本發(fā)明屬于植物無性繁殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及樟樹組織培養(yǎng)技術(shù)，尤其是涉及一種桉葉油素型油樟樹芽器官組培繁殖方法。
背景技術(shù)：
桉葉油（cineole,C10H18O）素型油樟是樟科樟樹屬樟樹類的一種化學(xué)型樟樹（Cinnamomum camphora (L.)Presl）又名香樟，為國家Ⅱ級(jí)保護(hù)植物，主要分布于國內(nèi)的江西、湖南、廣東、福建、海南、廣西、四川、臺(tái)灣等地，國外的越南、韓國及日本也有分布。生長于丘陵及低山地帶。是一種集材用、油用、風(fēng)景園林等于一體的多用途優(yōu)良樹種。桉葉油素為無色透明具揮發(fā)性油狀液體，具有樟腦氣息和辛辣涼味，主要存在于桉樹和油樟等芳香植物的揮發(fā)油中，已廣泛用于香料、食品、醫(yī)藥、化工和國防等各領(lǐng)域。油樟揮發(fā)油中的桉葉油素含量達(dá)585.5g/kg，比從桉樹枝葉中提取的桉葉油素香氣更純郁，被稱為“中國桉葉油”，已暢銷日本、德國、法國、美國等50多個(gè)國家和地區(qū)，其綠色原生態(tài)天然香料更是+分緊俏，價(jià)格一路盤升，市場(chǎng)發(fā)展前景看好。桉葉油素從樟樹枝葉、樹干中提取,并且含量低，需大量伐樹，一方面破壞了生態(tài)環(huán)境，另一方面使資源不斷匱乏，不符合國家對(duì)自然資源永續(xù)利的要求。開發(fā)留主干，砍伐油樟樹枝葉提取桉葉油素的方法，既可避免掠奪式利用桉葉油素原料資源，又有利于林地水土保持，培育樟樹珍貴大徑材，資源最大化的利用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)桉葉油素型油樟組織培養(yǎng)過程中初代芽褐化或玻璃化嚴(yán)重至死，芽增殖系數(shù)低，生長緩慢等問題,提供一種生長效果好、繼代芽擴(kuò)繁快的桉葉油素型油樟芽器官組培芽繁殖方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種桉葉油素型油樟芽器官組培芽繁殖方法，包括外植體選擇、外植體處理、初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)和壯芽培養(yǎng)，采集桉葉油素型油樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體，對(duì)外植體進(jìn)行修剪、滅菌消毒處理后接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中獲取初代芽，再將初代芽接種于增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過5-6個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，形成大量高≥2cm健壯的單芽，具體操作步驟如下：
（1）外植體選擇：
在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體；
（2）外植體處理：
將外植體置于自來水下沖洗10-15 min，然后去除外植體葉片，將外植體置于體積濃度0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡10-15min后，用純凈水沖洗外植體4-5次，然后在體積濃度0.1%代森鋅藍(lán)粉溶液中浸泡15-20min，用純凈水沖洗外植體4-5次后，裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)；在無菌條件下，用體積濃度0.15 % HgCl2+30 mg/L VC的混合溶液對(duì)外植體浸泡15-20min進(jìn)行滅菌消毒，最后用無菌水沖洗干凈外植體后，置于無菌濾紙上吸干水，備用；
（3）初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：
將步驟（2）得到的外植體接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：首先將接種好的外植體置于4-8 ℃的低溫環(huán)境,暗培養(yǎng)8-10 d，再轉(zhuǎn)入溫度22-25 ℃,光照強(qiáng)度1000-2000 lux,光照10-12 h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)40-50 d，初代芽萌發(fā)、生長；
（4）增殖培養(yǎng)：
將高≥1cm的初代芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)方法為：將接種好的初代芽置于溫度25-28℃，光照強(qiáng)度1000-3000 lux，光照12-14 h/d的條件下培養(yǎng)，25-30 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)5-6個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽；
（5）壯芽培養(yǎng)：
將步驟（4）得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，置于溫度25-28 ℃，光照強(qiáng)度4000-7000 lux，光照12-14 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，獲得大量壯芽。
以上步驟（1）所述的桉葉油素型油樟樹的選擇方法是：在林分、綠化帶或零星分布的樟樹中，選擇干型通直圓滿、樹冠枝葉茂盛、生長快、葉片鼻聞?wù)廖稘夂竦膯沃辏善鋯沃耆~片回室內(nèi)進(jìn)行桉葉油素定量定性分析，葉片葉油得率1.5%以上，桉葉油素含量70 %以上的植株確定為桉葉油素型油樟外植體采集株。
以上所述的初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.0-1.5mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L。
以上所述的增殖培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 3.0-5.0 mg/L+NAA 1.5-2.0 mg/L+ZT 0.1-0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述的壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.0 mg/L+NAA 0.5-1.0 mg/L+VC 10 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮30mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。
以上所述的改良LS培養(yǎng)基的配方為：NH4NO3 1650 mg/L+KNO3 1900mg/L+CaCl2·2H2O 400mg/L+MgSO4.·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 170 mg/L+H3BO3 6.2 mg/L+MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L+ZnSO4·4H2O 8.6 mg/L+KI0.83mg/L+Na2MoO4·H2O 0.25 mg/L+CuSO4.·5H2O 0.025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.0 mg/L+肌醇 100 mg/L+煙酸 0.5 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L。
相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果如下：
1、本發(fā)明是在樟樹林中選出干型圓滿通直，樹冠枝葉茂盛，生長迅速，枝葉定量定性分析出油率≥1.5%，葉油中桉葉油素含量等指標(biāo)符合GB 1886.33-2015要求的樟樹單株作為優(yōu)良單株，選取優(yōu)良單株當(dāng)年生嫩枝為組培繁殖材料，建立一種桉葉油素型油樟莖段組培方法；本方法對(duì)加快桉葉油素型油樟樹優(yōu)質(zhì)壯苗的生產(chǎn)，促進(jìn)國家工藝用材和定向香原料林產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，調(diào)整林業(yè)品種結(jié)構(gòu)，改善大面積桉樹無性系林造成的脆弱森林生態(tài)系統(tǒng)均具有重要意義。
2、本發(fā)明以桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯的當(dāng)年生嫩枝作為外植體，經(jīng)過初代芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，初始芽萌動(dòng)率80-85%；經(jīng)過5-6個(gè)周期增殖培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)4/30d-6/30d，再將叢生芽接入壯芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)30-35 d，每個(gè)500ml三角燒瓶形成≥2cm的單芽20-30株，有效芽的出苗量大。
3、本發(fā)明對(duì)LS基本培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，添加酚類物質(zhì)的專一性吸附劑聚乙烯吡咯烷酮（PVP），迅速有效的抑制桉葉油素型油樟組培芽的褐死，同時(shí)加入促進(jìn)芽生長并且粗壯的氨基酸和維生素，使得培養(yǎng)基的營養(yǎng)更加全面，更有效的促使桉葉油素型油樟芽誘導(dǎo)的發(fā)生、增殖和壯芽，實(shí)現(xiàn)大量增殖，規(guī)模化生產(chǎn)壯芽，實(shí)現(xiàn)桉葉油素型油樟樹的組培芽不斷的重復(fù)擴(kuò)繁。
4、本發(fā)明操作過程簡(jiǎn)便，增殖系數(shù)4/30d-6/30d，培養(yǎng)周期短，繼代芽產(chǎn)量大,并且質(zhì)量優(yōu)，增殖系數(shù)達(dá)到4以上的組培苗產(chǎn)業(yè)化技術(shù)要求，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1：
在林分、綠化帶或零星分布的樟樹中，選擇干型通直圓滿、樹冠枝葉茂盛、生長快、葉片鼻聞?wù)廖稘夂竦膯沃辏善鋯沃耆~片回室內(nèi)進(jìn)行桉葉油素定量定性分析，葉片葉油得率1.5%以上，桉葉油素含量70 %以上的植株確定為桉葉油素型油樟外植體采集株。在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。
將外植體置于自來水下沖洗10min，然后去除外植體葉片，將外植體置于體積濃度0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡10min后，用純凈水沖洗外植體4-5次，然后在體積濃度0.1%代森鋅藍(lán)粉溶液中浸泡15min，用純凈水沖洗外植體4-5次后，裁成帶至少1個(gè)腋芽，1.5-2.0cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)；在無菌條件下，用體積濃度0.15 % HgCl2+30 mg/L VC的混合溶液對(duì)外植體浸泡15min進(jìn)行滅菌消毒，最后用無菌水沖洗干凈外植體后，置于無菌濾紙上吸干水。
將消毒滅菌后的外植體接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.0mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L。初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：首先將接種好的外植體置于4-6 ℃的低溫環(huán)境,暗培養(yǎng)8 d，再轉(zhuǎn)入溫度22-23 ℃,光照強(qiáng)度1000 lux,光照12 h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d，初代芽萌發(fā)、生長，初始芽萌動(dòng)率80%。
將高≥1cm的初代芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 3.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+ZT 0.1 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。增殖培養(yǎng)方法為：將接種好的初代芽置于溫度25-26℃，光照強(qiáng)度1000 lux，光照14 h/d的條件下培養(yǎng)，25 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)5-6個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)4/30d。
將經(jīng)增殖培養(yǎng)得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 1.5-2.0 mg/L+NAA 0.5-1.0 mg/L+VC 10 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮30mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。置于溫度25-28 ℃，光照強(qiáng)度4000-7000 lux，光照12-14 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)30-35 d，每個(gè)500ml三角燒瓶形成≥2cm的單芽20-30株，有效芽的出苗量大。將經(jīng)壯芽培養(yǎng)后得到的高≥2cm的單芽插入常規(guī)的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)壯芽培養(yǎng)，循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的改良LS培養(yǎng)基的配方為：NH4NO3 1650 mg/L+KNO3 1900mg/L+CaCl2·2H2O 400mg/L+MgSO4.·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 170 mg/L+H3BO3 6.2 mg/L+MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L+ZnSO4·4H2O 8.6 mg/L+KI0.83mg/L+Na2MoO4·H2O 0.25 mg/L+CuSO4.·5H2O 0.025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.0 mg/L+肌醇 100 mg/L+煙酸 0.5 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L。
實(shí)施例2：
在林分、綠化帶或零星分布的樟樹中，選擇干型通直圓滿、樹冠枝葉茂盛、生長快、葉片鼻聞?wù)廖稘夂竦膯沃辏善鋯沃耆~片回室內(nèi)進(jìn)行桉葉油素定量定性分析，葉片葉油得率1.5%以上，桉葉油素含量70 %以上的植株確定為桉葉油素型油樟外植體采集株。在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。
將外植體置于自來水下沖洗10min，然后去除外植體葉片，將外植體置于體積濃度0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡10min后，用純凈水沖洗外植體4-5次，然后在體積濃度0.1%代森鋅藍(lán)粉溶液中浸泡15min，用純凈水沖洗外植體4-5次后，裁成帶至少1個(gè)腋芽，2.0cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)；在無菌條件下，用體積濃度0.15 % HgCl2+30 mg/L VC的混合溶液對(duì)外植體浸泡15min進(jìn)行滅菌消毒，最后用無菌水沖洗干凈外植體后，置于無菌濾紙上吸干水。
將消毒滅菌后的外植體接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 7.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L。初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：首先將接種好的外植體置于5-6 ℃的低溫環(huán)境,暗培養(yǎng)8 d，再轉(zhuǎn)入溫度22-23 ℃,光照強(qiáng)度1000 lux,光照12 h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)40 d，初代芽萌發(fā)、生長，初始芽萌動(dòng)率80%。
將高≥1cm的初代芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 3.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+ZT 0.2 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。增殖培養(yǎng)方法為：將接種好的初代芽置于溫度25-26℃，光照強(qiáng)度2000 lux，光照13 h/d的條件下培養(yǎng)，25 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)5-6個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)5/30d。
將經(jīng)增殖培養(yǎng)得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 10 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮30mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。置于溫度25-26 ℃，光照強(qiáng)度5000 lux，光照13 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)30d，每個(gè)500ml三角燒瓶形成≥2cm的單芽20-30株，有效芽的出苗量大。將經(jīng)壯芽培養(yǎng)后得到的高≥2cm的單芽插入常規(guī)的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)壯芽培養(yǎng)，循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的改良LS培養(yǎng)基的配方為：NH4NO3 1650 mg/L+KNO3 1900mg/L+CaCl2·2H2O 400mg/L+MgSO4.·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 170 mg/L+H3BO3 6.2 mg/L+MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L+ZnSO4·4H2O 8.6 mg/L+KI0.83mg/L+Na2MoO4·H2O 0.25 mg/L+CuSO4.·5H2O 0.025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.0 mg/L+肌醇 100 mg/L+煙酸 0.5 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L。
實(shí)施例3：
在林分、綠化帶或零星分布的樟樹中，選擇干型通直圓滿、樹冠枝葉茂盛、生長快、葉片鼻聞?wù)廖稘夂竦膯沃辏善鋯沃耆~片回室內(nèi)進(jìn)行桉葉油素定量定性分析，葉片葉油得率1.5%以上，桉葉油素含量70 %以上的植株確定為桉葉油素型油樟外植體采集株。在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。
將外植體置于自來水下沖洗15min，然后去除外植體葉片，將外植體置于體積濃度0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡15min后，用純凈水沖洗外植體4-5次，然后在體積濃度0.1%代森鋅藍(lán)粉溶液中浸泡20min，用純凈水沖洗外植體4-5次后，裁成帶至少1個(gè)腋芽，2.0-2.5cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)；在無菌條件下，用體積濃度0.15 % HgCl2+30 mg/L VC的混合溶液對(duì)外植體浸泡20min進(jìn)行滅菌消毒，最后用無菌水沖洗干凈外植體后，置于無菌濾紙上吸干水。
將消毒滅菌后的外植體接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 7.5 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L。初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：首先將接種好的外植體置于6-7 ℃的低溫環(huán)境,暗培養(yǎng)9 d，再轉(zhuǎn)入溫度23-24 ℃,光照強(qiáng)度1000 lux,光照12 h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d，初代芽萌發(fā)、生長，初始芽萌動(dòng)率85%。
將高≥1cm的初代芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.3 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。增殖培養(yǎng)方法為：將接種好的初代芽置于溫度26-27℃，光照強(qiáng)度2000 lux，光照14 h/d的條件下培養(yǎng)，30 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)5-6個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)6/30d。
將經(jīng)增殖培養(yǎng)得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+VC 10 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮30mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。置于溫度26-27 ℃，光照強(qiáng)度6000 lux，光照12 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)30d，每個(gè)500ml三角燒瓶形成≥2cm的單芽20-30株，有效芽的出苗量大。將經(jīng)壯芽培養(yǎng)后得到的高≥2cm的單芽插入常規(guī)的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)壯芽培養(yǎng)，循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的改良LS培養(yǎng)基的配方為：NH4NO3 1650 mg/L+KNO3 1900mg/L+CaCl2·2H2O 400mg/L+MgSO4.·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 170 mg/L+H3BO3 6.2 mg/L+MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L+ZnSO4·4H2O 8.6 mg/L+KI0.83mg/L+Na2MoO4·H2O 0.25 mg/L+CuSO4.·5H2O 0.025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.0 mg/L+肌醇 100 mg/L+煙酸 0.5 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L。
實(shí)施例4：
在林分、綠化帶或零星分布的樟樹中，選擇干型通直圓滿、樹冠枝葉茂盛、生長快、葉片鼻聞?wù)廖稘夂竦膯沃辏善鋯沃耆~片回室內(nèi)進(jìn)行桉葉油素定量定性分析，葉片葉油得率1.5%以上，桉葉油素含量70 %以上的植株確定為桉葉油素型油樟外植體采集株。在至少連續(xù)3天晴朗的氣候里，采集桉葉油素型樟樹的樹冠外圍生長健壯、無病蟲危害的當(dāng)年生嫩枝作為外植體。
將外植體置于自來水下沖洗15min，然后去除外植體葉片，將外植體置于體積濃度0.2%次氯酸鈉溶液中浸泡15min后，用純凈水沖洗外植體4-5次，然后在體積濃度0.1%代森鋅藍(lán)粉溶液中浸泡20min，用純凈水沖洗外植體4-5次后，裁成帶至少1個(gè)腋芽，2.5-3cm長的莖段，視莖段木質(zhì)化程度分類置放容器內(nèi)；在無菌條件下，用體積濃度0.15 % HgCl2+30 mg/L VC的混合溶液對(duì)外植體浸泡20min進(jìn)行滅菌消毒，最后用無菌水沖洗干凈外植體后，置于無菌濾紙上吸干水。
將消毒滅菌后的外植體接種于初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT2.0 mg/L+ZT 1.5mg/L+ VC 15 mg/L +L-半胱氨酸20mg/L +聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+VB2 15 mg/+瓊脂粉3.6 g/L+蔗糖20 g/L。初代芽誘導(dǎo)培養(yǎng)方法為：首先將接種好的外植體置于7-8 ℃的低溫環(huán)境,暗培養(yǎng)8 d，再轉(zhuǎn)入溫度24-25 ℃,光照強(qiáng)度2000 lux,光照10 h/d的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d，初代芽萌發(fā)、生長，初始芽萌動(dòng)率82%。
將高≥1cm的初代芽接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 5.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮50mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。增殖培養(yǎng)方法為：將接種好的初代芽置于溫度27-28℃，光照強(qiáng)度3000 lux，光照12 h/d的條件下培養(yǎng)，30 d轉(zhuǎn)接一次，循環(huán)往復(fù)，經(jīng)5-6個(gè)周期的培養(yǎng)，形成叢生芽，芽增殖系數(shù)4/30d。
將經(jīng)增殖培養(yǎng)得到的叢生芽進(jìn)行切割，4-5顆芽/叢，插入壯芽培養(yǎng)基中，壯芽培養(yǎng)基的配方為：改良LS培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 10 mg/L+VB2 20 mg+L-半胱氨酸 10 mg/L+聚乙烯吡咯烷酮30mg/L+瓊脂粉 3.6 g/L+蔗糖 30 g/L。置于溫度27-28 ℃，光照強(qiáng)度7000 lux，光照12 h/d的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d，每個(gè)500ml三角燒瓶形成≥2cm的單芽20-30株，有效芽的出苗量大。將經(jīng)壯芽培養(yǎng)后得到的高≥2cm的單芽插入常規(guī)的生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；余下小芽叢再次接種于增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，然后再重復(fù)壯芽培養(yǎng)，循環(huán)往復(fù)，獲得大量壯芽。
以上所述的改良LS培養(yǎng)基的配方為：NH4NO3 1650 mg/L+KNO3 1900mg/L+CaCl2·2H2O 400mg/L+MgSO4.·7H2O 370 mg/L+KH2PO4 170 mg/L+H3BO3 6.2 mg/L+MnSO4.·4H2O 22.3 mg/L+ZnSO4·4H2O 8.6 mg/L+KI0.83mg/L+Na2MoO4·H2O 0.25 mg/L+CuSO4.·5H2O 0.025 mg/L+CoCl2·6H2O 0.025 mg/L+FeSO4 27.8 mg/L+NaEDTA 37.0 mg/L+肌醇 100 mg/L+煙酸 0.5 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L+甘氨酸 2 mg/L+鹽酸吡哆醇0 .5 mg/L。