述種球的擴(kuò)繁培養(yǎng)基為添加1-2.0mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基。
上述MS培養(yǎng)基為Murashige和Skoog(1962)公開的培養(yǎng)基，其中1/2MS培養(yǎng)基為大量元素減半的MS培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基在現(xiàn)有的生物以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
采用本發(fā)明的生產(chǎn)方法，藏紅花脫毒效果好，脫毒材料繁殖速度快，在生產(chǎn)上有較大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例的藏紅花種子來自中國藥科大學(xué)。
實(shí)施例所用MS培養(yǎng)基采用Murashige和Skoog(1962)公開的培養(yǎng)基，具體成分如表1所示。
表1
實(shí)施例：
步驟一，用75毫升次氯酸鈉與25毫升濃鹽酸生成的氯氣對藏紅花種球表面消毒20分鐘后，接種到添加1mg/L赤霉素和1mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基中，獲得無菌材料；
步驟二，種球發(fā)芽后切取帶一個(gè)葉原基的生長點(diǎn)，接種到添加1mg/L赤霉素和1mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基中成苗；
步驟三，生長點(diǎn)成苗后用PCR和掃描電鏡檢測進(jìn)行病毒檢測；
步驟四，選擇不帶病毒的植株，轉(zhuǎn)入添加15mg/L病毒唑的MS培養(yǎng)基生產(chǎn)微型種根；
步驟五，將擴(kuò)繁后的微型種球接種到鼓泡式生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)繁，擴(kuò)繁培養(yǎng)基為添加1.5mg/L 6-芐氨基嘌呤的MS培養(yǎng)基；
本實(shí)施例中，12個(gè)種球表面消毒成功，生長點(diǎn)剝離后得到55個(gè)脫毒苗，誘導(dǎo)出的脫毒種球用5升的鼓泡式反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)繁，通氣速率為0.3vvm。微球型根在反應(yīng)器中27天內(nèi)數(shù)量增加了兩倍，并于4℃下保存6個(gè)月后發(fā)芽率達(dá)到100％。