本發(fā)明涉及一種獨蒜蘭的培育方法，特別涉及一種獨蒜蘭多倍體植株的培育方法。

背景技術(shù)：

蘭科植物獨蒜蘭(Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)的干燥假鱗莖，是中藥山慈菇的主要來源之一。2010年版《中國藥典》記載山慈姑的主要來源為蘭科植物杜鵑蘭(Cremastra appendiculata(D.Don)Makino)、獨蒜蘭(Pleione bulbocodioides(Franch.)Rolfe)或云南獨蒜蘭(Pleione yunnanensis(Rolfe)Rolfe)的干燥假鱗莖。前者習(xí)稱“毛慈姑”，后二者習(xí)稱“冰球子”，均作為山慈姑使用。其味甘、微辛、性涼，具有清熱解毒，消腫散結(jié)的功效，主要用于癰腫疔毒、瘰疬痰核、淋巴結(jié)結(jié)核、蛇蟲咬傷等。近年來，由于過度采挖，獨蒜蘭的自然儲量急劇下降，現(xiàn)已呈瀕危狀態(tài)；同時，在自然狀態(tài)下，其種子由于發(fā)育不成熟以及自身不透水、不透氣等原因而極難萌發(fā)。獨蒜蘭正面臨著資源短缺的嚴(yán)峻現(xiàn)實。

獨蒜蘭種質(zhì)的好壞是影響?yīng)毸馓m產(chǎn)量重要的因素。因此，加強獨蒜蘭優(yōu)良品種的選育至關(guān)重要。多倍體植物在自然界中是普遍存在的，由于它們在生理上較普通植物有更強的適應(yīng)性和遺傳上有較大的可塑性，使得育種學(xué)家自20世紀(jì)30年代開始就熱衷于多倍體誘導(dǎo)育種的研究。目前多倍體誘導(dǎo)育種工作在農(nóng)作物、果樹、蔬菜、花卉等領(lǐng)域廣泛開展，取得了很好的成績，如目前多倍體馬鈴薯、西瓜等都已經(jīng)投入到生產(chǎn)應(yīng)用中，已經(jīng)帶來了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。藥用植物多倍體育種工作開展得也比較早，自從1937年布萊克斯里用秋水仙素處理曼佗羅獲得多倍體，半個多世紀(jì)以來，育種學(xué)家對多種藥用植物進行了多倍體育種的研究，培育了許多高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品種，現(xiàn)今，已在卷葉貝母、青蒿、金銀花、羅勒、丹參、紫錐菊、黃芪等藥用植物上誘導(dǎo)成功。藥用植物多倍體具有以下的優(yōu)點：

1.生物產(chǎn)量提高

藥用植物大多以收獲根、莖、葉等營養(yǎng)器官為主，具有巨大性的特點，藥用植物可以利用其優(yōu)勢來提高藥材產(chǎn)量。川黃柏同源四倍體較原植物葉子寬大而厚實，莖桿粗壯；四倍體決明種子比二倍體決明種子增重70％；S.Amiri等研就表明多倍體曼陀羅葉片寬大，植株干重、葉綠素含量較原植物高。

2.抗逆性提高

多數(shù)的多倍體對外界環(huán)境條件具有較強的適應(yīng)性，多倍體植株莖稈粗壯故能較好的抗倒伏有的還有抗旱、抗病、抗寒等特性。例如張笑藝對不同倍性的盾葉薯蕷進行高溫抗性研究，測定葉片內(nèi)與高溫脅迫相關(guān)的各項生理指標(biāo)，表明四倍體盾葉薯蕷對高溫脅迫具有更好的耐受性。

3.藥用活性成分含量高

藥用植物的多倍體育種一方面要提高產(chǎn)量，另一方面應(yīng)使藥用植物內(nèi)的化學(xué)藥效成分含量明顯增加，并且可增添新的藥效成分。例如，有研究表現(xiàn)盾葉薯蕷的同源四倍體中有效成分薯蕷皂苷的含量比原植物高1.2倍左右。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，藥用植物的多倍體育種工作也取得了較大的進展，獲得了一些多倍體新品種，以其速生、優(yōu)質(zhì)、高抗逆性等特性在生產(chǎn)上取得了較好效果。藥用植物多倍體育種拓寬了種質(zhì)資源，防止了由于長期的栽培而導(dǎo)致的藥用植物品種退化。可以預(yù)見，生物技術(shù)在中藥材品種改良方面具有很好的應(yīng)用前景，將隨著人類對其應(yīng)用價值認(rèn)識的提高，以及有關(guān)新技術(shù)方法的應(yīng)用，從而帶動未來藥用植物的可持續(xù)、高效發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種獨蒜蘭多倍體植株的培育方法，利用該方法可以獲得具有四倍體特征的獨蒜蘭植株，且操作簡單，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種獨蒜蘭多倍體植株的培育方法，包括以下步驟：

(1)將消毒后的獨蒜蘭種子抖入秋水仙素溶液中，黑暗條件下培養(yǎng)6～8d后，離心、洗滌去除秋水仙素；

(2)將步驟(1)處理過的獨蒜蘭種子轉(zhuǎn)接到獨蒜蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，先于培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)5～6d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度23～27℃，光照度2000～2500lx，光照12h/d，培養(yǎng)三個月得到多倍體獨蒜蘭幼苗；

(3)將步驟(2)培養(yǎng)得到的獨蒜蘭幼苗，轉(zhuǎn)接到獨蒜蘭增殖培養(yǎng)基中進行穩(wěn)定擴繁，選取2～3代性狀穩(wěn)定的植株進行多倍體的鑒定；

(4)鑒定為多倍體的植株轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，即獲得獨蒜蘭多倍體植株的幼苗。幼苗在生根壯苗培養(yǎng)基中待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至于室溫下培養(yǎng)2～4天后，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周后去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，直至長成獨蒜蘭四倍體植株，球莖巨大。

步驟(1)獨蒜蘭種子的消毒方法可如下：取獨蒜蘭蒴果，用0.1％洗衣粉溶液浸泡8～10min，自來水沖洗5～15min，然后用75％乙醇消毒2～3min，無菌水沖洗，0.1％升汞消毒15～20min，無菌水沖洗，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干，消毒后的獨蒜蘭蒴果切開即獲得消毒后的獨蒜蘭種子。

步驟(1)獨蒜蘭種子的消毒方法還可如下：獨蒜蘭蒴果切開，取獨蒜蘭種子，加入75％乙醇，10s后立即加入無菌水，離心或過濾，取獨蒜蘭種子加入0.1％升汞溶液，5min后加入無菌水，離心或過濾，取獨蒜蘭種子用無菌吸水紙上吸干，即得消毒后的獨蒜蘭種子。具體可如下：直接取獨蒜蘭種子，每100～200mg的種子中加入0.5～1mL的75％乙醇，10s后立即加入30～50mL的無菌水，1000～1500rpm離心2～5min使種子沉淀，去除液體，或者用無菌濾膜過濾出獨蒜蘭種子，之后加入0.5～1mL的0.1％升汞溶液，5min后加入，30～50mL的無菌水，1000～1500rpm離心2～5min使種子沉淀，去除液體，或者用無菌濾膜過濾出獨蒜蘭種子，無菌吸水紙上將殘留的水吸凈，可得無菌獨蒜蘭種子。

作為優(yōu)選，步驟(1)中，所述秋水仙素溶液的pH為5.8～6.2，其中秋水仙素的質(zhì)量濃度為0.1～0.4％，秋水仙素溶液的溶劑為1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，所述秋水仙素溶液中還添加有0.1mg/L-1.0mg/L的6-芐氨基嘌呤。

作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述獨蒜蘭種子萌發(fā)培養(yǎng)基組成如下：1-萘乙酸0.2～0.5mg/L，pH 5.8～6.2，溶劑為1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，步驟(3)中，所述獨蒜蘭增殖培養(yǎng)基組成如下：6-芐氨基嘌呤1.0～2.0mg/L，1-萘乙酸0.1～0.5mg/L，pH 5.8～6.2，溶劑為1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，步驟(4)中，所述生根壯苗培養(yǎng)基組成如下：1-萘乙酸0.5～0.6mg/L，香蕉汁5～10％(v/v)，pH 5.8～6.2，溶劑為1/2MS液體培養(yǎng)基或MS液體培養(yǎng)基。

作為優(yōu)選，所述香蕉汁制備方法為：去皮香蕉切片后加水煮沸20min，按照去皮香蕉重量定容后過濾即得；按照去皮香蕉重量定容的標(biāo)準(zhǔn)為300g去皮香蕉定容至1L。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用獨蒜蘭種子為材料獲得的獨蒜蘭多倍體植株，具有顯著的多倍體特征，且制備方法簡單，對獨蒜蘭新品種的培育工作具有重要的指導(dǎo)意義，本發(fā)明獲得的獨蒜蘭多倍體具有較高的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實施例1步驟4)流式分析結(jié)果，a為二倍體獨蒜蘭，b為本發(fā)明所制備的四倍體植株。

圖2為實施例1步驟5)生根壯苗后得到的植株，a為本發(fā)明所制備的植株，b為二倍體獨蒜蘭植株。

圖3為實施例1步驟5)得到的獨蒜蘭多倍體幼苗的氣孔大小結(jié)果，上部為二倍體獨蒜蘭，下部為本發(fā)明得到的多倍體獨蒜蘭植株，10×40倍鏡下單個視野中的氣孔數(shù)目和大小。

具體實施方式

下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。

本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場購得或是本領(lǐng)域常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。

在本發(fā)明中，MS液體培養(yǎng)基的配方舉例如下：

大量元素母液：NH₄NO₃ 16.5g；MgSO₄·7H₂O 3.7g；KH₂PO₄ 1.7g；KNO₃ 19g，加水溶解，定容至500mL；

鈣鹽母液：CaCl₂ 3.32g，加水溶解，定容至500mL；

微量元素母液：KI 0.0415g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.0125g；H₃BO₃ 0.31g；CuSO₄·5H₂O 0.00125g；MnSO₄·H₂O 0.845g；CoCl₂·6H₂O 0.00125g；ZnSO₄·7H₂O 0.43g，加水溶解，定容至500mL；

鐵鹽母液：EDTA二鈉3.725g，加100mL水加熱溶解，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 2.785g，加100mL水溶解后兩者混勻，加水配成500mL；

維生素母液：鹽酸吡哆醇(VB₆)0.025g；鹽酸硫胺素(VB₁)0.025g；煙酸0.025g，甘氨酸0.1g，加水溶解，定容至500mL；

配1L MS液體培養(yǎng)基：取大量元素母液50mL，鈣鹽母液50mL，微量元素母液10mL，維生素母液10mL，鐵鹽母液5mL，加肌醇0.1g，蔗糖或白砂糖20～30g，蒸餾水定容至1L。

1/2MS液體培養(yǎng)基指溶液中所含的大量元素和鈣鹽為MS的一半，其他不變。

實施例1：

1)取獨蒜蘭蒴果一個，用0.1％洗衣粉溶液浸泡10min，用自來水沖洗5min。然后用75％乙醇消毒2min，無菌水沖洗，0.1％升汞消毒15min，無菌水將殘留的升汞沖洗干凈，無菌吸水紙將蒴果表面殘留的水吸干；

2)將獨蒜蘭蒴果切開，取蒴果中的種子接入0.1％秋水仙素溶液中(以1/2MS為溶劑)，黑暗條件下培養(yǎng)7d。處理完畢后，1000rpm離心1min使種子沉淀，取種子，用無菌蒸餾水洗滌三次，得到初步萌發(fā)的獨蒜蘭種子；

3)將上述秋水仙素處理過的獨蒜蘭種子轉(zhuǎn)接到MS+0.2mg/L 1-萘乙酸的培養(yǎng)基中，放在培養(yǎng)箱進行暗培養(yǎng)5d，再移至培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照度2000～2500lx，光照12h/d，培養(yǎng)三個月得到多倍體獨蒜蘭幼苗；

4)將上述培養(yǎng)得到的獨蒜蘭幼苗，挑選出莖變粗、葉片加厚、葉色加深等外觀形態(tài)特征的植株，轉(zhuǎn)接到MS+1.0mg/L 6-芐氨基嘌呤+0.1mg/L 1-萘乙酸的培養(yǎng)基中進行穩(wěn)定擴繁，相同培養(yǎng)基中續(xù)代培養(yǎng)2～4代，2～3代后若性狀仍穩(wěn)定，則進行多倍體的鑒定；

具體步驟為：于上午8～9時取多倍體以及普通獨蒜蘭組培苗植株的根尖，立即將材料放進0.002mol/L 8-OH喹啉溶液，在4℃下預(yù)處理4～6h，蒸餾水清洗3遍，在4℃下，卡諾氏液(冰醋酸：無水乙醇＝1:3，混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配)在4℃下固定24h，蒸餾水漂洗3次，每次10min，用1.0mol/L的鹽酸常溫解離15～20min，至除根尖外根段透明呈黃色時為宜，將根尖置于蒸餾水中低滲處理約30min或更長時間，用改良苯酚品紅溶液和醋酸洋紅溶液進行染色，30min后壓片，壓至根尖分開成云霧狀，鏡檢觀察多倍體植株2n＝4X＝84，普通獨蒜蘭植株2n＝2X＝42，確定所得到的為四倍體植株。

多倍體的鑒定染色體中流式分析的具體內(nèi)容如下：

(a)細(xì)胞核提取液的配制

組成為15mM Tris；80mM KCl；20mM NaCl；20mM EDTA-Na₂；15mMβ-巰基乙醇；4mM MgCl₂·6H₂O；0.1％Triton X-100；PH7.5。

(b)制備RNA酶及染色液

將RNA酶A溶于10mmo1/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmo1/L NaC1中，配成10mg/mL的溶液，于100℃水浴中加熱15min，緩慢冷卻至室溫后分裝成小份，保存于-20℃中。碘化丙錠(propidium iodide，PI)及RNase(DNase-free)加入到細(xì)胞核提取液中，使其終濃度為100μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

(c)處理材料及結(jié)果分析

取獨蒜蘭多倍體葉片以及普通獨蒜蘭葉片各1g左右，加入1.8mL冰浴預(yù)冷的細(xì)胞核提取液，在培養(yǎng)皿里用銳利的眼科剪快速將其剪碎，以二倍體獨蒜蘭葉片作對照。然后經(jīng)350目尼龍網(wǎng)過濾至1.5mL離心管中，4℃條件下，1000rpm離心5min，吸取上清液200～300μl，加入等體積上述染色液，懸起，暗處染色5-15min，進行流式細(xì)胞儀檢測及軟件分析，發(fā)現(xiàn)對照組即普通獨蒜蘭含2C DNA，多倍體獨蒜蘭含4C DNA(圖1)，進一步表明本發(fā)明所得到的獨蒜蘭多倍體植株為四倍體植株。

按照本發(fā)明方法得到的獨蒜蘭四倍體幼苗，其特征如下：與二倍體獨蒜蘭相比，葉片明顯變厚，顏色變深，整個植株形態(tài)上明顯比二倍體獨蒜蘭粗大(圖2)，4×100倍鏡下單個視野氣孔數(shù)目為5±0.907(二倍體14±4.90)，保衛(wèi)細(xì)胞長和寬分別為2.111±0.231、1.867±0.239(二倍體獨蒜蘭保衛(wèi)細(xì)胞長和寬分別為1.414±0.408、1.083±0.427)(圖3)。

5)將四倍體獨蒜蘭轉(zhuǎn)接到MS+0.5mg/L 1-萘乙酸+10％香蕉汁的培養(yǎng)基中，待根長到2cm以上時，打開瓶蓋，至于室溫下2～4天，取出小苗，洗去根部培養(yǎng)基，栽入營養(yǎng)土中，澆透水，并用塑料薄膜覆蓋一周；

6)上述獨蒜蘭苗在地膜覆蓋一周后去除地膜，定期進行澆水施肥等管理，三年后長成獨蒜蘭四倍體植株，取其中一棵植株，測得株高：66cm，球莖直徑為：5cm。葉1片，長39cm，寬4.5～7.0cm，球莖重43g，整個植株重128g，蒴果長2.5cm，直徑0.7cm。

實施例2：

具體步驟如實施例1所述，不同的是步驟2中的秋水仙素濃度為0.20％，處理時間為9d，變異率為41.07±1.34％。

本發(fā)明所獲得的多倍體獨蒜蘭植株具有能顯著提高單個球莖的重量，植株形態(tài)特征為：株高40～70cm，花葶長15～40cm，葉1片，長35～55cm，寬5～9cm。蒴果長3～5cm，直徑0.7～1.5cm。蒴果平均重1200～1800mg，最大蒴果重2300mg，單個球莖重25～45g，直徑3～5cm。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權(quán)利要求所記載的技術(shù)方案的前提下還有其它的變體及改型。