本發明涉及組織培養與繁殖技術領域，具體涉及一種玉林香蒜的提純復壯方法。

背景技術：

玉林香蒜已經有一千多年的栽培歷史。其個頭大、粒瓣結實、辛辣多汁、肉脆味香，莖皮顏色多為紫色，亦有白色。被列為廣西土特產品，銷路廣，出口價值高，經濟效益好。產地集中在仁東、仁厚、福綿、大平山等地。

大蒜氣味辛溫，含有豐富的蛋白質、脂肪、糖、鈣、鐵和維生素A、B、C等營養物質，并具有較高的藥用價值，有"消炎、理胃、溫中、除邪痹毒氣"之功效。大蒜頭還是常用的調料，在煮瓜、菜、魚、肉時，放入幾瓣，芳香可口。

玉林香蒜是廣西名優地方特色農產品，因其具有品質獨特、香味濃郁、辣味強烈、蒜油豐富、衣澤紫紅等優點，在市場上深受歡迎。據有關部門檢測，玉林香蒜是目前我國大蒜品種中香味最濃、辣味最烈、蒜油最豐富的品種，又名玉林大蒜，極適宜加工蒜油、蒜蓉和調味食品。

大蒜是無性繁殖植物，由于大蒜不能進行有性繁殖,通常是農民種植戶常年自留種蒜，有限的自然變異并不能滿足遺傳改良的要求,通過傳統的方法很難準確測定次生代謝組分含量和評價遺傳變異。玉林香蒜依靠鱗莖繁殖，使病毒通過蒜種逐年累積并代代相傳，導致品種種性嚴重退化，嚴重制約了玉林香蒜大規模生產和持續健康發展，限制了將玉林香蒜打造成地區特色產品的步伐。

目前很少關于針對玉林香蒜，利用大蒜莖尖進行組織培養進行繁殖的研究，雖然目前有關其他品種進行組織培養的報道，但由于玉林香蒜品種與其他品種存在一定差別，組培效果差。缺少一種專門針對玉林香蒜的脫毒組培苗的培養方法和專用培養基。

公開于該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不應當被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已為本領域一般技術人員所公知的現有技術。

技術實現要素：

本發明的發明目的在于：針對背景技術中的問題，提供一種玉林香蒜的提純復壯方法，適合玉林香蒜利用氣生鱗莖的氣生鱗莖尖進行組織培養繁殖，本發明方法具有氣生鱗莖尖萌動早、長勢快、成活率最高；組培出來的玉林香蒜苗莖粗壯，生命力頑強，適應能力強的特點。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下：

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期15-20天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.5cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在5-10℃環境下，備用；

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒1-3次，接著放入質量濃度為0.07-0.15％的氯化汞溶液中浸泡12-18min后取出，再用無菌水沖洗3-6次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為0.1-1.5mm且帶1～3個葉原基的氣生鱗莖尖，備用；

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養9-14天，然后移入溫度為25±5℃，光照強度為2000-3000lx，每天光照時間9-12h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用；

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養12-18天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。

優化的，所述播種比常規大蒜播種提前10-15天。

更優化的，所述誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.03-0.2mg/L、茉莉酸0.04-0.1mg/L、根皮苷0.3-0.9mg/L、活性炭1.5-4g/L、番茄汁8-15g/L、復合維生素0.1-0.5mg/L。

進一步優化的，所述增殖培養基為以B5或MS為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.2-1.5mg/L、NAA 0.3-0.5mg/L。

更進一步優化的，所述氣生鱗莖尖直徑大小為0.5-1.0mm。

再更進一步優化的，所述氣生鱗莖尖帶1-3個葉原基。

再更進一步優化的，步驟c遮光培養車間的空氣濕度60-90％。

綜上所述，由于采用了上述技術方案，本發明的有益效果是：

1.本發明在進行組培前，先進行將玉林香蒜進行培育氣生鱗莖，然后再將氣生鱗莖進行脫毒預處理，可以有效的提高大蒜種性，防止大蒜退化，從而更適合取樣進行組織培養。選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣，播種期較一般生產田種植大蒜提前10-15天，適當稀植，種植密度較普通種植減少20-30％，施足底肥和做好田間管理。當蒜薹伸出葉鞘，總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，使營養更多地集中到氣生鱗莖中。在大蒜生長后期不采收蒜薹，延遲蒜頭收獲期15～20天，待蒜薹變黃，氣生鱗莖發育成熟時采收。通過提前種植、延遲收獲，可有效延長氣生鱗莖中的營養積累，可提高組織過程中的成功率10％以上。

經實驗研究證明，經過本發明處理后的玉林香蒜組培苗，在選定的試驗田按常規種植管理技術進行對比試種試驗。結果本發明處理后的蒜種種植后蒜苗畝產量達到3370公斤，未經本發明處理的蒜種蒜苗畝產量2800公斤，畝增產570公斤，畝產量提高20.36％；本發明處理后的蒜種蒜頭畝產量達到840公斤，未經本發明處理的蒜種蒜頭畝產量700公斤，畝增產140公斤，畝產量提高20％。

2.本發明中在進行大蒜組織培養時，選擇氣生鱗莖尖直徑大小為0.5-1.0mm，氣生鱗莖尖帶1-3個葉原基且以1-2個為最佳。通過對比研究了外植體莖尖的大小、帶葉原基的多少、對芽誘導與增殖的影響效果。試驗結果表明，切取不同大小的莖尖在同等條件下培養，結果表明，以0.1mm不帶葉原基的莖尖進行培養，大部分莖尖褐變成干枯死亡；以1.0mm帶有2-3個葉原基的莖尖進行培養，莖尖萌動早、長勢快、成活率最高；以0.5-1.0mm大小、帶1-2個葉原基的莖尖進行培養，較為適宜。

3.大蒜培苗培育過程中誘導培養基和增殖培養基對大蒜離體組織的分裂誘導、后期增殖的影響很大。本發明前期選擇MS培養基或B5培養基為基礎培養基，可以具有維持離休植物細胞基本生命所需要的大部分營養成分，以此做為大蒜組培過程中的培養基是不夠的。本發明通過添加適合大蒜生長具有促進作用的各種活性成分，補充基礎營養中大蒜組培所需營養成分，均衡營養；利用各物質間相互作用，為大蒜的組織培養過程提供適宜的專用培養基。對比研究中發現，以B5為基本培養基最好，附加不同濃度6-BA、NAA和其他活性成分，能有效針對玉林香蒜植物特性制備，能夠有效提高大蒜出芽莖尖數和芽誘導率，組培苗根系發達。在后期增殖過程中，玉林香蒜所需要成分發生變化，如果繼續以誘導培養基繼續增殖不利于組培苗的進一步生長，故本發明針對玉林香蒜組培過程中特定階段調配了玉林香蒜專用的增殖培養基，以以B5或MS為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.2-1.5mg/L、NAA 0.3-0.5mg/L。經本發明組培出來的玉林香蒜苗具有莖粗壯，生命力頑強，適應能力強等特點。

4.本發明誘導培養基中添加了蕓苔素內酯，具有用量少，可抑制生長素氧化酶的活性，提高植物內源生長素的含量，從而顯著促進大蒜的伸長生長。蕓苔素內酯與培養基中的生長素如NAA及其他活性成分如茉莉酸等，活性相互之間具有促進作用，共同促進大蒜組織中組織或組培苗的生長。本發明中還添加有茉莉酸可以有效促進大蒜組織細胞的分裂、分化，與6-BA一起共同促進大蒜組織細胞分裂。添加茉莉酸后可顯著促進大蒜根系變多和生長，能夠激發防御植物基因的表達，誘導植物的化學防御，使大蒜組培苗今后種植過程中適應能力增強，移栽成活性高。

5.本發明誘導培養基中添加一定濃度的活性炭，可以有效減少大蒜組織和培養基變色，有效吸附培養基中的有害物質和培養基中雜質，對組織培養過程中產生的有害代謝產物也可以起到吸附的作用，從面減少大蒜組培過程中的成活率。本發明中的根皮苷可以在培養基酸性環境下，可以有效的抑制培養基內有害微生物的活動，延長培養基變質，與活性炭共同作用，有效的保持培養基穩定，處于適合大蒜生長的環境狀態下。本發明培養基與基礎培養基相比，變色時間可延遲培養基5-8天。

6.本發明組培方法過程純大部分在全自然采光組培車間，克服了傳統組培育苗必須使用日光燈作為植物生長光源的問題，減少了日光燈具購置費、電費等生產成本，大蒜組培種苗植株健壯、適應能力強、移栽成活率高，種苗質量顯著提高。

【具體實施方式】

下面結合實施例對本發明作進一步說明。

實施例1

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，播種比常規大蒜播種提前10天，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期15天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.5cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在5-10℃環境下，備用。

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒1次，接著放入質量濃度為0.07％的氯化汞溶液中浸泡12min后取出，再用無菌水沖洗3次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為0.1mm且帶1個葉原基的氣生鱗莖尖，備用。

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養9天，遮光培養車間的空氣濕度為60％。然后移入溫度為25±1℃，光照強度為2000x，每天光照時間12h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用。

其中，誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.03mg/L、茉莉酸0.04mg/L、根皮苷0.3mg/L、活性炭1.5g/L、番茄汁8g/L、復合維生素0.1mg/L。

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養12天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。其中，增殖培養基為以B5基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.2mg/L、NAA 0.3mg/L。

實施例2

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，播種比常規大蒜播種提前15天，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期20天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.4cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在6-10℃環境下，備用。

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒3次，接著放入質量濃度為0.15％的氯化汞溶液中浸泡18min后取出，再用無菌水沖洗6次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為1.5mm且帶3個葉原基的氣生鱗莖尖，備用。

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養14天，遮光培養車間的空氣濕度為90％。然后移入溫度為25±5℃，光照強度為3000lx，每天光照時間9h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用。

其中，誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.2mg/L、茉莉酸0.1mg/L、根皮苷0.9mg/L、活性炭4g/L、番茄汁15g/L、復合維生素0.5mg/L。

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養18天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。其中，增殖培養基為以MS為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L。

實施例3

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，播種比常規大蒜播種提前11天，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期16天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.5cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在6-9℃環境下，備用。

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒1-3次，接著放入質量濃度為0.11％的氯化汞溶液中浸泡15min后取出，再用無菌水沖洗5次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為0.7mm且帶2個葉原基的氣生鱗莖尖，備用。

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養12天，遮光培養車間的空氣濕度為75％。然后移入溫度為25±2℃，光照強度為2500lx，每天光照時間11.5h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用。

其中，誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.11mg/L、茉莉酸0.07mg/L、根皮苷0.6mg/L、活性炭2.7g/L、番茄汁11.5g/L、復合維生素0.3mg/L。

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養15天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。其中，增殖培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.35mg/L、NAA 0.4mg/L。

實施例4

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，播種比常規大蒜播種提前12天，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期17天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.3cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在5-10℃環境下，備用。

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒3次，接著放入質量濃度為0.13％的氯化汞溶液中浸泡16min后取出，再用無菌水沖洗5次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為1.0mm且帶2個葉原基的氣生鱗莖尖，備用。

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養13天，遮光培養車間的空氣濕度為85％。然后移入溫度為25±4℃，光照強度為2800lx，每天光照時間11h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用。

其中，誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.17mg/L、茉莉酸0.08mg/L、根皮苷0.8mg/L、活性炭3.5g/L、番茄汁13g/L、復合維生素0.4mg/L。

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養16天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。其中，增殖培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.4mg/L、NAA 0.45mg/L。

實施例5

一種玉林香蒜的提純復壯方法，包括以下步驟：

a.選擇具有玉林香蒜典型遺傳特性的蒜瓣進行播種，播種比常規大蒜播種提前13天，當蒜薹伸出葉鞘、總苞彭大后，將總苞撕破并摘除小花，玉林香蒜生長后期不采收蒜薹，延遲玉林香蒜收獲期18天，待所述蒜薹變黃、氣生鱗莖發育成熟時，采收直徑大于0.5cm的氣生鱗莖，最后將所述氣生鱗莖貯藏在5-8℃環境下，備用。

b.取步驟a中所述氣生鱗莖，先去外皮后用水沖洗干凈，再用酒精進行表面清毒2次，接著放入質量濃度為0.09％的氯化汞溶液中浸泡14min后取出，再用無菌水沖洗4次，最后將氣生鱗莖于超凈工作臺解剖鏡下剝去肉質鱗片，取出直徑大小為0.5mm且帶1個葉原基的氣生鱗莖尖，備用。

c.取步驟b中所述氣生鱗莖尖，接種到誘導培養基中，先置于遮光培養車間進行暗培養11天，遮光培養車間的空氣濕度為70％。然后移入溫度為25±3℃，光照強度為2300lx，每天光照時間10h的全自然采光組培車間中，繼續培養至氣生鱗莖尖長出綠色幼芽，得無根組培芽，備用。

其中，誘導培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：蕓苔素內酯0.06mg/L、茉莉酸0.05mg/L、根皮苷0.5mg/L、活性炭2.5g/L、番茄汁10g/L、復合維生素0.2mg/L。

d.取步驟c中所述無根組培芽移入至增殖培養基中，培養14天，組培芽長出細根后，即得大蒜脫毒組培苗。其中，增殖培養基為以B5為基礎培養基計，添加以下質量-體積濃度的活性成分：6-BA 1.3mg/L、NAA 0.35mg/L。

上述說明是針對本發明較佳可行實施例的詳細說明，但實施例并非用以限定本發明的專利申請范圍，凡本發明所提示的技術精神下所完成的同等變化或修飾變更，均應屬于本發明所涵蓋專利范圍。