本發明屬于人工誘導中華鱘單性生殖領域，特別是涉及一種遺傳滅活的中華鱘同源精子誘導中華鱘卵子進行雌核發育的方法。
背景技術：
：中華鱘是我國特有的一種古老的大型魚類，體型大、生長快、肉質好，尤其其魚籽大是鱘魚中的珍品。中華鱘屬于國家一級保護動物，在2010年被世界自然保護聯盟(IUCN)列入極度瀕危保護物種。中華鱘屬于典型的兩性生殖魚類，也就是自然狀態下需要成熟的雌魚和雄魚才能繁殖。中華鱘的性成熟時間長，雄性至少需要8-10年以上，雌性至少需要12-14年以上時間。中華鱘的性別比例為1:1，且無第二性征，在早期無法辨別性別。在中華鱘繁殖保護上希望養殖中盡可能多為雌魚以便于快速生產更多的放流苗種，迅速恢復野外種群，以最小的投入產生最大的保護效益。而正常的兩性生殖的方式無法繁殖出較高比例的雌性苗種。雌核發育是一種單性生殖方式，就是僅僅依靠卵子的遺傳物質發育成為后代的生殖方式。目前自然界中有一部分魚存在自發雌核發育的情況，例如分布于我國黑龍江的方正銀鯽在繁殖季節會借助鯉魚精子刺激進行雌核發育繁殖，然而其它多數兩性生殖的魚類很難進行大規模的自發雌核發育研究，但可以通過人工誘導的方式進行單性生殖。目前人工誘導雌核發育是快速生產單性苗種(例如全雌性或多數雌性苗種的一種方式)、快速產生高度純系子代、進行極度瀕危物種保護的一種方式。在俄羅斯鱘、高首鱘、閃光鱘、密西西比鏟鱘、歐洲鰉、小體鱘、西伯利亞鱘、匙吻鱘、雜交鱘等鱘魚的人工誘導雌核發育已有報道，尚沒有關利用中華鱘精子誘導中華鱘雌核發育研究進行報道。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種利用遺傳滅活的中華鱘精子誘導中華鱘卵子進行單雌性繁殖的方法，由本發明技術成功培育出了中華鱘雌核發育苗種。該技術可以快速生產高度純合的中華鱘苗種，為進一步揭示中華鱘性別決定機制、生產單雌性苗種及為中華鱘全基因測序研究和進一步探索單性生殖保護技術具有重要的意義。本發明技術方案如下：(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：采集中華鱘精子，選取活力在80％以上的中華鱘精子與精子稀釋液混合，于0-2℃預冷的培養皿中，進行紫外線滅活；(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：選擇成熟的中華鱘雌魚，水溫18-19.5℃，人工注射LHRH-A2催產，在效應時間來臨時采用腹部擠壓的方法采集卵子，用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，精子灑在卵上進行卵受精，加入養殖用水搖勻，再加水洗滌，放入含有滑石粉養殖用水的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理；(3)熱休克加倍處理：在步驟(2)脫粘處理一段時間后，進行熱休克處理；(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；(5)雌核苗的分子鑒定：利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；完成同源精子誘導中華鱘雌核的發育。優選地，所述步驟(1)精子紫外遺傳滅活是在0-2℃低溫環境下操作，經稀釋后的中華鱘精液放置于在冰上預冷培養皿中，厚度≤1mm。進一步優選地，：所述精子稀釋有兩種方式，一種方式是利用中華鱘精液經過3000-5000g離心力離心3-5分鐘的上清液作為精子稀釋液進行中華鱘精子稀釋，中華鱘精子與上清液的體積比為1:2-1:5；另一種方式是配置與中華鱘精子等滲透壓的稀釋液進行稀釋，中華鱘精子與等滲透壓稀釋液的體積比為1:2～1:4，所述等滲透壓的稀釋液為：蔗糖20-100mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl1-2mmol/L，pH8.5。優選地，所述步驟(2)采集后的卵子暫放在干燥光滑的盆子中用濕毛巾覆蓋保持濕度，在18-19.5℃暫時保存。優選地，所述步驟(1)紫外線滅活方法為將培養皿置于鋪有碎冰的搖床上，震蕩頻率為60-90rpm，在無菌操作臺的紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7-8分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm。優選地，所述步驟(2)授精方法為以1mL配比500-1000粒卵的比例，灑在卵上，之后加入1倍卵子體積的養殖用水搖勻1分鐘，之后再加一倍的水洗滌，之后放入18-19.5℃含有10％-15％的滑石粉的養殖用水懸濁液的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理。優選地，所述步驟(3)熱休克加倍處理方法為，受精卵在水溫18℃脫粘處理17.5-18.9分鐘(中華鱘在18℃的卵裂時間τ為70min，脫粘處理＝0.25τ-0.27τ＝17.5-18.9分鐘)后進行熱休克處理，處理的溫度范圍在35-38℃，持續時間為2min。優選地，所述步驟(4)放入噴淋式孵化篩進行培育，孵化水溫為18-19.5℃。優選地，所述方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為50-70分鐘。本發明技術原理：成熟的卵子具有在一定的外界刺激下(比如機械刺激、電刺激、化學刺激和遺傳滅活的精子刺激)可以啟動發育，進行細胞分裂和后繼的發育成為成熟的個體的潛力，但是卵細胞中遺傳物質為的體細胞的一半，刺激發育的卵子進行增生的后代細胞中的遺傳物質DNA含量為體細胞的一半，這樣發育出的個體是單倍體，單倍體會表現出個體小、畸形、發育到一定階段致死的特征。因此還要通過一定的技術手段在卵子發育的早期進行遺傳物質加倍處理，使得發育中每個細胞的DNA的含量恢復到母本體細胞的水平，這樣雌核發育的后代才是正常個體。采用同源精子生產出的雌核苗種可以有效保證中華鱘物種的純正性，避免異源精子微量遺傳物質的滲入，尤其對于中華鱘全基因組測序研究具有重要的意義。本發明有益效果：1、利用本發明技術培育出的中華鱘雌魚。可以通過后代雌雄比例判斷初步判斷中華鱘性別決定遺傳機制是XY還是ZW型。如果是XY型，那么將產生全雌性(XX)的中華鱘苗種，進一步與遺傳上雌性生理上是雄性(XX)的個體進行交配，將會生產出全雌性(XX)的中華鱘后代。該技術對于中華鱘種群的迅速擴大具有重要的意義。如果中華鱘是ZW性別決定機制決定，那么后代將會出現1：1雌性個體(WW)和雄性個體(ZZ)，這種超雌性個體與雄性個體進行交配后后代將全部是雌性后代(ZW)。2、該技術可以快速生產高度純合的中華鱘苗種。該技術為進一步揭示中華鱘性別決定機制、生產單雌性苗種及中華鱘全基因組測序研究和進一步研究單性生殖保護技術具有重要的意義。3、紫外滅活使精子的遺傳物質失去活性，以避免參與子代個體發育，又具有一定的活性保留刺激卵子發育的能力。4、滑石粉脫去受精卵表面的粘性，防止卵子粘連堆積在一起而導致受精卵缺氧窒息，并便于后期卵子發育觀察和死卵的清理操作。5、熱休克處理目的在于抑制受精卵的第二極體(1n)排出，從而使得雌核發育的卵子(n)后代恢復正常的體細胞倍性(2n)。熱休克成功的關鍵主要是在于控制熱休克處理的時機、溫度和熱處理持續時間。6、本申請方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為50-70分鐘，對總時間進行限定，消除受精卵相互粘性，避免受精卵粘連堆積造成卵子內部缺氧而死亡，受精卵在孵化時候更容易散開，使得每個受精卵與水充分接觸，便于卵子內部與外界環境進行氧氣和代謝物的交換，更有利于受精卵發育和提高存活率，也便于以后觀察和死卵和發霉卵的剔除。7、采用適宜的精子稀釋方式，利用精子上清液或等滲透壓稀釋液進行稀釋，可以保證精子在處理過程中不會受到細胞膜內外滲透壓不一致造成的損傷。附圖說明下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明：圖1微衛星遺傳標記鑒定結果具體實施方式下面結合實施例來進一步說明本發明，但本發明要求保護的范圍并不局限于實施例表述的范圍。實施例1(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：利用中國長江三峽集團公司中華鱘研究所培育6尾中華鱘(雌雄各3只)體重范圍在60-80kg。精子活力在80％-85％。2013年12月和2014年12月分別取卵子和精子進行了雌核發育研究。紫外線照射滅活中華鱘精子的遺傳物質：吸取上述中華鱘加入8ml精子稀釋液，將培養皿放置在紫外中，紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7-8分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm，照射時間梯度為0min、4min、5min、6min、7min、8min照射后進行鏡檢，統計精子的存活率、精子壽命、快速運動時間。精子稀釋方式是配置與中華鱘精子等滲透壓的稀釋液進行稀釋，中華鱘精子與等滲透壓稀釋液的體積比為1:2，所述等滲透壓的稀釋液為：蔗糖80mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，將滅活的精子灑在卵子上，加水后迅速搖勻，1min后，放入19℃含有15％滑石粉懸濁液的脫粘瓶中充氣脫粘。(3)熱休克加倍處理：在19℃水溫中，在受精操作之后18分鐘，在38℃熱水中進行熱激，持續時間2分鐘；熱休克處理后放回19℃的15％滑石粉懸濁液中曝氣脫粘，脫粘時間為70分鐘。(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；放入孵化床孵化篩中在19℃淋水孵化，孵化篩卵撥動頻次在5-8次/分鐘。未經過熱休克處理的雌核發育苗種出現單倍體綜合征(胚孔封閉不完全，胚胎發育緩慢，脊柱彎曲，尾部上翹等異常特征)，在卵黃囊吸收完之前已經全部死亡。經過熱休克處理的受精卵，孵化48小時后進行受精率統計，110小時后統計孵化率，開口期統計苗種存活率(表1)。表1紫外滅后的精子時間與誘導后產生卵子發育之間的比例關系紫外照射時間原腸中期(％)尾牙期(％)出苗(％)開口期存活率(％)4分鐘73.232.362005分鐘58.3329.9426.6906分鐘40.3422.2223.2807分鐘75.1429.7413.592.338分鐘71.8238.3228.034.60分鐘(對照)81.2772.3461.2652.2由表1可知，7分鐘和8分鐘紫外處理的精子可以將精子的遺傳物質滅活，并仍保持有激發卵子發育的能力，并在38℃的熱休克可以有效抑制第二極體的排出，產生正常倍性(2n)的雌核苗種。(5)雌核苗的分子鑒定：對孵化苗種剪取少量鰭條，利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；遺傳物種均為來自母本，子代未含父本遺傳物質信息，父本精子未參與。證明為雌核發育的苗種。(6)等該苗種生長的六個月后，進行2ml血液用于中華鱘基因組survey研究。實施例2一種同源精子誘導中華鱘雌核發育的方法，所述方法包括以下步驟：(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：采集中華鱘精子，選取活力在80％以上的中華鱘精子與精子稀釋液混合，于0℃預冷的培養皿中，進行紫外線滅活；(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：選擇成熟的中華鱘雌魚，水溫18℃，人工注射LHRH-A2催產，在效應時間來臨時采用腹部擠壓的方法采集卵子，用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，精子灑在卵上進行卵受精，加入養殖用水搖勻，再加水洗滌，放入含有滑石粉養殖用水的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理；(3)熱休克加倍處理：在步驟(2)脫粘處理一段時間后，進行熱休克處理；(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；(5)雌核苗的分子鑒定：利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；完成同源精子誘導中華鱘雌核的發育。所述步驟(1)精子紫外遺傳滅活是在0-2℃低溫環境下操作，經稀釋后的中華鱘精液放置于在冰上預冷培養皿中，厚度≤1mm。所述精子稀釋方式是利用中華鱘精液經過30000g離心力離心3分鐘的上清液作為精子稀釋液進行中華鱘精子稀釋，中華鱘精子與上清液的體積比為1:2。所述步驟(1)紫外線滅活方法為將培養皿置于鋪有碎冰的搖床上，震蕩頻率為60rpm，在無菌操作臺的紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm。所述步驟(2)授精方法為以1mL配比500粒卵的比例，灑在卵上，之后加入1倍卵子體積的養殖用水搖勻1分鐘，之后再加一倍的水洗滌，之后放入18℃含有10％的滑石粉的養殖用水懸濁液的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理。所述步驟(3)熱休克加倍處理方法為，受精卵在水溫18℃脫粘處理17.5分鐘后進行熱休克處理，處理的溫度范圍在35℃，持續時間為2min。所述步驟(4)放入噴淋式孵化篩進行培育，孵化水溫為18℃。所述方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為50分鐘。實施例3一種同源精子誘導中華鱘雌核發育的方法，所述方法包括以下步驟：(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：采集中華鱘精子，選取活力在80％以上的中華鱘精子與精子稀釋液混合，于2℃預冷的培養皿中，進行紫外線滅活；(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：選擇成熟的中華鱘雌魚，水溫19.5℃，人工注射LHRH-A2催產，在效應時間來臨時采用腹部擠壓的方法采集卵子，用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，精子灑在卵上進行卵受精，加入養殖用水搖勻，再加水洗滌，放入含有滑石粉養殖用水的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理；(3)熱休克加倍處理：在步驟(2)脫粘處理一段時間后，進行熱休克處理；(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；(5)雌核苗的分子鑒定：利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；完成同源精子誘導中華鱘雌核的發育。所述步驟(1)精子紫外遺傳滅活是在0-2℃低溫環境下操作，經稀釋后的中華鱘精液放置于在冰上預冷培養皿中，厚度≤1mm。精子稀釋方式是配置與中華鱘精子等滲透壓的稀釋液進行稀釋，中華鱘精子與等滲透壓稀釋液的體積比為1:2，所述等滲透壓的稀釋液為：蔗糖90mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。所述步驟(1)紫外線滅活方法為將培養皿置于鋪有碎冰的搖床上，震蕩頻率為60-90rpm，在無菌操作臺的紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7-8分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm。所述步驟(2)授精方法為以1mL配比1000粒卵的比例，灑在卵上，之后加入1倍卵子體積的養殖用水搖勻1分鐘，之后再加一倍的水洗滌，之后放入19.5℃含有15％的滑石粉的養殖用水懸濁液的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理。所述步驟(3)熱休克加倍處理方法為，受精卵在水溫18℃脫粘處理18.9分鐘后進行熱休克處理，處理的溫度范圍在38℃，持續時間為2min。所述步驟(4)放入噴淋式孵化篩進行培育，孵化水溫為19.5℃。所述方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為70分鐘。實施例4一種同源精子誘導中華鱘雌核發育的方法，所述方法包括以下步驟：(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：采集中華鱘精子，選取活力在80％以上的中華鱘精子與精子稀釋液混合，于0-2℃預冷的培養皿中，進行紫外線滅活；(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：選擇成熟的中華鱘雌魚，水溫18.5℃，人工注射LHRH-A2催產，在效應時間來臨時采用腹部擠壓的方法采集卵子，用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，精子灑在卵上進行卵受精，加入養殖用水搖勻，再加水洗滌，放入含有滑石粉養殖用水的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理；(3)熱休克加倍處理：在步驟(2)脫粘處理一段時間后，進行熱休克處理；(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；(5)雌核苗的分子鑒定：利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；完成同源精子誘導中華鱘雌核的發育。所述步驟(1)精子紫外遺傳滅活是在0-2℃低溫環境下操作，經稀釋后的中華鱘精液放置于在冰上預冷培養皿中，厚度≤1mm。精子稀釋方式是配置與中華鱘精子等滲透壓的稀釋液進行稀釋，中華鱘精子與等滲透壓稀釋液的體積比為1:2，所述等滲透壓的稀釋液為：蔗糖95mmol/L，20mmol/LTris-HCl，KCl2mmol/L，pH8.5。所述步驟(1)紫外線滅活方法為將培養皿置于鋪有碎冰的搖床上，震蕩頻率為80rpm，在無菌操作臺的紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7-8分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm。所述步驟(2)授精方法為以1mL配比800粒卵的比例，灑在卵上，之后加入1倍卵子體積的養殖用水搖勻1分鐘，之后再加一倍的水洗滌，之后放入19℃含有13％的滑石粉的養殖用水懸濁液的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理。所述步驟(3)熱休克加倍處理方法為，受精卵在水溫18℃脫粘處理18分鐘后進行熱休克處理，處理的溫度范圍在37℃，持續時間為2min。所述步驟(4)放入噴淋式孵化篩進行培育，孵化水溫為18.5℃。所述方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為60分鐘。實施例5一種同源精子誘導中華鱘雌核發育的方法，所述方法包括以下步驟：(1)中華鱘精子遺傳物質的滅活：采集中華鱘精子，選取活力在80％以上的中華鱘精子與精子稀釋液混合，于1℃預冷的培養皿中，進行紫外線滅活；(2)中華鱘卵子采集及與中華鱘滅活精子授精：選擇成熟的中華鱘雌魚，水溫19.5℃，人工注射LHRH-A2催產，在效應時間來臨時采用腹部擠壓的方法采集卵子，用所述步驟(1)滅活后精子進行授精，精子灑在卵上進行卵受精，加入養殖用水搖勻，再加水洗滌，放入含有滑石粉養殖用水的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理；(3)熱休克加倍處理：在步驟(2)脫粘處理一段時間后，進行熱休克處理；(4)雌核發育卵的培育：步驟(3)結束后的卵繼續脫粘，脫粘結束后放入噴淋式孵化篩進行孵化培育；(5)雌核苗的分子鑒定：利用微衛星DNA標記篩選的方法，篩選使用滅活精子的親魚特異等位基因的微衛星位點，不少于兩對；完成同源精子誘導中華鱘雌核的發育。所述步驟(1)精子紫外遺傳滅活是在0-2℃低溫環境下操作，經稀釋后的中華鱘精液放置于在冰上預冷培養皿中，厚度≤1mm，所述精子稀釋方式是利用中華鱘精液經過4000g離心力離心4分鐘的上清液作為精子稀釋液進行中華鱘精子稀釋，中華鱘精子與上清液的體積比為1:3。所述步驟(1)紫外線滅活方法為將培養皿置于鋪有碎冰的搖床上，震蕩頻率為80rpm，在無菌操作臺的紫外燈照射度為335.6μw/cm2，照射時間7.5分鐘時間，紫外燈功率為20W，波長為254nm。所述步驟(2)授精方法為以1mL配比800粒卵的比例，灑在卵上，之后加入1倍卵子體積的養殖用水搖勻1分鐘，之后再加一倍的水洗滌，之后放入19.5℃含有10％-15％的滑石粉的養殖用水懸濁液的脫粘瓶中進行充氣脫粘處理。所述步驟(3)熱休克加倍處理方法為，受精卵在水溫18℃脫粘處理18分鐘后進行熱休克處理，處理的溫度范圍在36℃，持續時間為2min。所述步驟(4)放入噴淋式孵化篩進行培育，孵化水溫為18.5℃。所述方法中步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)總時間為60分鐘。上述的實施例僅為本發明的優選技術方案，而不應視為對于本發明的限制，本申請中的實施例及實施例中的特征在不沖突的情況下，可以相互任意組合。本發明的保護范圍應以權利要求記載的技術方案，包括權利要求記載的技術方案中技術特征的等同替換方案為保護范圍。即在此范圍內的等同替換改進，也在本發明的保護范圍之內。當前第1頁1 2 3