本發明屬于作物種質資源學領域，涉及一種模擬野生大豆種子自然老化的人工老化方法，具體地講是采用高溫低濕無氧的人工老化方法模擬野生大豆種子自然老化。
背景技術：
野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)是栽培大豆的直接祖先。野生大豆具有蛋白含量高、抗逆性強、繁殖系數大等優良特性，是栽培大豆性狀改良及品種選育的重要基因來源，也是研究大豆起源、進化、分類的寶貴資源。我國是世界保存野生大豆種質資源數量最多的國家，約7000余份，這些材料是我國大豆遺傳研究和作物育種的寶貴財富。
低溫種質庫是野生大豆種質資源保存的主要途徑。隨著保存時間的延長，野生大豆種子的生活力會不斷的下降，其遺傳完整性也不可避免地發生變化。種質遺傳完整性是指種質群體的遺傳結構得到完全的保持，包括基因型頻率分布及等位因頻率分布和其原始群體一樣，保持不變。維持種質遺傳完整性就是種質在貯藏過程中保持最低程度的遺傳改變，在繁殖更新過程中要保持子代與親代具有最大程度的遺傳相似性，這是種質安全保存工作的核心課題。在進行種質遺傳完整性研究時需要不同生活力的種子作為試驗材料。獲得不同生活力種子的最佳方法就是保存在低溫種質庫內經過不同保存年限后而發生自然老化的種質材料，但是自然老化需時較長，在實際研究中難以滿足試驗材料需求。
目前常采用人工老化方法代替自然老化，而被廣泛應用于種質遺傳完整性研究、種子衰老生物學研究以及種子耐貯性研究。常用的人工老化方法為高溫高濕有氧老化法(40℃，100％RH)。例如，CN101720583A公開了一種水稻種子人工老化的方法，包括：將水稻種子置于溫度45～47.5℃，相對濕度為100％RH的人工氣候箱中進行人工老化處理，處理時間為8～10天。再如CN101011025B公開了一種人工老化篩選耐儲藏作物種質的方法，包括以下步驟：“人工老化是指在可控制條件的人工氣候室、培養箱中，利用高溫、高濕的人工條件加速種子老化”；“所述高溫高濕老化條件是：水稻為溫度42℃±1℃、相對濕度85％”。
上述高溫高濕有氧老化法雖然可以模擬自然老化，但也有其弊端和缺點，例如，人工老化處理過程中，由于濕度太大，種子易受微生物侵染而易發生霉爛。而且，最重要地是高溫高濕有氧老化法與自然老化相比，能否準確地反映出野生大豆種子的生活力變化和種質遺傳完整性變化以及二者之間的對應關系值得商榷。為此，需要探索更好的人工老化方法。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種模擬野生大豆種子自然老化的人工老化方法，通過高溫、低濕和無氧的方法，能最大程度地模擬野生大豆種子的自然老化。本發明方法可應用于野生大豆種質遺傳完整性研究、種子衰老生物學研究以及種子耐貯性等研究。本發明可為以上研究提供不同生活力種子試驗材料的制備技術與方法。
為此，本發明所采用的技術方案是：一種模擬野生大豆種子自然老化的人工老化方法，采用高溫低濕無氧法：野生大豆種子破除硬實后，先在相對濕度為45～46％，溫度為25.5～26.5℃條件下進行種子含水量平衡，平衡30天，種子含水量平衡至7.5％±0.1％，然后無氧條件下在人工老化箱內40～42℃恒溫老化處理，處理順序采用倒序法。
具體步驟如下：
1、種子準備：以播種、田間管理、收獲及成熟度一致野生大豆種子為試驗材料，至少5000粒；
2、破除硬實：用布袋包裹野生大豆種子，放入液氮中浸泡4分鐘，然后將種子取出來在室溫25℃下使其自然升溫，達到熱平衡；
3、種子含水量平衡：將破除硬實后的野生大豆種子放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件是相對濕度為45～46％，溫度為25.5～26.5℃，時間為30天，使處理種子的含水量處于7.5％±0.1％，若種子含水量達不到此標準，相同條件下繼續平衡；
4、真空密封包裝：用真空包裝機將種子含水量達到要求后的野生大豆種子鋁箔袋密封包裝，并抽真空至-0.1MPa，平均分成若干份處理，每份約500粒種子。
5、倒序人工老化：每隔2周進行一個處理的人工老化試驗，將鋁箔袋放置于人工老化箱內恒溫老化，溫度為40～42℃。由于種子密封于鋁箔袋內，因此對濕度無特殊要求。采用倒序法進行，即人工老化時間最長的處理先進行老化，人工老化時間最短的最后進行老化，試驗結束時一起取出，避免系統誤差。
6、溫度再平衡：人工老化結束后在25～26℃下，將所有處理再次平衡2天，以利于之后的發芽試驗。
參考GB/T3543.4農作物種子檢驗規程中的標準條件，將對照與經過不同老化時間的處理進行發芽試驗，并統計發芽率。
本發明進一步將通過此種人工老化方法得到的野生大豆種子與通過高溫高濕有氧方法人工老化得到種子以及庫存條件下自然老化的種子進行種質遺傳完整性分析，并將兩種人工老化方法得到的遺傳完整性參數與庫存條件下自然老化得到的遺傳完整性參數分別進行對比分析。通過對比分析得出結論：本發明高溫低濕無氧的人工老化方法能最大程度模擬自然老化。需要指出地是兩種人工老化方法的試驗材料必須與自然老化得到的種子是同一個品種，而且其發芽率必須一致，否則沒有可比性。
現有研究表明貯藏濕度、貯藏溫度和氧氣是影響種子壽命的主要環境因素：
(1)濕度：種子含水量是影響貯藏種子壽命的最關鍵因素。當貯藏濕度較高時，種子將會吸濕而使水分增加。當種子中出現自由水時，種子的呼吸強度激增，同時使種子中的酶得以活化，使各種生理過程尤其是物質的分解過程加速進行，種子壽命短。反之，空氣相對濕度較低時，種子的含水量較少，種子壽命長。
(2)溫度：貯藏溫度是影響種子壽命的另一個關鍵因素。在水分得到控制的情況下，貯藏溫度越低，正常型種子的壽命就越長。低溫狀態下，貯藏的種子呼吸作用非常微弱，物質代謝水平特別緩慢，能量消耗極少，細胞內部的衰老變化也降到最低程度，從而能較長時間保持種子生活力不衰而延長種子壽命。相反，若種子貯藏溫度較高，呼吸作用強烈，造成營養物質大量消耗，倉蟲和微生物活動加強以及脂質的氧化和變質。嚴重時可引起蛋白質變性和膠體的凝聚，使種子的生活力迅速下降。種子含水量和貯藏溫度在影響種子壽命時存在互作效應。種子含水量高，但貯藏溫度較低時，種子壽命仍較長；種子含水量高且貯藏溫度較高時，種子壽命較短。
(3)氧氣：氧氣會促進種子呼吸作用，加速了種子內部物質的消耗及有害物質的積累，不利于種子的安全貯藏。相反，增加氮氣、氦氣、氬氣和二氧化碳等氣體的濃度，降低氧氣濃度，不但能有效地抑制倉蟲和微生物活動，從而延長種子的壽命。
低溫種質庫中種子的貯藏條件通常為溫度-4～-18℃，相對濕度低于45％，鋁箔袋或鋁盒無氧保存。低溫種質庫中的種子處于低溫低濕無氧條件下，種子的生命活動維持在最弱的狀態下，因此種子的壽命得以延長。高溫高濕有氧條件下種子可以迅速老化，發芽率可以在短期內降到0，但是能否最大程度地模擬自然老化值得商榷。高溫高濕無氧條件下，呼吸旺盛的種子會被迫轉入缺氧呼吸，因而產生大量的二氧化碳和酒精，使種子很快窒息死亡，故不宜采用。
因此，本發明基于影響種子壽命的三大環境因素即貯藏溫度、貯藏濕度和氧氣以及庫存種子的自然老化條件，針對現有人工老化方法的不足，提出高溫低濕無氧的人工老化方法，該方法可以最大程度地模擬自然老化。本發明提出的人工老方法與庫存種子自然老化條件最大的不同在于溫度，前者的溫度為40℃，而后者的溫度通常為-4～-18℃。野生大豆種子在高溫低濕無氧的環境下的老化速度雖然低于高溫高濕有氧人工老化法(40℃，100％RH)，但是老化速度卻遠高于種質庫貯藏條件下的自然老化速度。因此，可以大大加速老化速度，在短時間內得到研究所需的試驗材料，同時，可以最大程度上地模擬自然老化。
進一步，本發明針對野生大豆種子需要破除硬實的問題，提供一種新的破除硬實的方法：按以下比例：殼梭孢菌素6～7mg/L、檸檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的溫水配制成溶液。將野生大豆投入該溶液中浸泡并超聲波處理10～15分鐘，超聲波處理結束后取出種子晾干即可。
本發明用溫熱的溶液浸種，配合超聲波處理，較現有常規方法可以簡單、快速、有效的破除硬實。
本發明具有如下有益效果：
本發明提出采用高溫低濕無氧的一整套人工老化方法，用于模擬野生大豆種子在庫存條件下自然老化過程。通過此種人工老化方法老化的野生大豆種子，經過遺傳完整性檢測后與自然老化種子之間的差異遠比常規的高溫高濕有氧條件下人工老化的種子小得多，因此，本發明人工老化方法優于高溫高濕有氧人工老化法，且完全可以代替高溫高濕有氧人工老化法，用于野生大豆種質遺傳完整性研究、種子衰老生物學研究以及種子耐貯性等研究時試驗材料的制備。
具體實施方式
下面結合具體試驗方法對本發明的技術方案及其所產生的技術效果進行進一步的闡述，下述說明僅是為了解釋本發明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。
本發明中所使用的方法如無特殊說明，均為本領域常規方法。下述實施例中所用的試驗材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例一 模擬墾利野生大豆種子自然老化的人工老化方法
1、試驗材料：以墾利野生大豆種子為試驗材料。
2、試驗方法：
(1)分別選取庫存條件下(溫度為-4℃，相對濕度為45％，種子含水量為8.0％，鋁箔袋真空密封)保存0年、5年、8年和10年的500粒墾利野生大豆種子作為研究對象，以保存0年的處理為對照。參考GB/T3543.4農作物種子檢驗規程中的標準條件進行發芽試驗，并統計發芽率(表1)。需要指出地是，野生大豆存在硬實休眠，因此在進行發芽試驗之前必須破除硬實，打破休眠。本發明采用液氮浸泡法破除硬實。具體方法為：用布袋包裹墾利野生大豆種子，放入液氮中浸泡4分鐘，然后將種子取出來在室溫25℃下使其自然升溫，達到熱平衡后進行發芽試驗。
(2)利用本發明高溫低濕無氧方法對墾利野生大豆種子進行人工老化，具體步驟如下：
①種子準備：以播種、田間管理、收獲及成熟度一致墾利野生大豆種子(約5000粒)為試驗材料。
②破除硬實：在種子含水量平衡前，對墾利野生大豆種子破除硬實，方法同上。
③種子含水量平衡：將墾利野生大豆種子放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件是相對濕度為45～46％，溫度為25.5～26.5℃，時間為30天，使處理種子的含水量處于7.5％±0.1％，若種子含水量達不到此標準，相同條件下繼續平衡。
④真空密封包裝：用真空包裝機將種子含水量達到要求后的野生大豆種子鋁箔袋密封包裝，并抽真空至-0.1MPa，平均分成若干份，每份約500粒種子。
⑤倒序人工老化：每隔2周進行一個處理的人工老化試驗，將鋁箔袋放置于人工老化箱內恒溫老化，溫度為40～42℃，相對濕度沒有要求。采用倒序法進行，即人工老化時間最長的處理先進行老化，人工老化時間最短的最后進行老化，試驗結束時一起取出。人工老化時間視所需的發芽率梯度而定。以未經老化的處理為對照。
⑥溫度再平衡：人工老化結束后在25～26℃下，將所有處理再次平衡2天，以利于之后的發芽試驗。
參考GB/T3543.4農作物種子檢驗規程中的標準條件，將對照與經過不同老化時間的處理進行發芽試驗，并統計發芽率(表1)。墾利野生大豆種子進行發芽試驗前需破除硬實，方法同上。
(3)利用高溫高濕有氧方法對墾利野生大豆種子進行人工老化，具體步驟如下：
①種子準備：將播種、田間管理、收獲及成熟度一致墾利野生大豆種子(約5000粒)為試驗材料。
②破除硬實：在種子含水量平衡前，對墾利野生大豆種子破除硬實，方法同上。
③種子含水量平衡：將墾利野生大豆種子放入人工氣候箱中進行種子含水量平衡，平衡條件是相對濕度為74～76％，溫度為24.5～25.5℃，時間為30天，使處理種子的含水量處于12.9～13.1％，若種子含水量達不到此標準，相同條件下繼續平衡.
④包裝：種子含水量平衡達到要求后，用紗網袋包裝，平均分成若干份，每份約500粒種子。
⑤人工老化：將紗網袋放置于人工老化箱內恒溫老化，溫度為39.5～40.5℃，相對濕度為100％。所有處理同時放入，按處理時間需要每天取出一個處理，以未經老化的處理為對照。
參考GB/T3543.4農作物種子檢驗規程中的標準條件，將對照與經過不同老化時間的處理進行發芽試驗，并統計發芽率(表1)。墾利野生大豆種子進行發芽試驗前需破除硬實，方法同上。
需要指出地是利用高溫低濕無氧以及高溫高濕有氧的人工老化方法處理的是同一批墾利野生大豆，以此消除系統誤差，從而保證實驗結果的準確性和可靠性。此外，三種老化方法所得處理的發芽率梯度必須大體一致，否則失去比較的意義。
表1三種老化方法下墾利野生大豆種子的發芽率
(4)將三種老化方法得到的不同生活力群體的墾利野生大豆進行田間繁殖更新，每個群體定植100株，以保證種植密度一致，并進行單株編號，按照編號選取96個單株，采集幼嫩葉片，-80℃下保存備用。
(5)基因組DNA提取
采用SDS法單株提取各個處理的基因組DNA。提取步驟為：
①將野生大豆幼嫩葉片用鑷子放入2.0mL離心管中，每管加入一粒直徑5mm的鋼珠后，進行下一步操作或-80℃備用；
②將離心管迅速放入液氮中冷卻，裝入組織研磨儀中將葉片打碎，時間為30s，頻率為50Hz，注意動作要迅速，之后取出離心管加入1mL的SDS提取液，提取液事先放入65℃水浴中預熱，抑制DNA酶，加速蛋白質變性，促進DNA溶解，然后向離心管中加入10μL的巰基乙醇，抑制酚氧化為醌，充分混勻，也可劇烈震蕩；
③將離心管放入65℃水浴中保溫1小時，水浴過程中每10分鐘搖動一次；
④待樣品冷卻至室溫后，加入1/5體積的5MKAc，冰水混合物中放置30分鐘；
⑤12000g離心10分鐘后，吸取1000μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，在每管中加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇溶液，體積比為25：24：1，充分振動15分鐘后，12000g離心15分鐘；
⑥吸取800μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，加入10μLRNA酶(10mg/μL)溶液，37℃水浴1小時或-4℃過夜；
⑦每管中加入800μL的氯仿/異戊醇溶液，體積比為24：1，充分振動15分鐘后，12000g離心15分鐘；
⑧吸取600μL上清液加入到另一2.0mL離心管中，每管加入0.6～1.0體積的異丙醇，輕輕混勻后置于-20℃下30分鐘，12000g離心10分鐘，收集沉淀；
⑨加入1mL75％乙醇沖洗2次后，再用1mL無水乙醇沖洗1次，置于真空離心機中，將DNA吹干至無酒精味，加入100μL1×TE溶解；
⑩樣品在4℃備用，多余樣品置于-20℃下長期保存。
(6)SSR引物擴增及聚丙烯酰氨凝膠檢測：采用40對SSR核心引物(選取自王棟等，SSR標記分析種子老化及繁殖世代對大豆種質遺傳完整性的影響，植物遺傳資源學報2010,11(2)：192-199。每個連鎖群上分布兩個位點，如表2所示)，對不同生活力的處理基因組DNA進行PCR擴增，采用6％聚丙烯酰氨凝膠電泳分離擴增產物，功率75W，時間為50min，電泳結束后銀染法檢測。
表2墾利野生大豆遺傳完整性分析40對SSR核心引物
①PCR擴增反應體系為：Premix TaqTM(TaKaRa TaqTM Version2.0)10.0μL，5.0μmol/L Primer pairs(1.0+1.0)μL，20.0ng/μL DNA 5.0μL，ddH2O 3.0μL，總體系為20.0μL。
②PCR擴增反應程序為：94℃預變性4min；95℃變性45s，47℃退火45s，72℃延伸45s，35個循環；72℃延伸10min。溫度降至4℃時取出，4℃冰箱內保存備用。
③銀染法檢測步驟為：
a、固定：電泳后將平板放入固定液(10％的乙醇和0.5％的冰醋酸)中，輕輕搖動12分鐘至指示劑無色；
b、銀染：將平板放入銀染液(0.2％AgNO3)中，輕輕搖動12分鐘；
c、水洗：從銀染液中取出平板，用去離子水洗滌10秒；
d、顯影：將水洗后的平板放入顯影液(1.5％NaOH和0.4％甲醛)中，輕輕搖動，顯色至所要的程度；
e、終止顯影：將平板放入10％的冰醋酸中，輕搖1～2分鐘；
f、沖洗：將平板放入去離子水中，沖洗1分鐘；
g、干燥：將沖洗好的平板置于室溫下自然干燥。
(7)結果統計及分析：根據檢測結果，利用POPGENE version 1.31和Powermarker V3.25等軟件對墾利野生大豆通過三種老化方法的各個處理進行遺傳結構分析，計算出各個處理的各位點等位基因頻率、每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數，并利用SAS 9.1對各處理與對照之間的各位點等位基因頻率進行χ2檢驗，對每位點等位基因數、遺傳多樣性指數和香農指數進行顯著性t檢驗。
①等位基因頻率差異分析
表3三種老化方法下墾利野生大豆處理間等位基因頻率差異分析
從表3可以看出，庫存條件下發芽率為76.7％、56.1％和27.3％的處理a-2、a-3和a-4與發芽率為93.4％的對照a-1相比，等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點個數及其占總位點個數百分比，隨著生活力的下降而增加，其中，位點個數分別為1個、5個、8個和0個、1個、4個；占總位點個數百分比分別為2.50％、12.50％、20.00％和0、2.50％、10.00％。利用高溫低濕無氧人工老化方法的發芽率為75.9％、55.2％和26.2％的處理b-2、b-3和b-4與發芽率為92.8％的對照b-1相比，等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點個數及其占總位點個數百分比，隨著生活力的下降而增加，趨勢與自然老化方法一致，其中，位點個數分別為1個、6個、9個和0個、1個、5個；占總位點個數百分比分別為2.50％、15.00％、22.50％和0、2.50％、12.50％，這幾項指標與自然老化方法所得數據基本相同。利用高溫高濕有氧方法人工老化的發芽率為76.9％、54.7％和26.0％的處理c-2、c-3和c-4與發芽率為97.1％的對照c-1相比，等位基因頻率顯著差異和極顯著差異的位點個數及其占總位點個數百分比，隨著生活力的下降而增加，趨勢與自然老化方法同樣一致，但是位點個數分別為6個、11個、16個和3個、5個、7個；占總位點個數百分比分別為15.00％、27.50％、40.00％和7.50％、12.50％、17.50％，這幾項指標與自然老化方法所得數據相比相差較大。因此，高溫低濕無氧人工老化方法與高溫高濕有氧人工老化方法相比，所得試驗結果與自然老化方法具有更高的一致性，完全可以模擬自然老化用于野生大豆遺傳完整性研究。
②群體遺傳結構分析
表4三種老化方法下墾利野生大豆群體遺傳結構
注：*表示5％水平上顯著差異；**表示1％水平上顯著差異
從表4中可以看出，經過三種方法老化后，每個發芽率梯度處理的各項遺傳多樣性參數均低于各自老化方法的對照，而且每種老化方法的時間愈長，生活力水平愈低，其各項遺傳多樣性參數也愈低。t檢驗結果顯示，庫存條件下經過自然老化的處理a-2，其遺傳多樣性參數A、H和I與自身對照a-1相比略有下降，但差異不顯著。處理a-3和a-4的遺傳多樣性參數A、H和I與a-1相比，下降幅度較大，達到差異極顯著水平，表明經過自然老化，發芽率為56.1％和27.3％的處理因自身生活力下降，其群體遺傳結構發生極顯著變化。經過高溫低濕無氧方法老化的處理b-2，其遺傳多樣性參數A、H和I與自身對照b-1相比也是略有下降，差異不顯著。處理b-3和b-4的A、H和I等3項參數與b-1相比，下降幅度較大，達到極顯著水平，表明經過高溫低濕無氧方法老化，發芽率為55.2％和26.2％的處理同樣因生活力下降，其群體遺傳結構發生極顯著變化，這與自然老化的結果極為相似。經過高溫高濕有氧方法老化的處理c-2，其遺傳多樣性參數A、H和I與自身對照c-1相比下降較大，達到差異顯著水平。處理c-3和c-4的A、H和I等3項參數與c-1相比，下降幅度更大，已經達到差異極顯著水平。這表明經過高溫高濕有氧方法老化，發芽率為76.9％的處理因生活力下降，其群體遺傳結構發生顯著變化，發芽率為54.7％和26.0％的處理因生活力下降，其群體遺傳結構發生極顯著變化。這一變化趨勢與自然老化的趨勢不一致，自然老化下發芽率為56.1％的處理，其遺傳結構未發生顯著變化。因此，高溫高濕有氧的人工老化方法加速了墾利野生大豆的遺傳結構變化，而經過高溫低濕無氧的人工老化方法處理的墾利野生大豆，其遺傳結構變化與自然老化下的基本一致。
綜上所述，等位基因頻率差異分析與群體遺傳結構分析的試驗結果都表明，高溫低濕無氧的人工老化方法所得試驗數據與自然老化方法所得試驗數據基本一致。而經過高溫高濕有氧方法老化處理后所得結果與自然老化不一致。說明本發明高溫低濕無氧人工老化可以最大程度地模擬自然老化，用于野生大豆種質遺傳完整性研究。
實施例二模擬黃島野生大豆種子自然老化的人工老化方法
1、試驗材料：以黃島野生大豆種子為試驗材料。
2、試驗方法：
三種老化方法：(1)自然老化和(3)利用高溫高濕有氧方法對黃島野生大豆種子進行人工老化，具體步驟同實施例一。而(2)高溫低濕無氧方法，除了破除硬實的方法外，其余步驟與實施例1相同。本實施例中破除硬實采用專用溶液超聲浸泡法，步驟為：按以下比例：殼梭孢菌素6～7mg/L、檸檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的溫水配制成溶液；把野生大豆投入該溶液中浸泡并超聲波處理10～15分鐘；超聲波處理結束后取出種子晾干即可。
與實施例一相同方法，進行發芽率統計、等位基因頻率差異分析和群體遺傳結構分析，結果分別如表5-7所示，
表5三種老化方法下黃島野生大豆種子的發芽率
表6三種老化方法下黃島野生大豆處理間等位基因頻率差異分析
表7三種老化方法下黃島野生大豆群體遺傳結構
注：*表示5％水平上顯著差異；**表示1％水平上顯著差異
由表5至表7可以看出，上述試驗結果與實施例一一致：表明高溫低濕無氧老化方法與高溫高濕有氧老化方法相比，所得試驗結果與自然老化方法具有更高的一致性。
因為墾利野生大豆與黃島野生大豆是兩個區域的，因此實驗具有重復性和廣譜性。說明本發明方法適用于不同的野生大豆種質材料，且不受時間和地域的限制。
本發明以墾利野生大豆和黃島野生大豆種子為試驗材料，采用高溫低濕無氧方法對其進行人工老化，并將此人工老化方法與自然老化及高溫高濕有氧的人工老化方法同時進行遺傳完整性檢測，通過對比分析確定了高溫低濕無氧的人工老化方法相對于高溫高濕有氧老化法，能最大程度地模擬自然老化。此方法兼顧了模擬自然老化的準確性以及進行種子老化所需的時間，因此可代替高溫高濕有氧人工老化法用于野生大豆種質遺傳完整性研究，在較短的時間內提供足夠的試驗材料，并保證試驗的準確性和可靠性。
實施例三野生大豆破除硬實方法比較
(一)試驗材料與方法
1、試驗材料
試驗材料為成熟的一年生野生大豆種子，2014年采集自青島市嶗山區，即嶗山野生大豆。
2、方法
(1)種子水分和千粒重測定
參照農作物種子檢驗規程GB/T3543.4進行。
(2)種子硬實率測定
隨機取100粒×2野生大豆種子在室溫下清水浸種24h，統計未吸脹種子的粒數，計算硬實率。
(3)破除硬實的方法
①液氮法：用布袋包裹野生大豆種子，放入液氮中浸泡4分鐘，然后將種子取出來在室溫25℃下使其自然升溫，達到熱平衡。
②溶液浸泡超聲法：按以下比例：殼梭孢菌素6～7mg/L、檸檬草水提取物20～30mg/L，用35～50℃的溫水配制成溶液。將野生大豆投入該溶液中浸泡并超聲波處理10～15分鐘。超聲波處理結束后取出種子晾干。
③對比方法
參考《合肥地區野生大豆硬實破除方法的研究》(陳輝等，種子，第2008年02期，29-32.)中所采用的方法。
a、低溫冷脹處理：取適量種子于冰箱內(-6～-10℃)進行冷凍處理3天，取出恢復至室溫。
b、高溫水浴處理:取適量種子95℃水浴2min，取出冷卻至室溫。
c、濃硫酸腐蝕處理：取適量種子放入98％濃硫酸中處理50分鐘，處理后用清水反復沖洗。
d、砂紙打磨+高錳酸鉀(5×10-6)：用砂紙將種子表明打磨2min，放入高錳酸鉀(濃度為5×10-6)浸泡消毒1min。
以未處理種子做為對照。
(二)結果與分析
1、供試種子水分、千粒重和硬實率
供試種子水分、千粒重和硬實率測定結果分別為8.7％，16.7g和95.8％。
2、各種方法破除硬實效果對比
進行幼苗生長測定：參照農作物種子檢驗規程GB/T3543.4進行紙床發芽試驗，每重復50粒凈種子，4次重復。智能人工氣候箱中培養(20～30℃，光照8h/d)，調查種子發芽數、發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、根傷害率等(表10)。
表10不同破除硬實方法比較
由表10可以看出，本發明所采用的兩種方法——液氮法和溶液浸泡超聲法，破除硬實效果最好：種子具有很高的發芽勢，發芽率也達到90％以上，發芽指數和活力指數很高。但是液氮法對根有一定的損傷，而且溶液浸泡超聲法不會對根造成任何傷害。
由于野生大豆種子硬實程度較高，在進行相關研究之前需要先破除硬實。目前通常采用機械摩擦、加溫和酸處理等方法，以損壞種皮，增加種皮的透氣和透水能力，打破休眠和促進發芽。本發明綜合比較了本發明方法和低溫冷脹處理、高溫水浴處理、濃硫酸腐蝕處理、砂紙打磨+高錳酸鉀處理，發現低溫冷脹處理耗時較長，效果也最差；高溫水浴處理發芽率和發芽勢也不高，且處理時間也不宜過長；濃硫酸酸蝕處理對破除硬實效果最明顯，然而對根的傷害較大。前人研究也表明，隨著酸蝕時間的增長，根損害率顯著增加。砂紙打磨+高錳酸鉀復合處理，由于經過機械損傷，會對野生大豆種子的胚造成一定的影響，化學試劑也對機械損傷的種子有一點的毒害作用，根損害率比較高。
而本發明所采用的兩種方法——液氮法和溶液浸泡超聲法，可以克服上述方法存在的問題，一方面可以有效的破除硬實，發芽勢和發芽率僅次于濃硫酸處理的。液氮法比較方便快捷，但是破除硬實效果較溶液浸泡超聲法稍差，且對根有一定的損害。而溶液浸泡超聲法破除硬實效果非常好，且對根無傷害。其原理推測可能是由于殼梭菌素具有類似赤霉素的作用，可以有效打破種子休眠，而檸檬草水提取物其成分復雜，推測其可能是在超聲時有利于破壞種皮外面的不透水層或果膠質，增強種皮透氣透水能力。
所述檸檬草水提取物為檸檬草提取精油后的水提取物：檸檬草提取精油為常規技術，如，將干燥的檸檬草粉碎，取100g，按照1:15的料液比，放置在1L的蒸餾燒瓶內，浸泡12h，然后再用水蒸氣蒸餾法蒸餾4h，得到檸檬草精油。所剩余的溶劑水及內含物部分，通過濃縮干燥后得到粉末，即本發明所述檸檬草水提取物。
檸檬草的化學成分主要是檸檬醛、月桂稀、β-蒎稀、C-β-羅勒烯、芳樟醇、香茅醛、香葉醇等。檸檬草作為一種重要的芳香植物，其精油在香精香料以及合成行業得到了很大的關注。檸檬草精油的提取多采用水蒸氣蒸餾法，在傳統工藝中，只收取精油部分，而將剩下的非揮發性水溶成分丟棄，浪費了其中的有效成分。研究發現提取精油后剩下的非揮發性水溶成分中包含黃酮類物質、單寧等，對于微生物具有廣譜抗性，除了對植物致病菌外，對動物體內和其他環境中多種微生物的生長都能產生明顯的抑制作用，具有良好的抑菌效果。
殼梭菌素是具有680分子量的碳三環二萜烯糖苷，殼梭菌素對植物的主要生理效應是：刺激細胞伸長生長，開啟氣孔增強蒸騰，打破種子休眠促進萌發以及成根誘導等等。它的顯著特性之一是急劇提高細胞膜內的透性。還具有與植物激素類似的功能：增強節間和胚芽鞘的生長，誘導根的形成和活化H+/K+，刺激子葉生長和開啟氣孔，刺激種子發芽力和提高出苗率。
由此可見，本發明破除硬實方法，破除硬實效果顯著，保證了種子發芽一致，出苗整齊，且不會對根造成傷害，可以應用于野生大豆的人工老化等相關研究中。