本發(fā)明涉及微生物定殖技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

寄生在昆蟲、蜘蛛等幼蟲或成蟲上的真菌，稱為蟲生真菌(entomogenous fungi或entomopathogenic fungi)蟲生真菌在保護(hù)植物免受病蟲害侵?jǐn)_方面扮演著重要的角色，是近三十年來在國內(nèi)外迅速受到關(guān)注的微生物類群。蟲生真菌的植物內(nèi)生性已得到眾多研究者的驗(yàn)證，該類菌種可以存在于多種野生植株的組織內(nèi)，如玉米、高粱、番茄、棉花、香蕉、加州山松、可可、罌粟等。此外，也可以通過人工接種的方式將菌種接種到寄主植物當(dāng)中，主要接種方法有土壤灌溉、種子包衣、浸種、胚根敷料(土壤拌種)、根和根莖浸泡、莖部注射、葉面噴施和花朵噴施等，菌株能從接種部位向周圍組織擴(kuò)散并定殖在寄主植物組織中，但根據(jù)接種方法、接種部位及宿主植物不同，菌種定殖效率也存在一定差異。蟲生真菌在植物中定殖對(duì)植物的生長有一定的促進(jìn)作用，主要表現(xiàn)在增加生物量，提高自身抗性等。但有關(guān)蟲生真菌促進(jìn)植物生長的相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少，植物自身生長狀態(tài)的改變勢(shì)必會(huì)帶來植物體內(nèi)相關(guān)防御酶活性的變化，這方面的研究目前未見報(bào)道。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，利用球孢白僵菌孢子懸液浸種法處理玉米種子，使其在玉米中定殖，其方法簡便易行，本方法明確了最佳的浸種時(shí)間，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性，同時(shí)檢測(cè)了該種接種方法對(duì)玉米苗期生長狀態(tài)的影響，并進(jìn)一步研究了玉米抗性相關(guān)防御酶活性的變化情況，對(duì)蟲生真菌促進(jìn)植物生長的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

一種球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，包括：

將玉米種子表面消毒后經(jīng)球孢白僵菌孢子懸液浸種；

所述球孢白僵菌菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC7192；保藏時(shí)間為：2013年01月23日。

本發(fā)明使用的菌株為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物農(nóng)藥課題組分離保存的球孢白僵菌Beauveria bassiana D1-5菌株。該菌株分離自亞洲玉米螟，2008年采集于吉林省德惠市。

本發(fā)明使用的玉米品種為墾粘一號(hào)(KN1)。該品種屬于青食玉米，微甜，口感好，是主要的食用品種，在吉林省種植面積居首位。

本發(fā)明利用球孢白僵菌孢子懸液浸種法處理玉米種子，使其在玉米中定殖，該種方法簡便易行，旨在明確最佳的浸種時(shí)間，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性，同時(shí)監(jiān)測(cè)了該種接種方法對(duì)玉米苗期生長狀態(tài)的影響，并進(jìn)一步研究了玉米抗性相關(guān)防御酶活性的變化情況，對(duì)蟲生真菌促進(jìn)植物生長的機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述表面消毒的方法為：

用65％～75％乙醇溶液浸泡20s～40s，再使用0.8％～1.2％次氯酸鈉溶液浸泡20s～40s，最后用無菌水清洗2～5次。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述球孢白僵菌孢子的濃度為10^8～9個(gè)孢子/mL。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述玉米種子和所述白僵菌孢子懸液的比例為：

每100粒玉米種子浸泡在15～25mL白僵菌孢子懸液中。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述白僵菌孢子懸液的溶劑為0.04％～0.06％的吐溫-80溶液。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述浸種的條件為：26℃～30℃，60r/min～100r/min浸種10h～14h。

浸種時(shí)間會(huì)對(duì)苗期幾種防御酶活性產(chǎn)生影響，是關(guān)鍵的參數(shù)之一。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，將玉米種子表面消毒后經(jīng)球孢白僵菌孢子懸液浸種后還包括：

將種子鋪于無菌濾紙上，吹干備用。

優(yōu)選的，如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，所述玉米的品種為墾粘一號(hào)。

如上所述的球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法在提高玉米幼苗品質(zhì)以及防治玉米害蟲中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，如上所述的應(yīng)用，所述玉米害蟲包括玉米螟、松毛蟲、小蔗螟、盲椿、谷象、柑桔紅蜘蛛和蚜蟲中的一種或多種。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

本發(fā)明提供的定殖方法簡便易行，明確了最佳的浸種時(shí)間，以及球孢白僵菌在玉米苗期的定殖偏好性；蟲生真菌在植物體內(nèi)定殖可以使植物的抗性增強(qiáng)，一方面可以減緩病原菌對(duì)植物的危害程度，另一方面可以通過對(duì)植食性昆蟲的間接調(diào)控保護(hù)植物免受害蟲侵?jǐn)_。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為浸種時(shí)間對(duì)球孢白僵菌在玉米中定殖偏好性的影響；

圖2為球孢白僵菌浸種對(duì)玉米生理生態(tài)指標(biāo)的影響；

圖3為球孢白僵菌浸種對(duì)玉米葉片抗性相關(guān)酶活力的影響。

本發(fā)明所采用的球孢白僵菌(Beativeria bassiana)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間為：2013年01月23日，保藏編號(hào)CGMCC7192。經(jīng)保藏中心于2013年01月23日檢測(cè)為存活菌株。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供了一種球孢白僵菌在玉米苗期的定殖方法，包括：

本發(fā)明采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，盆栽控制實(shí)驗(yàn)。浸種時(shí)間和球孢白僵菌處理分別設(shè)置2個(gè)水平。實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理8株玉米，10個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)處理分別為吐溫-80浸種12h(T80-12h)，球孢白僵菌孢子懸液浸種12h(Bb-12h)，吐溫-80浸種24h(T80-24h)，球孢白僵菌孢子懸液浸種24h(Bb-24h)。

選取顆粒大小均一的玉米種子，將種子表面消毒(首先用70％乙醇溶液浸泡30s，其次使用1％次氯酸鈉溶液浸泡30s，最后用無菌水清洗3次)，每100粒(約23g)玉米種子浸泡在20mL球孢白僵菌孢子懸液(使用0.05％吐溫-80溶液，將球孢白僵菌孢子粉懸浮，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)懸浮液中孢子數(shù)，孢子懸液濃度為10⁸個(gè)孢子/mL)或0.05％吐溫-80溶液中，28℃，80r/min浸種。隨后將種子鋪于無菌濾紙上，吹干30min，備用。播種花盆規(guī)格為，直徑20cm×高14.5cm，土壤選用丹麥進(jìn)口泥炭土，每盆裝土2kg，2株苗/盆(1株取樣，1株測(cè)生物量)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供了對(duì)實(shí)施例1效果的檢測(cè)方法及結(jié)果。

一、實(shí)驗(yàn)方法

1.球孢白僵菌定殖偏好性調(diào)查

取樣時(shí)期為3次，分別為實(shí)施例1玉米出苗14d，21d，28d，每個(gè)時(shí)期各處理取幼苗10株，每株苗取根、莖、葉各9塊，根莖長度為1cm，葉片面積1cm2。定殖率檢測(cè)采用PDA檢測(cè)法，樣材料表面消毒(實(shí)施例1中種子消毒方法)，每種組織擺放在一個(gè)PDA選擇培養(yǎng)皿中(每個(gè)平板9塊樣品)，28℃，培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)。7d后每天觀察并記錄植物組織上菌體生長情況，定殖率＝植物組織出現(xiàn)菌落的平皿數(shù)量/平皿總數(shù)×100，取3次檢測(cè)結(jié)果的平均值。

2.玉米生理生態(tài)指標(biāo)調(diào)查

2.1種子發(fā)芽率

每個(gè)培養(yǎng)皿中均勻擺放50粒種子，種子表面鋪1張濾紙，每個(gè)處理(T80-12h、Bb-12h、T80-24h和Bb-24h)4次重復(fù)。將培養(yǎng)皿放在溫室中，每天加水10mL，芽長達(dá)到2mm視為出芽，每天觀察并記錄發(fā)芽種子數(shù)目，共歷時(shí)5d，計(jì)算種子發(fā)芽率。

2.2幼苗生長勢(shì)

玉米株高測(cè)量時(shí)期為5次(每次測(cè)量10株)，分別為玉米出苗7d，11d，15d，19d，23d，即葉片拉直頂點(diǎn)至土壤表面的長度。

2.3葉面積

測(cè)量時(shí)期為4次(每次測(cè)量10株)，分別為玉米出苗7d，14d，21d，28d，參考Ruget等[14]的方法，統(tǒng)計(jì)每株植物的葉片面積總和，測(cè)量葉片長、寬。葉面積＝k×長×寬，k＝0.75。

2.4生物量

取樣時(shí)期為4次(每次測(cè)量10株)，分別為玉米出苗7d，14d，21d，28d，取植物組織的地上部分，稱取鮮重，植物材料置于65℃，烘干72h，稱取干重。

2.5玉米葉片抗性相關(guān)酶活力測(cè)定

取樣時(shí)期為出苗14d，取樣部位為完全展開的第3片葉片，每處理取10株，每2株樣品混合(測(cè)量時(shí)5次重復(fù))，樣品材料迅速放入-80℃冰箱保存。5種酶活力測(cè)定均采用比色法，其中苯丙氨酸解氨酶(PAL)及多酚氧化酶(PPO)活力測(cè)定參照張志良等[15]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及過氧化物酶(POD)活力測(cè)定使用南京建成試劑盒。

3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

首先采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)及方差齊性檢測(cè)，并通過Duncan氏方法進(jìn)行多重比較及顯著性分析，利用Sigmaplot 12.5軟件畫圖。

二、結(jié)果與分析

1.球孢白僵菌定殖偏好性

T80-12h和T80-24h處理組中玉米幼苗各部位均未檢測(cè)到球孢白僵菌，Bb-12h和Bb-24h處理組中玉米根部未檢測(cè)到球孢白僵菌(數(shù)據(jù)未顯示)。Bb-12h和Bb-24h處理組中浸種時(shí)間(12h和24h)對(duì)球孢白僵菌在玉米中定殖率的影響差異不顯著(P＝2.909，F(xiàn)＝0.126)，球孢白僵菌在玉米不同組織部位(葉和莖)中定殖率差異顯著(P<0.05，F(xiàn)＝8.909)。浸種12h葉片中定殖檢測(cè)率最高，達(dá)到40％，莖部平均定殖檢測(cè)率為10％，浸種24h葉片中定殖檢測(cè)率為20％，莖部平均定殖檢測(cè)率為3.33％(圖1)。調(diào)查結(jié)果表明，球孢白僵菌在玉米組織中定殖具有一定的偏好性，葉片＞莖部＞根部，最佳檢測(cè)部位為植物葉片，玉米幼苗根部未檢測(cè)出球孢白僵菌，這可能與根系接觸雜菌較多有關(guān)，根部其他共生菌與球孢白僵菌有較強(qiáng)的競(jìng)爭力。

2.玉米生理生態(tài)指標(biāo)

2.1種子發(fā)芽率

由表1可以看出，玉米種子處理后第5天，浸種時(shí)間(12h和24h)對(duì)各處理組之間種子累積發(fā)芽率影響差異不顯著(P＝0.468，F(xiàn)＝0.513)，球孢白僵菌對(duì)各處理組之間種子累積發(fā)芽率影響差異不顯著(P＝0，F(xiàn)＝1)說明球孢白僵菌對(duì)種子萌發(fā)沒有產(chǎn)生影響。但從種子生長狀態(tài)來看，Bb-12h和Bb-24h處理組種子污染率顯著降低，由此推測(cè)，球孢白僵菌浸種有利于玉米植株生長。

表1浸種5天種子累積發(fā)芽率

Table1 Statistical analysis for germinative percentage of seed

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同小字母表示0.05水平上差異顯著。

2.2幼苗生長勢(shì)

苗期株高的測(cè)定結(jié)果表明，不同處理組的株高在各時(shí)期呈現(xiàn)一定的差異。從spss軟件分析結(jié)果來看，浸種時(shí)間對(duì)幼苗的生長并沒有產(chǎn)生顯著影響(P＝0.495，F(xiàn)＝0.487)，而球孢白僵菌處理對(duì)玉米苗期株高影響及顯著(P<0.01，F(xiàn)＝14.887)，其中浸種12h優(yōu)于24h，出苗19d株高增加最多，增長率為5.34％，出苗15d株高增加最少，增長率為2.67％(圖2A)，可見球孢白僵菌浸種對(duì)玉米幼苗生長勢(shì)的效應(yīng)是正向的，對(duì)幼苗株高增加有一定的促進(jìn)作用。

2.3葉面積

從圖2B可以看出，玉米出苗早期，各處理間葉面積無顯著差異，隨著出苗時(shí)間的增加，球孢白僵菌處理組的葉面積有增加趨勢(shì)，出苗21d各處理間差異最為顯著(P<0.01，F(xiàn)＝9.121)，Bb-12h葉面積最大，為256.41cm2，比Bb-24h增加3.44％，比T80-12h增加13.71％。葉面積的增加有利于植物進(jìn)行光合作用及養(yǎng)分運(yùn)輸，對(duì)促進(jìn)苗期植物的生長尤為關(guān)鍵，可見球孢白僵菌對(duì)植物幼苗生長的促進(jìn)作用是多方面的。

2.4生物量

四個(gè)處理組隨出苗時(shí)期的變化，地上鮮生物量逐漸增加，其中球孢白僵菌處理組重量顯著高于對(duì)照組，隨著出苗時(shí)間的增加，球孢白僵菌處理組鮮生物量增長率逐漸加大，Bb-12h高于Bb-24h，出苗28d，達(dá)到11.46g，比Bb-24h增加6.98％，比T80-12h增加27.2％(圖2C；地上干生物量與鮮生物量變化趨勢(shì)基本相同，出苗28d，Bb-12h地上干生物量最大，達(dá)到0.817g，比Bb-24h增加5.56％，比Bb-12h增加27.2％(圖2D)。以上結(jié)果表明球孢白僵菌浸種可以促進(jìn)植株地上生物量的積累，有利于植物儲(chǔ)存養(yǎng)分。

2.5玉米葉片抗性相關(guān)酶活力

圖3結(jié)果表明，浸種時(shí)間對(duì)苗期幾種防御酶活性的影響未呈現(xiàn)一致性規(guī)律，但球孢白僵菌處理中防御酶活性呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。參照活性較高的對(duì)照組計(jì)算酶活性增長率，PPO活性Bb-12h比對(duì)照增加21.64％，Bb-24h比對(duì)照增加15.58％(圖3A)；PAL活性Bb-12h增加12.98％，Bb-24h無變化(圖3B)；CAT活性Bb-12h無變化，Bb-24h增加9.5％(圖3C)；POD活性Bb-12h增加23.04％，Bb-24h無變化(圖3D)；SOD活性Bb-12h增加24.90％，Bb-24h增加16.81％(圖3E)。

從防御酶的應(yīng)激反應(yīng)來看，Bb-12h的活性增長率高于Bb-24h。兩種抗病相關(guān)防御酶(PPO和PAL)中PPO活性增長率高于PAL，抗氧化活性相關(guān)酶(CAT，POD，SOD)中SOD增長率最高。不同的防御酶變化幅度不同，說明其對(duì)球孢白僵菌侵染的應(yīng)激反應(yīng)不同，球孢白僵菌處理對(duì)玉米幼苗生長有一定的誘導(dǎo)抗性，有利于提高幼苗自身抗性。

三、討論

影響球孢白僵菌在植物中定殖的因素有很多，包括接種方法、栽培介質(zhì)、菌種種類等，而接種方法在幾種因素中最為關(guān)鍵，本發(fā)明在玉米苗期定殖規(guī)律研究中使用的浸種法，綜合考慮了玉米播種特點(diǎn)、操作便捷性及推廣應(yīng)用的可行性。本發(fā)明首次優(yōu)化了侵種方法，明確了最佳浸種時(shí)間為12h，最佳檢測(cè)時(shí)期為出苗14d，葉片中定殖檢測(cè)率達(dá)到60％，研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌在植株各部位定殖率不同，葉片和莖部比根部有更高的侵染率，該現(xiàn)象證明內(nèi)生性球孢白僵菌在植株系統(tǒng)中具有流動(dòng)性和一定的生態(tài)適應(yīng)性。發(fā)明人分析由于植株不同部位組成成分的不同，導(dǎo)致了各部位定殖率存在差異，這一點(diǎn)可以在后續(xù)工作中進(jìn)一步驗(yàn)證。

目前有一些研究表明蟲生真菌對(duì)植物的生長有促進(jìn)作用。有報(bào)道通過在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，綠僵菌在土壤中并不是隨機(jī)分布的，而是有選擇性的附著在供試植物的根部，在接種后1-5d，可以顯著觀測(cè)到根毛密度及長度增加，根毛的生長時(shí)期也有所提前；還有研究發(fā)現(xiàn)用分離得到的3個(gè)綠僵菌菌株接種到番茄植株內(nèi)，結(jié)果表明番茄幼苗地上高度，根長以及地上地下生物量干重都有顯著增加。本發(fā)明表明人工接種球孢白僵菌可以促進(jìn)玉米幼苗的生長，宏觀上證明了球孢白僵菌在玉米組織中定殖對(duì)植物生長有著有益的影響，但蟲生真菌作為植物體內(nèi)潛在的生物調(diào)控工具，具體誘導(dǎo)哪些關(guān)鍵因子發(fā)生改變，具體作用機(jī)制仍需要深入研究。

蟲生真菌在植物體內(nèi)定殖可以使植物的抗性增強(qiáng)，一方面可以減緩病原菌對(duì)植物的危害程度，另一方面可以通過對(duì)植食性昆蟲的間接調(diào)控保護(hù)植物免受害蟲侵?jǐn)_。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌能夠顯著提高棉花和西紅柿對(duì)立枯絲核菌和腐霉這兩種真菌病害的抗性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌能夠誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌性葉枯病的系統(tǒng)抗性。還有研究證明了球孢白僵菌在香蕉樹種定殖可以提高香蕉象甲幼蟲的死亡率；之前的研究還發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌在植物中定殖可以延緩蚜蟲和蝗蟲的生長發(fā)育。本發(fā)明初步探索了植物的抗性機(jī)制，發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌在玉米中定殖后，玉米幼苗期幾種關(guān)鍵防御酶的活力增強(qiáng)，這幾種酶參與了植物的水楊酸途徑和茉莉酸途徑，與植物抗性密切相關(guān)。蟲生真菌侵染后，在玉米的整個(gè)生育期防御酶活性呈現(xiàn)怎樣的變化趨勢(shì)，同玉米植株的生長是否存在相關(guān)性，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究為蟲生真菌-植物互作提供了新的證據(jù)，對(duì)二者的互作機(jī)理進(jìn)行了初步探討。在未來的工作中，還需更深層的研究蟲生真菌促進(jìn)植物生長、提高抗性的機(jī)制，關(guān)注蟲生真菌的生態(tài)適應(yīng)性及其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用，明確其生態(tài)學(xué)特性及變化規(guī)律，從而在生產(chǎn)應(yīng)用上更充分的運(yùn)用和提高正向作用，最大限度地發(fā)揮其寄生害蟲、調(diào)節(jié)生態(tài)的潛力。

最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。