本發明涉及藍莓的胚性愈傷組織的高頻誘導、增殖及體細胞胚分化成苗方法，屬于植物的組織培養領域。

背景技術：

愈傷組織是一團脫分化后的細胞，經過細胞分裂，產生無組織結構，無明顯極性的、松散的細胞團。根據組織學觀察、外觀特征及其再生性、再生方式等，愈傷組織分成兩大類:胚性愈傷組織(embryonic callus，EC)和非胚性愈傷組織(non-embryonic callus，NEC，如圖1)。一般胚性愈傷組織質地較堅實，顏色有乳白色或黃色，表面具球形顆粒，其生長緩慢；從細胞學來看，胚性愈傷組織由等直徑細胞組成，細胞較小，原生質濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性強。胚性愈傷組織又可分為致密型胚性愈傷組織和易碎型胚性愈傷組織(如圖4)。胚性愈傷組織具有以下特性：高度的胚性或再分化能力，能再生植株；分散性好，容易散碎，便于建立優良的懸浮系或分離原生質體；旺盛的自我增殖能力，可以制作人工種子作為種苗快繁的新途徑；經過長期繼代保存而不喪失胚性，可進行各種遺傳操作。

植物組織培養技術中植物體細胞的再生分為直接再生和間接再生，直接再生一般經由外植體直接誘導胚狀體再成苗的方法，胚狀體保持時間短，不可以進行繼代和增殖，無法進行遺傳轉化、輻射誘變等操作。間接再生一般經歷外植體(或種子、胚)---愈傷組織---胚性愈傷組織---體細胞胚---分化成苗等階段。間接再生的胚性愈傷組織可進行繼代增殖，在合適培養基和繼代條件下可一直保持其愈傷組織狀態，是進行遺傳轉化、細胞培養、輻射誘變及制作人工種子等操作必須的試驗材料。果樹作為木本植物現有技術大多采用胚性預決定的組織(如種子、胚乳、花粉等)誘導胚性愈傷組織的產生，而利用胚性重決定的組織(如葉片、莖段、根等)誘導胚性愈傷組織較難實現，但胚性重決定的組織材料易取得，可選擇具有優良品種特性的材料，因此育種上更具有意義。

藍莓果實的保健價值、經濟價值在水果中屬于佼佼者，其花青苷含量是其他水果的很多倍，因此是一種世界公認的具有很強保健功能的珍貴果品資源。最新資料顯示，目前藍莓已躍居全世界漿果栽培面積和產量第二位，因此發展藍莓產業具有很高的經濟價值和開發前景。我國藍莓產業化栽培始于本世紀初，現有的品種資源均引自國外，多數品種國內栽培在適應性、豐產性、品質等方面表現較差，開發具有自主知識產權的新品種，對我國藍莓產業的可持續發展具有重要意義。

中國專利申請《一種藍莓胚狀體的誘導方法》(公開號CN103598093A)中公開了一種培養基：WPM為基礎培養基，添加吲哚乙酸IAA0.5-1mg、吲哚丁酸IBA0.5～1mg、玉米素ZT0.1～0.5mg、蔗糖30g和瓊脂7g，pH為5.2～5.4；。該申請成功之處在于建立了藍莓莖尖直接誘導胚狀體的方法；但不足之處體現在：未經過愈傷組織脫分化成苗的過程，未能獲得可增殖的胚性愈傷組織、未有芽生根的培養基配方，因此在分子育種特別是后續的細胞培養和原生質體培養方面無明顯的應用價值。

崔廣榮等“藍莓離體葉片胚狀體高效發生及其組織學觀察”(《激光生物學報》，2008第17卷，第5期)同樣公開了一種培養基：高灌藍莓葉片胚狀體發生及成苗的培養基為WPM+TDZ 0.04mg/L+ZT 0.25～2.0mg/L+蔗糖20～40g/L,而培養基WPM+ZT0.5～1.0mg/L+蔗糖20g/L適合于叢芽繼代生長。此配方為藍莓葉片胚狀體的直接發生，而非間接再生，如何利用葉片、莖段等胚性重決定外植體誘導可繼代增殖的胚性愈傷組織，有利于進一步進行細胞培養、遺傳轉化等轉基因遺傳操作，從細胞層面來說具有更加重要的意義。

因此，解決藍莓的胚性愈傷組織高頻再生的難題，對藍莓產業的可持續發展而言具有重要意義。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中藍莓的胚性愈傷組織高頻再生的難題，提供一種用于高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養基及培養方法。

為解決技術問題，本發明所采取的技術方案為：

提供一種用于高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養基，包括用于高叢藍莓體細胞胚間接再生中不同培養階段的下述四種培養基：

(1)高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 0.5-1.0mg/L、TDZ0.1-0.25mg/L、2-ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，繼續添加蔗糖5-10g/L，不加瓊脂，調節pH為5.0；

(2)高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip 0.5mg/L和CPPU 1.5mg/L，繼續添加蔗糖30g/L，瓊脂3-5g/L，調節pH為5.0；

(3)高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 1-2.0mg/L和IBA 0.1mg/L，繼續附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、瓊脂5-7g/L，調節pH為5.0；

(4)高叢藍莓分化苗的生根培養基：在改良1/6MS基本培養基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加瓊脂，調節pH為5.0；

所述ZT、TDZ、2-ip、CPPU、IBA、AC分別指：玉米素、噻苯隆、N6-異戊烯基腺嘌呤、氯吡苯脲、吲哚丁酸、活性炭。

所述改良1/2MS基本培養基是對MS培養基的配方進行了調整，其中大量元素減半，微量元素和有機物不變；調整后的具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L，KNO₃ 950mg/L，CaCl₂·2H₂O 220mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 85mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機成分：肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；

所述改良1/6MS基本培養基是對MS培養基的配方中大量元素進行了調整，其中大量元素減至原配方的1/6，微量元素不變，有機物調整為原配方的1/5；具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 275mg/L，KNO₃ 317mg/L，CaCl₂·2H₂O 73mg/L，MgSO₄·7H2O 62mg/L，KH₂PO₄ 28.3mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H2O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機成分：肌醇20mg/L，煙酸0.1mg/L，鹽酸吡哆醇0.1mg/L，鹽酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸0.4mg/L。

本發明進一步提供了前述培養基進行高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養方法，包括下述步驟：

(1)按所述配方配制四種培養基；

(2)選材與處理：

在無菌操作條件下，取增殖旺盛的高叢藍莓無菌試管苗，將其上部幼嫩部分剪切成長度為1cm、帶葉柄的莖段；

(3)愈傷組織低溫弱光液體淺層培養：

將所述高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基分裝到200ml的三角瓶中，每瓶10ml，以塑料透氣膜扎口，作為液體淺層培養基；在無菌操作條件下，將10株幼嫩部分的莖段接入液體淺層培養基，在溫度18±2℃、光照強度1000±100lx，光照時間12h/d的條件下連續培養3個月；培養材料不進行繼代轉接，經培養生成愈傷組織材料；

(4)藍莓胚性愈傷組織半凝固培養基低溫、黑暗分化增殖培養：

將所述高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基分裝到9×9cm的培養皿中，在無菌操作條件下，將步驟(3)中獲得的愈傷組織材料切割分離，并挑選呈現黃綠色的愈傷組織；剔除殘存的莖段、出芽以及褐變的部分，接種于高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基；繼續在溫度18±2℃，全黑暗條件下培養3個月，每3周繼代一次，每次繼代繼續挑選呈現黃綠色、松散、易碎的愈傷組織繼續繼代培養，獲得胚性愈傷組織，用于繼續繼代增殖；

(5)藍莓胚狀體固體培養基全光、常溫分化成苗培養：

將所述高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基分裝于容量為200ml以上的三角瓶中，挑選步驟(4)中獲得的增殖旺盛、組織質地松散且未褐變的胚性愈傷組織，接種于有機物培養基中；在溫度25±1℃、光照強度2000±100lx的條件下培養3個月，每4周繼代一次，每次挑選分化出芽部分與愈傷分開繼代接種，逐漸獲得符合預期的具有一定長度和粗度的藍莓芽苗；

(6)藍莓生根苗培養：

取12×12cm培養皿，在底部先墊入脫脂棉，然后覆蓋大小相近的濾紙；將高叢藍莓分化芽苗的生根培養基分裝于培養皿中，分裝量以浸濕脫脂棉和濾紙為準；剪取健壯的藍莓芽苗置于培養皿中，每個培養皿接種15株；在溫度25±1℃的條件下，黑暗培養7天；再置于光照強度2000±100lx條件下，培養21天，獲得藍莓生根苗。

本技術方案采用的愈傷組織初期低溫低光照液體培養基誘導、胚性愈傷低溫全黑暗半凝固培養基分化和增殖、胚狀體常溫高光照固體培養基分化成苗、分化苗棉花濾紙橋生根等方法，成功獲得了可持續增殖培養的藍莓胚性愈傷組織，目前繼續繼代20次以上仍然保持旺盛的增殖能力，系統解決了藍莓體細胞培養和遺傳轉化所需的穩定中間體及其增殖問題，同時建立了藍莓體細胞胚的間接再生完整技術體系。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：

(1)藍莓愈傷組織誘導階段和增殖培養階段均采用低溫培養，降低了愈傷組織誘導過程中的非胚性愈傷組織的增殖速度，減少了高溫和長期不繼代引起的褐變風險。低溫誘導培養有利于胚性細胞的增殖和發育在藍莓這一樹種上得到驗證，也值得其他植物材料在誘導胚性愈傷組織時借鑒。

(2)采用1000±100lx低光照和延長繼代培養時間，愈傷組織在低光照和液體培養基水分減少引起的緩慢脫水條件下促使其向胚性愈傷組織轉變，又不至于誘導成苗，同時液體培養基減少了長期不繼代時有害物質的積累，又保證了養分的供應；

(3)激素配比是胚性愈傷組織誘導和增殖的關鍵，采用的四種細胞分裂素低濃度配合使用，發揮各自作用，較好的維持了胚性愈傷組織的愈傷組織狀態，不至于分化成苗，增殖階段將其濃度適當提高(加倍)，更加有利于其在誘導成功后的增殖；

(4)以適當的細胞分裂素與生長素的配比，改變培養條件為固體培養基、常溫、組培全光照條件，接下來順理成章的誘導胚狀體分化成苗。

(5)生根采用棉花濾紙橋作為支持物的室內瓶外生根方法，使用了添加含有低濃度生長素IBA的生根營養液，生根率高，保持了濕度無需每天加水操作方便，生根苗不粘有培養基和其他基質，移栽效率較高，顯著降低了人工成本。

附圖說明

圖1為非胚性愈傷組織；

圖2為質地堅實的愈傷組織(瘤狀愈傷組織)；

圖3為松散型胚性愈傷組織形成期；

圖4為松散胚性愈傷組織；

圖5為胚性愈傷組織誘導出苗；

圖6為愈傷組織誘導；

圖7為瘤狀愈傷組織培養；

圖8為松散型胚性愈傷組織培養；

圖9為成苗培養；

圖10為胚性愈傷組織切片。

具體實施方式

下面結合具體實施例子，對本發明的實現方法進行詳細描述。

一、四種培養基的制備

本發明所述用于高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養基，包括用于高叢藍莓體細胞胚間接再生中不同培養階段的四種培養基，分別是：(1)高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基、(2)高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基、(3)高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基、(4)高叢藍莓分化苗的生根培養基。

四種培養基的配制示例如下：

實施例1

(1)高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 0.5mg/L、TDZ0.1mg/L、2-ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，繼續添加蔗糖5g/L，不加瓊脂，調節pH為5.0；

(2)高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip 0.5mg/L和CPPU 1.5mg/L，繼續添加蔗糖30g/L，瓊脂3g/L，調節pH為5.0；

(3)高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基：在改良1/2MS基本培養基中添加ZT 1mg/L和IBA 0.1mg/L，繼續附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、瓊脂5g/L，調節pH為5.0；

(4)高叢藍莓分化苗的生根培養基：在改良1/6MS基本培養基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加瓊脂，調節pH為5.0；

實施例2

(1)高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基：添加ZT 0.7mg/L、TDZ0.15mg/L、蔗糖8g/L，其余與實施例1相同；

(2)高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基：添加瓊脂4g/L，其余與實施例1相同；

(3)高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基：添加ZT 1.6mg/L瓊脂6g/L，其余與實施例1相同；

(4)高叢藍莓分化苗的生根培養基：與實施例1相同；

實施例3

(1)高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基：添加ZT 1.0mg/L、TDZ0.25mg/L、蔗糖10g/L，其余與實施例1相同；

(2)高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基：添加瓊脂5g/L，其余與實施例1相同；

(3)高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基：添加ZT 2.0mg/L、瓊脂7g/L，其余與實施例1相同；

(4)高叢藍莓分化苗的生根培養基：與實施例1相同。

上述各實施例中：

改良1/2MS基本培養基具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L，KNO₃ 950mg/L，CaCl₂·2H₂O 220mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 85mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機成分：肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；

改良1/6MS基本培養基是對MS培養基的配方中大量元素進行了調整，其中大量元素減至原配方的1/6，微量元素不變，有機物調整為原配方的1/5；具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 275mg/L，KNO₃ 317mg/L，CaCl₂·2H₂O 73mg/L，MgSO₄·7H2O 62mg/L，KH₂PO₄ 28.3mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，FeSO₄·7H2O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機成分：肌醇20mg/L，煙酸0.1mg/L，鹽酸吡哆醇0.1mg/L，鹽酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸0.4mg/L。

二、高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養方法

利用本發明所述培養基進行高叢藍莓體細胞胚間接再生的培養方法，包括下述步驟：

(1)按實施例2中所述配方配制四種培養基；

(2)選材與處理：

在無菌操作條件下，取增殖旺盛的高叢藍莓無菌試管苗，將其上部幼嫩部分剪切成長度為1cm、帶葉柄的莖段；

(3)愈傷組織低溫弱光液體淺層培養：

將所述高叢藍莓愈傷組織碳饑餓液體誘導培養基分裝到200ml的三角瓶中，每瓶10ml，以塑料透氣膜扎口，作為液體淺層培養基；在無菌操作條件下，將10株幼嫩部分的莖段接入液體淺層培養基，在溫度18±2℃、光照強度1000±100lx，光照時間12h/d的條件下連續培養3個月(如圖2，6)；培養材料不進行繼代轉接，經培養生成愈傷組織材料；

(4)藍莓胚性愈傷組織半凝固培養基低溫、黑暗分化增殖培養：

將所述高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基分裝到9×9cm的培養皿中，在無菌操作條件下，將步驟(3)中獲得的愈傷組織材料(如圖3)切割分離，并挑選呈現黃綠色的愈傷組織(如圖4)；剔除殘存的莖段、出芽以及褐變的部分，接種于高叢藍莓胚性愈傷組織誘導及增殖半凝固培養基(如圖7)，繼續在溫度18±2℃，全黑暗條件下培養3個月，每3周繼代一次，每次繼代繼續挑選呈現黃綠色、松散、易碎的愈傷組織繼續繼代培養，獲得胚性愈傷組織(如圖8)；

(5)藍莓胚狀體固體培養基全光、高溫分化成苗培養：

將所述高叢藍莓體細胞胚的成熟分化、成苗再生的有機物培養基分裝于容量為200ml以上的罐頭瓶中，挑選步驟(4)中獲得的增殖旺盛、組織質地松散且未褐變的胚性愈傷組織，接種于有機物培養基，在溫度25±1℃、光照強度2000±100lx的條件下培養3個月，每4周繼代一次，獲得藍莓芽苗(如圖5，9)；

(6)藍莓生根苗培養：

取12×12cm培養皿，在底部先墊入脫脂棉，然后覆蓋大小相近的濾紙；將高叢藍莓分化苗的生根培養基分裝于培養皿中，分裝量以浸濕脫脂棉和濾紙為準；剪取健壯的藍莓芽苗置于培養皿中，每個培養皿接種15株；在溫度25±1℃的條件下，黑暗培養7天；再置于光照強度2000±100lx條件下，培養21天，獲得藍莓生根苗。