本發明屬于柑桔黃龍病抗病技術領域，具體地說，涉及一種在盆栽苗木上控制柑桔黃龍病的方法。

背景技術：

柑橘黃龍病(Citrus huanglongbing)，是柑桔生產中存在的一種世界性的毀滅性病害，目前，它已危及我國廣大柑桔主產區，美國佛羅里達州、加利佛尼亞州巴西圣保羅等重要柑桔產區。主要危害柑、橘、橙、檸檬、柚類等主裁品種和類型。尤其以蕉柑、沙糖桔、椪柑、福橘、茶枝柑等品種的耐病力較弱，該病全年都能發生，感病的品種一般出現均勻黃化、斑駁黃化和缺素狀黃化癥狀，成年樹木常在整片橘園中出現部分少數枝條的頂端黃化，第二年黃化枝擴大到全株，使樹體衰退。病樹所結的果實小，形狀怪異，果臍歪斜，病果表皮光滑，無光澤，味酸，表皮顏色有的黃綠不均勻，有的品種果蒂附近變為橙紅色，從而影響柑橘產量，稱為“紅鼻果”。該病對柑橘生產危害極大，感病的品種在得病后的3-5年內即喪失結果能力，甚至枯死，近年來，發病面積不斷擴大，菌源地不斷增加，疫情擴散速度不斷提高，危害損失極其嚴重，成為柑橘生產的一大毀滅性病害。

柑橘黃龍病病原(Candidatus Liberibacter asiaticus)是難培養的革蘭氏陰性細菌，由原核生物薄壁菌門中韌皮部桿菌屬引起，是一種細菌性病害。是由柑橘木虱為主要傳播媒介，目前針對柑橘黃龍病還沒有有效的防治措施，在田間主要挖除病樹，栽培過程中控制木虱，培育無病苗木和加強檢疫以防止其傳染與蔓延。但仍然不能杜絕該病的發生。柑桔一旦感染了韌皮部桿菌，幾年的時間，果實就基本毀滅掉。這一現象嚴重地挫傷了果農發柑桔生產的積極性。近些年來，病原微生物導致的傳染病爆發，使得新型抗菌藥物的研究變得極為迫切。自從2009年，柑桔黃龍病病原微生物全基因組的測序工作接近或已經完成，這使得我們對于病害的認識更為深入，對于病原可以采取更為有效的措施，進行精準治療，這使得我們更加深刻地認識到抗菌藥物篩選靶點的重要性。

柑桔感染黃龍病的幼樹的治療和恢復技術是在栽培環節中，對柑桔優良品種順利投入生產，生產出高品質果實的關鍵環節。如：在我國福建的蘆柑，廣西的砂糖桔等地的幼樹，在剛進入投產階段，就開始發現臨星的黃化或斑駁癥狀的樹出現。我們采用QPCR和PCR對這樣的果園進行分子檢測，發現，雖然有些樹體癥狀還不能用肉眼觀察到，但實際上，樹體內有病原存在的比例已明顯高于有癥狀的樹。

伴隨著氣候變化及國內外柑桔品種引進和交流的增多，美國加州，佛羅里達州，巴西等主要區黃龍病的迅速蔓延，我國柑桔黃龍病感染日趨嚴重，因此，研究新型、高效、實用的柑桔感染黃龍病的幼樹的治療和恢復健康技術具有重要的實際應用價值。

現有的關于柑桔黃龍病的防治和檢測如下：注射農用四環素曾經被用于防治黃龍病，在田間緩解癥狀，恢復產量有一定的作用，但是，成本過高，在我國廣西省，及時清除病株減少病原，采用聯防的措施，柑桔黃龍病(HLB)的控制產生了良好的效果。在巴西，通過清除病株和使用殺蟲劑控制木虱，黃龍病的防治已經取得一定的成果。另外，選用相對抗性強的品種、加強柑桔木虱防治、推廣無毒苗木、間種番石榴趨避木虱等園藝手段，也是可以減少黃龍病的為害。在大規模的新建果園，采用無病毒苗木是至關重要的方法。目前，柑橘黃龍病PCR檢測主要根據16S rDNA和β-操縱子設計引物進行，實時定量PCR也被廣泛應用于柑橘黃龍病的檢測，靈敏度高，準確性高，對于田間感病狀況能快速地監控。

柑桔感染黃龍病的苗木的治療和恢復健康技術具有如下重要性：各級政府十分重視優良品種的引進和推廣，先后投入許多資金從國外引進各類柑橘優良品種。種植后時間不長，樹體剛要進行投產階段，就面臨著砍樹的危險。除了采用無病毒的苗木在栽培過程中，控制木虱傳播病原這些措施外，柑桔感染黃龍病幼樹的治療和恢復健康勢在必行，它對于保護重要的柑桔資源及柑橘產業的可持續發展具有重要的意義。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明針對上述的問題，提供了一種在盆栽苗木上控制柑桔黃龍病的方法，本發明是對感染柑桔黃龍病的2-4年生苗木或幼樹進行病原脫除和恢復處理，能對零星感染柑桔黃龍病的幼樹進行病原控制。采用小分子化合物進行三個階段抑菌處理，利用灌根和滴灌的方式，并配合正常的肥水管理，采用實時定量QPCR分子檢測技術，驗證HLB病原的脫除效果；在栽培環節中以較低的成本投入，避免柑桔果園可能發生的重大損失。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種苗木上控制柑桔黃龍病的方法，采用T3或T26小分子化合物進行三個階段抑菌處理，利用灌根或滴灌的方式，配合肥水管理增強樹勢，并結合實時定量QPCR分子檢測技術，監控HLB病原的脫除效果。

進一步地，該方法包括以下步驟：

1)從1月份開始處理，用30μM的三氯生試劑對2-4年生的苗木或幼樹進行灌根處理，用量為1.5L/株，隔20天灌一次，共3次，過20天采樣，作QPCR分析，確定HLB脫毒效果；在處理期間，保持苗木正常的肥水管理；

2)從3月初開始用50μM～75μM的三氯生試劑，以1.5L/株的用量灌到步驟1)處理后的2-4年生苗木或幼樹根部，苗木大，長勢壯者適當增加TCL濃度，最高為75μM，隔20天灌一次，共3次，第三次處理后，過20d采樣作QPCRR分析，檢測HLB脫毒率；

3)從5月初開始用50μM的三氯生試劑，1.5L/株灌到步驟2)處理后的2-4年生苗木或幼樹根部，隔20天灌一次，共三次，第三次處理后，隔20天采樣作QPCR分析，檢測HLB脫毒率。

進一步地，該方法包括以下步驟：

1)從1月份開始處理，用30μM的Sigma試劑269980添加Mn₂SO₄試劑15mM，對2-4年生的苗木或幼樹進行灌根處理，用量為1.5L/株，隔20天灌一次，共3次；再過20d采樣作QPCR進行分析，檢測HLB脫毒膠效果；在處理期間，保持苗木正常的肥水管理；

2)從3月初開始用50μM的Sigma試劑269980添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株用吊瓶滴灌的方式將試劑滴到步驟1)處理的2-4年生的苗木或幼樹的根部，將滴灌的速度調節到1.04ml/min，1.5L/株在24小時滴完。隔一周，再次滴灌一次，每次1.5L/株在24小時滴完；共滴灌3次，過10d采樣作QPCR進行分析，檢測HLB脫毒膠效果；

3)從5月初開始用50μM的Sigma試劑269980添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株灌到步驟2)處理后的2-4年生苗木或幼樹根部，用吊瓶滴灌的方式將試劑滴到2-4年生的苗木或幼樹的根部，將滴灌的速度調節到1.04ml/min，1.5L/株在24小時滴完，隔一周，再次滴灌，共滴灌3次，過10d后，經QPCR分析，采樣作QPCR分析，鑒定HLB的脫毒效果。

與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：

本發明技術能柑桔苗木和零星感染黃龍病(HLB)的柑桔2-4年生幼樹進行黃龍病的病原控制。采用T3和T26小分子化合物進行三個階段抑菌處理，利用灌根和滴灌的方式，配合正常的肥水管理，并結合實時定量QPCR分子檢測技術，監控HLB病原的脫除效果。兩組程序脫除病原的百分率分別達到88.9％和85.7％。這項技術對于重要的地方特色柑桔品種推廣應用，以及引進柑桔資源的無病毒化有著重要的實用價值，對于柑橘產業的可持續發展具有重要的現實意義。

本發明是幾種試劑綜合效應的結果，實施本發明的其中單一的產品并不一定能同時達到以上所述的所有技術效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本發明的一部分，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中：

圖1是本發明Stage1-1階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為為陰性對照，2為陽性對照，3-21為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品；

圖2是本發明Stage1-2階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為陰性對照，2為陽性對照，3-9為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品；

圖3是本發明Stage1-3階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為陰性對照，2為陽性對照，3-9為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品；

圖4是本發明Stage2-1階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為陰性對照，2為陽性對照，3-9為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品；

圖5是本發明Stage2-2階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為陰性對照，2為陽性對照，3-9為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品；

圖6是本發明Stage3-3階段黃龍病控制效果的QPCR分析，其中，1為陰性對照，2為陽性對照，3-9為被檢測的樣品，2^-ΔΔt相對表達量小于1為陰性樣品，即為健康樣品。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細說明本發明的實施方式，藉此對本發明如何應用技術手段來解決技術問題并達成技術功效的實現過程能充分理解并據以實施。

實施例1

本發明提供一種在苗木上控制柑桔黃龍病的方法，包括以下步驟：

1)從元月初開始進行處理，用30μM的TCL(三氯生)試劑對2-4年生的苗木上或幼樹進行灌根處理，用量為1.5L/株，隔20天灌一次，共3次。在處理期間，保持苗木正常的肥水管理，第3次灌根后，過20天采樣，作QPCR分析，確定HLB脫毒效果。

2)從3月初開始用50μM的TCL試劑，1.5L/株灌到步驟1)處理后的2-4年生苗木或幼樹根部，隔20天灌一次，共3次，第三次處理后，過20d采樣作QPCRR分析，檢測HLB脫毒率。

3)從5月初開始用50μM的TCL試劑，1.5L/株灌到步驟2)處理后的2-4年生苗木或幼樹根部，隔20天灌一次，共三次，第三次處理后，隔20天采樣作QPCR分析，檢測HLB脫毒率。

實施例2

本發明還提供一種在苗木上控制柑桔黃龍病的方法，包括以下步驟：

1)從元月初開始進行處理，用30μM的T26(Sigma試劑269980)添加Mn₂SO₄試劑15mM，灌根1.5L/株，灌到2-4年生的苗木或幼樹根部，隔20天灌一次，共3次。再過20d采樣作QPCR進行分析，檢測HLB脫毒膠效果；在處理期間，保持苗木正常的肥水管理；

2)從3月初開始用50μM的T26添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株用吊瓶滴灌的方式將試劑滴到步驟1)處理后的2-4年生的苗木或幼樹的根部，將滴灌的速度調節到1.04ml/min，1.5L/株在24小時滴完。隔一周，再次滴灌一次，每次1.5L/株在24小時滴完；共滴灌3次，過10d采樣作QPCR進行分析，檢測HLB脫毒膠效果；

3)從5月初開始用50μM的T26添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株滴灌到根部，用吊瓶滴灌的方式將試劑滴到步驟2)處理后的2-4年生的苗木或幼樹的根部，將滴灌的速度調節到1.04ml/min，1.5L/株在24小時滴完，隔一周，再次滴灌，共滴灌3次。過10d后，經QPCR分析，采樣作QPCR分析，鑒定HLB的脫毒效果。

下面結合具體的實驗數據進行說明本發明的技術效果：

柑橘黃龍病Real-time PCR檢測依據：

1、DNA提取和QPCR檢測

CTAB法提取待測柑橘材料的基因組DNA，提取方法參考Huang等文獻(Huang et al.,2000)。檢測DNA濃度，并將其稀釋到100ng/μL以內，作為QPCR檢測的模板。所用看家基因為植物細胞色素氧化酶基因COX，引物為COX+/COX-，序列信息參考Li等文獻(Li et al.,2006)，片段長度68bp；目的基因擴增引物為A04+/A04-，序列信息參考胡浩等文獻(胡浩等，2006)，擴增產物為亞洲型柑橘HLB病原的核糖體蛋白基因rplJ/rplL的特異序列，片段長度87bp，引物序列見表1。QPCR反應體系和程序分別見表2和表3。

利用亞洲韌皮桿菌核糖體蛋白基因的特異性靶序列設計引物(表1)。實時突光定量PCR試劑盒:2XSYBRGreen qPCR Mix,購自莊盟國際生物基因科技有限公司。PCR儀(美國Bio-Rad公司)、DYY-5型穩壓穩流電泳儀(北京六一儀器廠)、凝膠成像系統(Segrate公司)、核酸蛋白檢測儀(Amersham公司)，突光定量PCR儀熒光定量PCR儀Light Cycler 480。每種處理的檢測重復3次。

表1 實驗中涉及的引物及其序列

表2 熒光定量反應體系

表3 熒光定量反應體系程序

二、試驗方法

方法一：因為QPCR分析結果的靈敏度比PCR靈敏度更高，因此，這里只列出QPCR的檢測結果，結果見表5至表7。

第一階段處理(stage1-1)：從元月初開始進行處理，用30μM的TCL(三氯生)試劑，1.5L/株灌根，2-4年生苗或幼樹，隔20天灌一次，共3次，再過20d。每一階段，保持苗木正常的肥水管理。

如表5和圖1所示，過20d采樣作QPCR分析，只要是QPCR檢測為陽性，結果認為是陽性。本研究結果顯示：19株陽性苗，經處理后12株成為陰性,3-4年生的幼樹脫毒率為63.61％。

第二階段處理(stage1-2)：從3月初開始進行。用50μM的TCL試劑，1.5L/株滴灌到根部，3-4年生的幼樹，隔20天灌一次，共3次，第三次處理后，過20d采樣作QPCRR分析，如表6和圖2所示，結果顯示：14株陽性苗，經處理后10株轉為陰性。3-4年生的幼樹陰性苗比率均為71.4％.

第三階段處理(stage1-3)：從6月初開始進行，用50μM～75μM的TCL試劑，苗木大，長勢壯者適當增加TCL濃度，最高為75μM，1.5L/株滴灌到根部，隔20天灌一次，共三次，第三次處理后，過20d采樣作QPCRR分析，如表7和圖3所示，結果顯示：3-4年生的11株陽性幼樹中，10株轉為陰性，脫毒率達88.9％。2年生苗，4株陽性轉為陰性，脫毒率為100％。

方法二：

第一階段處理(stage2-1)：從元月初開始進行處理，用30μM的T26(Sigma試劑269980)添加Mn₂SO₄試劑15mM，1L/株灌根，隔20天灌一次，共3次。再過20d采樣作QPCR進行分析。如表8和圖4所示，結果顯示：30株陽性苗，經處理后15株成為陰性。每一階段，保持苗木正常的肥水管理。

第二階段處理(stage2-2)：從3月初開始進行。用50μM的T26添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株滴灌到根部，按1.04ml/min的速度滴灌，1.5L/株連滴2d完成，隔一周，再次滴1.5L/株，共滴灌3次。如表9和圖5所示，10d后，經QPCRR分析，3-4年生幼樹脫毒率達75％。

第三階段處理(stage2-3)：從5月初開始進行，用50μM的T26添加Mn₂SO₄試劑15mM，1.5L/株滴灌到根部，連滴2d完成，隔一周，再次以1.04ml/min的速度滴灌，1.5L/株滴灌到根部需要2天時間，共滴灌3次。如表10和圖6所示，10d后，經QPCR分析，3-4年生幼樹7株，處理后脫毒率達85.7％。

三、實驗結果：

表4 柑桔幼樹黃龍病控制實際操作程序及效果分析

注：上試劑母液均用100％DMSO促進溶解，再用清水稀釋到使用濃度。

表5 TCL處理感染柑桔黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

表6 TCL處理感染黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

表7 TCL處理感染黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

表8 TCL處理感染黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

表9 TCL處理感染黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

表10 TCL處理感染黃龍病的幼樹后采用QPCR檢測HLB的結果

上述說明示出并描述了發明的若干優選實施例，但如前所述，應當理解發明并非局限于本文所披露的形式，不應看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環境，并能夠在本文所述發明構想范圍內，通過上述教導或相關領域的技術或知識進行改動。而本領域人員所進行的改動和變化不脫離發明的精神和范圍，則都應在發明所附權利要求的保護范圍內。